专利名称：糖蛋白vi的核酸调节剂的制作方法
技术领域：
本发明一般而言涉及抗血小板药理学系统，所述系统包含与血小板特异性蛋白糖蛋白VI(GPVI)结合并调节其活性的核酸配体。使用抑制所述核酸配体的活性以中和其药理作用并因此恢复GPVI功能的调节剂，这些核酸配体也是活性可逆的。本发明还涉及包含核酸配体和/或调节剂的组合物以及使用这些试剂和组合物治疗血小板介导的疾病和病症的方法。背景血小板是小的无核血细胞，其在正常条件下相当静止，但通过粘附、激活、聚集和血栓形成而立即响应血管损伤。血小板的主要功能是在组织创伤和内皮下基质暴露后阻止血液损失。众所周知的是，血管破坏可将胞外基质组分暴露给血液，尤其是冯维勒布兰德因子(von Willebrand factor，VWF)、胶原、纤连蛋白、血小板反应蛋白和层粘连蛋白。血小板与这些暴露分子之间的相互作用导致血小板细胞的激活。尽管早就知道血小板在止血和血栓形成中具有主要作用，但是也逐渐认识到血小板可能在各种各样的其它病症(例如炎症、肿瘤生长和转移、以及免疫宿主防御)中也起到重要作用。因此，血小板受体蛋白是用于调节血小板功能以作为治疗或预防血小板介导病症的方法的引人关注的靶标。糖蛋白VI(GPVI)是特别引人关注的靶标，因为它是在血小板上特异性表达的跨膜蛋白。具有胞外暴露的细胞特异性分子同时提供对治疗部分的可接近性和最小(如果有的话)有害副作用的潜力，因为表达概况有限。糖蛋白VI (GPVI)是主要的血小板信号转导胶原受体，显示在产生介导血小板激活的胞内信号中起作用(Watson等，Platelets，2000，11 :252-258)。GPVI是Ig超家族的 62-65 kDa糖蛋白，由含有胶原结合结构域的2个Ig C2环组成，其代表潜在的药物靶点。该蛋白在体内被极高度糖基化和唾液酸化，并且在外Ig_C2-样结构域上发现单一糖基化位点。作为免疫球蛋白超家族成员，GPVI与天然杀伤受体有关。其信号转导可间接通过FcR 的Y -链或直接通过GPVI胞质结构域来介导。FcR γ -链含有基于免疫受体酪氨酸的激活模体，并协同非酪氨酸激酶SI和衔接子LAT和LCP2导致磷脂酶C2和相关胞内信号转导途径的激活(Lankhof 等，Thromb Haemost, 1996,75 :950-958)。已经知道GPVI在血块形成相关的生理及临床事件中的重要性并得到GPVI水平与急性冠状动脉综合征(ACQ和中风事件发作的流行病学相关的支持(Bigalke等，American Heart Journal,2008,156 193-200 ；Bigalke 等，European Journal of Neurology, 2009,101 :911-915),以及在GPVI缺陷小鼠中证明的血栓形成抗性的支持(Denis等，Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology，2007，27 :728-739)。此夕卜，Gawaz 等人已经证明放射性标记的GPVI可用于小鼠血管性损害的闪烁成像，因为它与损伤区特异性结合，这表明在这些部位的胶原被暴露(Thromb Haemost.，2005，93 :910-913)。Penz 等人(FASEB J. 2005，19 :898-909)已经证明患有颈动脉狭窄的患者的人粥样斑块含有能够激活血小板的胶原I型和III型结构。此外，对GPVI的阻断或GPVI的不存在能够预防血栓形成，而对α 的阻断则几乎无效。同样，用抗胶原的抗体阻断胶原或用胶原酶降解胶原也可预防血栓形成。新近，已经知道GPVI在血小板功能障碍和异常胶原表达相关病症中起到更广泛作用。这部分地因为以下事实血小板在例如血栓形成的情况下在血管损伤后的粘附中，以及在各种各样的炎性介质和细胞因子的释放中都起作用。此外，在血小板与血管损伤部位反应之后，随后的血小板激活导致细胞因子和其它调节分子的释放。因此，尽管可能看起来血小板异常激活相关病症是多样的，但这些病症都与其对血小板功能的依赖性相关。因此， 抑制或预防血小板激活可提供有价值的治疗效果。血小板介导的病症包括血管病以及高危糖尿病相关的各种病症。已证明由血小板介导的炎性病症包括炎性关节炎疹和硬皮病。早就知道炎症和白细胞活性在炎性关节病中的作用。新近，已经鉴定了发炎关节的滑液中存在血小板(Boilard等，Science，2010，327 580-583)。此外，已经证明在罹患炎性关节炎患者的关节液中的血小板微粒是促炎的，通过 IL-I引发滑液成纤维细胞的细胞因子应答。药理和遗传方法都证明GPVI在关节炎中的这种血小板促炎特性中起到关键作用。已证明与血小板表面上GPVI表达相关的其它病症包括实验性肿瘤转移(Jain等， J. Thromb Haemostasis, 2009, 7 :1713-1717)、糖尿病(Cabeza 等，2004，53 :2117-2121)和丙肝病毒感染(Zahn 等，Diabetes, 2004, 53 :2117-2121)。尽管已经证明GPVI在血小板功能和相关生理疾病中的扩大作用，但发现和开发该受体的拮抗剂的工作仍是有限的。抗血小板疗法的强度及持续时间的活性控制或调节可提供显著临床益处。因此，本领域仍然需要经设计用于特异性靶向GPVI蛋白并调节其功能的调节剂。发明概述本文描述涉及与糖蛋白VI(GPVI)特异性结合的核酸配体的组合物，使用与糖蛋白VI(GPVI)特异性结合的核酸配体及其调节剂的方法和治疗。一方面，提供GPVI配体，其中所述配体包含分离的核酸序列。在另一个实施方案中，至少一个核苷酸是核糖核苷酸。在另一个实施方案中，至少一个核苷酸是脱氧核糖核酸。在再一个实施方案中，分离的核酸序列GPVI配体包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的混合物。在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含二级结构，其包含1、2或3个茎和1、2、3 或4个环。在一个实施方案中，GPVI配体包含二级结构，其中所述二级结构在5’ -3’方向上包含第1茎区、第1环区、第2茎区、第2环区、第3环区、第3茎区和第4环区。在另一个实施方案中，GPVI配体在5’ -3’方向上基本上由第1茎区、第1环区、第2茎区、第2环区、 第3环区、第3茎区和第4环区组成。
在一个实施方案中，将核酸GPVI配体二级结构设计为在5’ -3’方向上的第1茎、 第1环、与第2环和与第3环连接的第2茎、与第3环和与第4环连接的第3茎、和第4环。 在一个实施方案中，第2茎与第1、第2和第3环连接。在一个实施方案中，核酸GPVI配体的第4环包含由UAA组成的第1共有序列。在另一个实施方案中，第4环包含由(G/A)UAA组成的序列。在一个实施方案中，第3茎包含由G-C碱基对后接C-G碱基对组成的序列。在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含GC(G/A)UAAGC。在另一个实施方案中，核酸配体的第3茎和第4环包含GC(G/A)UAAGC。在又一个实施方案中，核酸配体的第3茎和第4环包含选自GCAUAAGC和GCGUAAGC的序列。在一个实施方案中，第3环包含序列YD，其中Y是嘧啶，D不是胞嘧啶。在另一个实施方案中，第3环包含序列YU、YG或YA。在再一个实施方案中，第3环包含序列UU、UG、 UA、⑶、CG或CA。在另一个实施方案中，第3环由序列YD组成。在一个实施方案中，第1环包含序列GAC。在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列的长度为约20个核苷酸(nt)至约50nt,约20nt至约45nt,约20nt至约40nt,约20nt至约35nt,约20nt至约30nt,或约 30nt 至约 35nt0在一个实施方案中，GPVI配体包含选自 SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:14和SEQ IDNO 15的分离的核酸序列。在另一个实施方案中， GPVI配体包含选自SEQ ID NO J8至SEQ ID NO :33的分离的核酸序列。在再一个实施方案中，GPVI 配体包含选自 EF-l-RNA、EF-2-RNA、EF-3-RNA、E2-6-RNA、EF-22-RNA 和 EF-31-RNA 的分离的RNA核酸序列。在另一个实施方案中，GPVI配体包含选自EF-I-修饰的、EF-2-修饰的、EF-3-修饰的、E2-6-修饰的、EF-22-修饰的和EF-31-修饰的分离的RNA核酸序列。 在另一个实施方案中，GPVI配体包含这样的分离的核酸序列其与选自SEQ ID NO 28至 SEQ ID NO 33的序列具有至少80%同一性。在一个实施方案中，GPVI配体选自 RB424、RB426、RB427、RB428、RB429、RB430、 RB445、RB446、RB447、RB431、RB432、RB433、RB434、RB435、RB436、RB439、RB440、RB441、 RB442、RB443 和 RB444。在一个实施方案中，GPVI配体选自 RB448、RB452、RB453、RB455、RB460、RB462、 RB466、RB478、RB480、RB488、EB490、RB491、RB492、RB493、RB495、RB496、RB497、RB498、 RB499、RB500、RB502、RB503、RB504、RB505、RB506、RB507、RB508、RB517、RB518、RB519、 RB520、RB521、RB522、RB523、RB524、RB525、RB526、RB527、RB528、RB531、RB532、RB533、 RB534、RB535、RB536、RB537、RB538、RB540、RB541、RB542、RB546、RB547、RB548、RB549、 RB550、RB551、RB552、RB553、RB554、RB555、RB556、RB560、RB561、RB566、RB567、RB569、 RB570、RB571。在一个实施方案中，GPVI配体的分离的核酸序列包含一个或多个核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的混合物。在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列的一个或多个核苷酸是经修饰的。 在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸包含在2’羟基位置上的修饰。在另一个实施方案中，修饰选自2 ’ -0-甲基和2 ’ -氟代。在又一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2 ’ -0-甲基胞嘧啶、2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷或2’ -0-甲基鸟苷。在再一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’氟胞苷或2’氟尿苷。在一个实施方案中，包含修饰的一个或多个核苷酸选自5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤(Xantine)、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-0-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷(queosine)、肌苷、Ν6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、 N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-0-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-Ν6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(ν)、butoxosine、假尿嘧啶、辫苷、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基) 尿苷、(acp3U)和2，6_ 二氨基嘌呤。在一个实施方案中，GPVI配体包含至少一个经修饰的糖部分。在一个实施方案中，GPVI配体包含至少一个经修饰的磷酸主链。在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体序列在其3’端包含反向胸腺嘧啶。在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含间隔基(spacer)。在另一个实施方案中， 间隔基是二醇间隔基。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体的第2环包含二醇间隔基。在又一个实施方案中，核酸GPVI配体的第2环由二醇间隔基组成。在再一个实施方案中，二醇间隔基由9-0-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2_氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺的掺入提供。在又一个实施方案中，二醇间隔基连接在分离的核苷酸GPVI配体序列的第一内部核苷酸的3’端并连接在分离的核苷酸GPVI配体序列的与第1内部核苷酸相邻的第2内部核苷酸的5’端。在一个实施方案中，核酸GPVI配体包含脂族氨基接头。在另一个实施方案中，月旨族氨基接头连接在分离的核酸GPVI配体序列的5 ’端。在又一个实施方案中，脂族氨基接头连接在分离的核酸GPVI配体序列的3 ’端。在再一个实施方案中，脂族氨基接头通过6-(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺的掺入提供。在一个实施方案中，分离的核酸GPVI配体与至少一个亲水性部分连接。在另一个实施方案中，至少一个亲水性部分是聚亚烷基二醇。在一个实施方案中，GPVI配体包含与分离的核酸序列的5’端和/或3’端连接的聚亚烷基部分。在另一个实施方案中，聚亚烷基部分通过接头而连接。在又一个实施方案中，接头是脂族氨基接头。在一个实施方案中，使用六碳氨基接头，将GPVI配体与40KD聚乙二醇(PEG)部分连接。在另一个实施方案中，六碳氨基接头是通过酰胺连接而与PEG部分连接。在又一个实施方案中，PEG部分是与一个或多个氨基酸例如赖氨酸连接的2个20 KD的PEG部分，其通过酰胺键与六碳氨基接头连接。在一个实施方案中，第1核酸GPVI配体包含硫代磷酸酯键。在一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI (SEQ ID NO 1)特异性结合。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的胞外结构域(SEQ ID NO 2)特异性结合。在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数为约20纳摩尔浓度(nM)或更小。在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数范围为约400皮摩尔浓度(pM)至约 ΙΟηΜ。在一个实施方案中，GPVI配体的解离常数范围为约IOOpM至约ΙΟηΜ。在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原结合。在另一个实施方案中， 核酸GPVI配体通过GPVI抑制胞内信号转导。在另一个实施方案中，使用GPVI配体通过 GPVI对胞内信号转导的抑制包括减少肌醇三磷酸的产生或抑制胞内钙水平的波动。在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原相关肽(CRP)和/或与 convulxin 结合。在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原和CRP 二者结合。在一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原结合，但不抑制GPVI与CRP结合。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体抑制GPVI与胶原和CRP 二者结合，但不抑制GPVI 与 convulxin 结合。在一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合使GPVI的活性构象稳定。在另一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合使GPVI的失活构象稳定。在又一个实施方案中，核酸GPVI配体与GPVI的结合抑制GPVI与FcR γ亚基间的相互作用。在另一个实施方案中，GPVI配体与GPVI的结合导致GPVI活性受抑制或降低。在又一个实施方案中，GPVI配体与GPVI的结合导致GPVI不能与FcR γ-链相互作用或与 FcR γ -链相互作用能力下降。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI 的结合导致血小板粘附受抑制或降低。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI的结合导致血小板激活受抑制或降低。在再一个实施方案中，GPVI配体与血小板表面上表达的GPVI的结合导致血小板聚集受抑制或降低。在一个实施方案中，GPVI配体与多种GPVI结合并降低或抑制其功能，其中所述 GPVI 变体与 SEQ ID NO :1 具有至少 80%、85%、90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性。在一个实施方案中，GPVI配体对GPVI的解离常数(“K/’)小于约100微摩尔浓度 (μ Μ)、小于约1 μ Μ、小于约500纳摩尔浓度(nM)、小于约ΙΟΟηΜ、小于约50nM、小于约InM、 小于约500皮摩尔浓度(pM)、小于约300pM、小于约250pM或小于约200pM。第二方面，提供GPVI配体的调节剂，其中所述调节剂部分地或完全地逆转GPVI配体的活性。在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列。在另一个实施方案中，调节剂包括DNA序列、RNA序列、多肽序列或其任何组合。在一个实施方案中，GPVI核酸配体调节剂选自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)和锁定核酸(LNA)。在一个实施方案中，GPVI核酸配体调节剂选自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)和锁定核酸(LNA)，其中所述调节剂与至少部分的GPVI核酸配体特异性结合或与之相互作用。在一个实施方案中，调节剂选自核酸结合蛋白或肽、小分子、寡糖、核酸结合脂质、聚合物、纳米粒和微球体，其中所述调节剂与至少部分的GPVI核酸配体结合或与之相互作用。在一个实施方案中，调节剂是包含脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的核酸调节剂。在另一个实施方案中，核酸调节剂包含至少一个经修饰的脱氧核糖核苷酸和/或至少一个经修饰的核糖核苷酸。在一个实施方案中，调节剂是与至少部分的GPVI核酸配体互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与GPVI配体中的至少部分的环互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与核酸GPVI配体的至少第1环、第2茎和第2环互补的寡核苷酸。在另一个实施方案中，调节剂是与GPVI配体的第3环、第3茎、第4环和第1茎互补的寡核苷酸。在一个实施方案中，调节剂包含分离的核酸序列，其中所述序列的长度为约IOnt 至约30nt、约IOnt至约25nt、约IOnt至约20nt、约IOnt至约15nt或约15nt至约20nt。在一个实施方案中，核酸调节剂序列的一个或多个核苷酸是经修饰的。在另一个实施方案中，一个或多个核苷酸包含在2’羟基位置上的修饰。在另一个实施方案中，修饰选自2’-0_甲基和2’-氟代。在又一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’-0_甲基胞嘧啶、2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷、2’ -0-甲基鸟苷或2’ -0-甲基胸苷。在再一个实施方案中，一个或多个核苷酸是2’氟胞苷、2’氟尿苷、2’氟腺苷或2’ -氟鸟苷。在一个实施方案中，核酸调节剂的一个或多个核苷酸的修饰包括选自以下的修饰5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、 5_(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-0-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β -D-半乳糖基辫苷、肌苷、Ν6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、 Ν6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-0-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-Ν6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(ν)、butoxosine、假尿嘧啶、辫苷、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基) 尿苷(acp3U)和2，6_ 二氨基嘌呤。在一个实施方案中，调节剂包含至少一个经修饰的糖部分。在一个实施方案中，调节剂包含至少一个经修饰的磷酸主链。在一个实施方案中，调节剂包含在生理条件下与GPVI配体的第4环杂交的寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸调节剂包含序列3’ -AUU-5’。在一个实施方案中，调节剂包含在生理条件下与GPVI配体的第1环杂交的寡核苷酸。在另一个实施方案中，寡核苷酸调节剂包含序列3’ CUG-5’。在一个实施方案中，调节剂包含选自SEQ ID NO :74_88的序列。在另一个实施方案中，调节剂选自 RB416、RB417、RB418、RB419、RB420、RB421、RB422、RB423、RB513、RB514、 RB515、RB516、RB543、RB544 和 RB545。在一个实施方案中，调节剂破坏核酸GPVI配体的二级结构。在另一个实施方案中，调节剂使GPVI配体的二级结构稳定。
在一个实施方案中，调节剂破坏核酸GPVI配体的三级结构。在另一个实施方案中，调节剂使GPVI配体的二级结构稳定。在一个实施方案中，调节剂与GPVI配体的结合，暴露了 GPVI配体内的自杀位置 (suicide position)，因而破坏了 GPVI配体的二级结构并导致核酸GPVI配体被核酸酶的破坏增加。在一个实施方案中，调节剂与GPVI配体-GPVI复合物的结合，降低或消除了 GPVI 配体与GPVI的结合。另一方面，提供调节GPVI配体活性的方法。在一个实施方案中，提供调节核酸配体对GPVI的活性的方法，即通过将GPVI配体调节剂给予已被给予核酸GPVI配体的宿主。在一个实施方案中，调节剂可以是寡核苷酸调节剂或其衍生物，而在某些实施方案中，调节剂与部分的核酸GPVI配体互补。又一方面，提供了使用GPVI配体来调节GPVI功能的方法。在一个实施方案中，用于调节GPVI功能的方法包括给予宿主治疗有效量的GPVI 配体。在另一个实施方案中，所述方法还包括将GPVI配体调节剂给予宿主。另一方面，提供治疗或改善血小板介导的疾病或病症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给予有需要的宿主治疗有效剂量的与GPVI结合的GPVI配体。在另一个实施方案中，所述宿主是经诊断患有高危糖尿病。在再一个实施方案中，所述宿主是经诊断患有转移高危癌症。在一个实施方案中，血小板介导的疾病或病症选自脑血管疾病、急性冠状动脉综合征、糖尿病相关疾病、自身免疫炎性疾病和癌症。在一个实施方案中，所述脑血管疾病是血栓形成、血栓栓塞或短暂性缺血发作 (TIA)。在另一个实施方案中，急性冠状动脉综合征是因为冠状动脉血栓形成、不稳定型心绞痛或心肌梗死。在再一个实施方案中，糖尿病相关疾病是糖尿病性视网膜病、糖尿病性血管病、动脉粥样硬化、缺血性发作、外周血管病、急性肾损伤或慢性肾衰竭。在另一个实施方案中，自身免疫炎性疾病是硬皮病、类风湿性关节炎或选自银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎性肠病和强直性脊柱炎的炎性自身免疫病。在一个实施方案中，癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、骨癌和肝癌。在一个实施方案中，给予GPVI配体是通过胃肠外给予、静脉内注射、皮内递送、 关节内递送、滑液内递送、鞘内、动脉内递送、心内递送、肌内递送、皮下递送、眼眶内递送、 囊内递送、脊柱内递送、胸骨内递送、局部递送、透皮糊剂递送、直肠递送、借助阴道或尿道栓剂递送、腹膜递送、经皮递送、借助鼻腔喷雾递送、借助手术植入递送、借助内用外科涂剂 (internal surgical paint)递送、借助输注泵递送或借助导管递送。另一方面，提供通过给予GPVI配体治疗有需要的宿主的方法，其中GPVI配体调节血小板功能。在一个实施方案中，给予治疗有效剂量的GPVI。在一个实施方案中，治疗有效剂量降低或抑制血小板粘附和/或聚集。一方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的与GPVI结合的核酸GPVI配体。一方面，提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的调节剂，其中调节剂调节与GPVI结合的核酸GPVI配体的活性。在一个实施方案中，药物组合物包含GPVI配体和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，药物组合物是适于静脉内注射的液体。在又一个实施方案中，药物组合物是适于皮下注射的液体或分散体。一方面，提供一种药盒，其包含治疗有效量的GPVI核酸配体和/或调节GPVI核酸配体的活性的调节剂。附图简述
图1是SELEX核酸配体选择方法图。图2显示用于进行SELEX循环以鉴定针对GPVI的核酸配体的选择条件。图3显示富含针对GPVI的核酸配体的痕量32P末端标记的文库的结合曲线。图4A-B显示在“E/F”选择系列中在10轮选择后的各克隆和在“E2”选择系列中在10轮选择后的各克隆的经鉴定的第一随机区(primary random region)衍生序列。图5显示在选择过程中鉴定的序列的GPVI结合所需的最小预测基本序列 (primary sequence)和预测保守二级结构。“L”是指环，“S”是指茎区。图6是EF-3 GPVI配体与GPVI的结合图，将3’引物退火到EF-3从而在蛋白相互作用期间掩蔽EF-3的3’固定区或不退火。图7是比较GPVI的截短配体与原始GPVI配体EF-2和EF-3的结合曲线图。图8显示若干截短的EF-3和EF-31 GPVI配体截短变体的序列和预测二级结构。图9显示截短序列EF-3 T2和EF-2 T2 GPVI配体的预测二级结构和失活点突变的位置。图10显示GPVI核酸配体变体的GPVI结合测定结果。图11显示不同GPVI核酸配体的预测二级结构和糖取代。图12显示GPVI核酸配体变体的GPVI结合测定结果。图13A-B显示六甘醇间隔基亚磷酰胺和间隔基亚磷酰胺掺入到核酸序列的两个核苷酸之间。图14A-B显示可通过接头与GPVI配体缀合的PEG部分和缀合部分的构型。图15是比较EF-2和EF-3的GPVI配体截短变体与含有失活点突变的变体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图16是不同浓度的选择GPVI核酸配体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图17显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的CRP诱导的血小板聚集图，以对照的
百分率来表示。图18显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的
百分率来表示。图19显示不同浓度的选择GPVI核酸配体的CRP诱导的血小板聚集图，以对照的
百分率来表示。图20显示在富含血小板的血浆中，不同浓度的GPVI配体RB571下的胶原和CRP 诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图21是GPVI核酸配体在暴露给流动的全血的胶原包被表面上对血小板积累的影响的图，以失活对照配体的最大响应％来表示。图22显示表明GPVI配体RB571对GPVI的结合特异性与血小板受体P2Y:、P2Y12 和PAR-I相比较的图。图23显示表明GPVI配体RB571对GPVI的结合特异性与血小板受体GPlb α -vffF 相互作用或血小板血栓烷A2受体相比较的图。图M显示截短序列GPVI配体EF2-T2和EF3-T2的预测二级结构以及配体与GPVI 配体调节剂RB416-423之间的互补性区域。图25显示GPVI配体EF2-T2单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图沈显示GPVI配体EF3-T2单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图27显示GPVI配体RB490单用或与不同浓度的不同GPVI配体调节剂联用的胶原诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图28显示表明用GPVI配体调节剂RB515对GPVI核酸配体RB490的抗GPVI活性的逆转持久性的图。图四显示GPVI配体RB571的预测二级结构及其与GPVI配体调节剂RB515的预
测相互作用。图30显示GPVI配体RB571单用或与不同浓度的GPVI配体调节剂RB515联用的胶原诱导的和CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。图31显示在富含血小板的血浆中，GPVI配体RB571单用或与GPVI配体调节剂 RB515联用的胶原诱导的和CRP诱导的血小板聚集图，以对照的百分率来表示。发明详述本发明提供与血小板膜糖蛋白VI(GPVI)结合的核酸配体的药物组合物、配体调节剂和将其用于治疗血小板介导的疾病和病症的方法。还提供包含GPVI核酸配体和/或 GPVI配体调节剂的药物制剂。A.定义本文所用的术语“约”当用于可测值例如重量、时间、剂量等的量时，是指包括指定量的士20%或士 10%、士5%、士或士0. 的变异，因为这样的变异适于进行所公开的方法。“核酸配体”在本文中也称为“配体”或“适配体”，是可形成三级结构的核酸，这可允许它与靶分子相互作用。“GPVI核酸配体”或“GPVI配体”或“抗GPVI配体”或“核酸 GPVI配体”是指与GPVI特异性结合的配体或适配体。这些术语是指具有在生理环境中能与预期靶分子形成复合物的特异性结合区的寡核苷酸。配体与靶分子结合的亲和力是根据配体与靶分子间相互作用的解离常数(Kd)来定义的。通常，配体对其靶标的Kd介于约InM 至约IOOnM之间。结合特异性按照配体对靶标的比较解离常数相对于配体与环境中的其它材料或对普通的无关分子的解离常数来定义。通常，配体对靶标的Kd与对环境中的无关材料或伴随材料的Kd相比减小10倍、50倍、100倍或200倍。“配体调节剂对”或“配体调节剂对”是指包括靶分子的指定配体和能改变配体的二级和/或三级结构而使配体与其靶标间的相互作用被调节的配体调节剂。调节剂可以是与部分的配体互补的寡核苷酸。在生理条件下调节剂可改变配体构象，以使配体的靶结合能力降低 10%至 100%,20%M 100%、25%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%，或 10%至100%范围内的任何百分率。“调节剂(mudulator) ”、“解毒剂(antidote) ”、“调节剂(regulator) ”或“控制剂 (control agent) ”是指可与本文所述的配体或适配体结合并以所需方式改变该配体与其靶分子间相互作用(例如通过改变配体结构)的任何药学上可接受的物质。本文所用的术语“调节”是指活性降低、增加或某些其它可测量的变化。本文所用的术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府管理部门批准的或列于美国药典或其它公知的药典中用于人类的。药物有效剂量是预防、抑制发病或治疗疾病状态(在某种程度上减轻症状)所需的剂量。药物有效剂量取决于疾病类型、所用组合物、给药途径、所治疗哺乳动物的类型、 所考虑的指定哺乳动物身体特点、同时使用的药物和药学领域技术人员将会了解的其它因素。通常，按照核酸配体和调节剂的效能给予0. lmg/kg至100mg/kg体重/天的活性成分的量。“稳定的核酸分子”是指与未稳定的核酸分子相比，在体内更不容易降解(例如通过外切核酸酶或内切核酸酶)的核酸分子。稳定可由长度和/或二级结构和/或寡核苷酸主链的磷酸部分的糖中所含化学取代决定。可通过控制例如可使分子稳定的二级结构而达到稳定。例如，如果核酸分子的3'端与上游区互补，该部分就可以向回折叠并形成可使分子稳定的“茎环”结构。术语“结合亲和力”和“结合活性”是指配体分子与靶标结合与否的趋势。所述相互作用的能量学在“结合活性”和“结合亲和力”中是重要的，因为它们限定了相互作用伴侣的必要浓度、这些伴侣能缔合的速率、以及溶液中结合分子和游离分子的相对浓度。能量学可尤其通过测定解离常数Kd表征。本文所用的术语“治疗”是指对哺乳动物疾病的任何治疗，包括(a)针对疾病的保护作用，也就是说，使临床症状不发展；(b)抑制疾病，也就是说，终止、改善、减少或抑制临床症状的发展；和/或(c)减轻疾病，也就是说，使临床症状消退。本领域技术人员将会理解在人用药物中，并非总能区分“预防”和“抑制”，因为直到事件发生良久之后，最终诱导的事件也可能是未知的、潜伏的，或患者不可查明。因此，本文所用的术语“预防”旨在作为 “治疗”的要素，包括“预防”和“抑制”，如本文所定义。本文所用的术语“保护”是指包括 “预防”。术语“有效量”是指足以对待治疗病症或疾病状态提供治疗的剂量。这会因患者、 疾病和待进行的治疗而异。本文所用的术语GPVI核酸配体“变体”包括能行使与GPVI核酸配体基本相同功能并包含基本相同结构的变体。B.糖蛋白 VI糖蛋白VI(GPVI)在血小板细胞表面上特异性表达。大量研究表明，胶原介导的 GPVI的激活在血小板粘附和聚集中起到关键作用。因此，GPVI是令人日益关注的用于治疗血小板和胶原介导的疾病的治疗靶标。因为生理止血与病理血栓形成间的边界非常窄，所以对于胶原介导的GPVI激活
13而言能够提供对血小板活性的良好控制是必要的。因此，本文也提供能够调节或调整所公开的GPVI配体的活性的调节剂成分。GPVI是长度为339个氨基酸残基的糖蛋白(GenBank检索号Q9HCN6 ；在本文中公开为SEQ ID NO :1)。氨基酸残基1-20代表信号序列，其被切割而产生具有319个氨基酸的成熟蛋白。GPVI具有2个胞外免疫球蛋白结构域、粘蛋白样核心、短肽接头序列、跨膜结构域和与Fyn和Lyn Src家族激酶结合的短胞质尾。也可将GPVI与FcR γ -链组成型地复合，允许装配和激活Syk并启动与免疫受体所用的途径具有许多相似性的下游信号转导途径的激活。在人类染色体19上的白细胞受体簇(LRC)中发现编码GPVI的基因。没有GPVI 或FcR Y-链的小鼠具有明显受损的针对胶原的血小板响应并降低血栓形成。另外，新的单克隆抗人GPVI抗体的Fab片段0Μ4在大鼠血栓形成模型中体内抑制血栓形成，在用GP Ilb/IIIa抗体时可见出血时间没有延长。已经知道GPVI胞外结构域(SEQ ID NO 2)与胶原I-IV型特异性结合(Jung等， Platelets, 2008,19 :32-42)。此外，已知胶原I-IV型支持血小板激活、聚集和粘附，而非纤维状胶原VI、VII和VIII型则仅导致微弱粘附，却不导致血小板聚集。因此，进行研究以鉴定与GPVI胞外结构域结合的GPVI配体，以产生可用于治疗血小板介导的病症或疾病的药物制剂。C.针对GPVI的核酸配体的开发使用SELEX方法，鉴定与GPVI蛋白特异性结合的核酸配体。再对最初通过SELEX 获得的配体进行充分表征，以了解GPVI配体的特性。这样的表征包括测序、测定保守序列的序列比对、二级结构预测、以及鉴定对特异性结合和抑制GPVI所需功能最重要的配体区的截短和突变分析。在鉴定最佳配体序列和二级结构之后，进行修饰以优化配体，用于药物用途。这些修饰的实例包括PEG化、在核酸配体内使用间隔基以及对核酸配体的糖和磷酸部分的所选修饰。进行结合测定，以监测所用不同修饰所导致的配体功能。SELEX是指通过指数富集的配体系统进化。该方法允许与靶分子高度特异性结合的核酸分子的体外进化。该SELEX方法描述于例如美国专利号7，087，735,5, 475，096和 5，270，163 (亦见 WO 91/19813)。SELEX方法包括从候选寡核苷酸混合物中选择并且使用同样的通用选择方案，逐步重复结合、区分和扩增，从而真正达到任何所需的结合亲和力和选择性的标准。从核酸混合物例如包含随机化序列区段的混合物开始，SELEX方法包括以下步骤在利于结合的条件下使混合物与靶标接触，将已与靶分子特异性结合的那些核酸与未结合核酸区分开，使核酸靶标复合物解离，将从核酸靶标复合物中解离出的核酸扩增以得到配体富集的核酸混合物，再通过所需要的多轮循环重复结合、区分、解离和扩增的步骤以便得到对靶分子具有高特异性、高亲和力的配体。已经对基本SELEX方法进行改良，以达到各种特定目的。例如，美国专利号 5，707，796描述了使用SELEX以及凝胶电泳，以选择具有特定结构特征的核酸分子，例如弯曲DNA。美国专利号5，763，177描述了基于SELEX的方法，用于选择含有光反应性基团并能与靶分子结合和/或与之光交联和/或将其光激活的配体。美国专利号5，580，737描述了鉴定能区分密切相关分子的高度特异性配体的方法，称为反向SELEX(Coimter-SELEX)。 美国专利号5，567，588和5，861，254描述了基于SELEX的方法，所述方法实现了对靶分子具有高亲和力和低亲和力的寡核苷酸的高效区分。美国专利号5，496，938描述了在进行 SELEX方法之后获得改善的配体的方法。美国专利号5，705，337描述了使配体与其靶标共价交联的方法。美国专利号5，648，214证明了在溶液中鉴定针对小肽的核酸配体的可行性。美国专利号5，780，228举例说明了使用配体亲和洗脱而产生靶向靶分子上的特定位点的配体的能力，其涉及结合某些凝集素的高亲和力配体的产生。制备针对某些组织(其包括多类细胞类型)的核酸配体的方法描述于美国专利号6，127，119。针对小牛肠磷酸酶的某些经修饰的高亲和力配体的制备描述于美国专利号6，673，553。美国专利号6，716，580描述了鉴定核酸配体的自动化方法，其包括使用机器人操作器。按照其最基本形式，SELEX方法可定义为以下一系列步骤1)制备不同序列的候选核酸混合物。候选混合物通常包含固定序列区(即候选混合物的每个成员在相同位置中含有相同序列)和随机序列区。选择固定序列区是为了 (a) 有助于下述扩增步骤，(b)模拟已知与靶标结合的序列，或(C)在候选混合物中提高核酸的给定结构排列的浓度。随机序列可以是完全随机(即在任何位置找到碱基的概率是1/4)或仅部分随机(例如在任何位置找到碱基的概率可选择在介于0至100%之间的任何水平)。2)在利于靶标与候选混合物成员结合的条件下，使候选混合物与所选靶标接触。 在这些情况下，靶标与候选混合物核酸间的相互作用可视为在靶标与对靶标具有最强亲和力的那些核酸之间形成核酸-靶标复合物。3)将对靶标具有最高亲和力的核酸与对靶标具有较低亲和力的那些核酸区分开。 因为仅有对应于最高亲和力核酸的极少量序列(且可能仅一分子核酸)存在于候选混合物中，所以通常需要设定区分标准，使得在区分期间在候选混合物中保留显著量的核酸(大约 5-50% )。4)再对区分期间所选的对靶标具有相对高亲和力的那些核酸进行扩增，以产生新的候选混合物，其中富集了对靶标具有相对高亲和力的核酸。5)通过重复以上区分和扩增步骤，新形成的候选混合物含有越来越少的弱结合序列，核酸对靶标的亲和力的平均程度通常将会上升。直到最后，SELEX方法将会从原始候选混合物中得到含有代表那些核酸序列的一个或少量独特核酸(其折叠成使能与靶分子具有最高亲和力相互作用的特定的二级和三级结构)的候选混合物。SELEX可用于产生二价结合，其具有对蛋白(包括受体)的两个或更多表位具有亲和力的两个或更多结合结构域。具体地讲，在一个实施方案中，所述方法可用于选择对GPVI 受体的两个或更多区具有亲和力的核酸配体。例如，在某些实施方案中，配体可与C2区的至少两个部分结合。在某些实施方案中，配体通过破坏二聚体构象或使其稳定而影响GPVI 受体的二聚化。在这些实施方案中，可将调节剂设计为与核酸配体所能结合的仅一个表位结合、与不止一个表位结合或与所有表位都结合。调节剂可以例如干扰与仅一个表位(例如受体的C2-1或C2-2区)的结合。可使用例如美国专利号7，087，735所述的SELEX方法，通过针对代表分子的胞外结构域的短肽进行SELEX，而产生对GPVI具有特异性的核酸配体。备选地，使用例如美国专利号6，730，482所述的SELEX方法，可通过在完整血小板上、在富集所述蛋白的血小板膜部分上、在纯化的GPVI上或在特异性过量表达GPVI受体的细胞系上进行SELEX，分离对GPVI具有特异性的核酸配体。另外，可使用竞争亲和洗脱方案，例如美国专利号5，780，2 所描述的那些，将 SELEX方法用于分离特异性GPVI核酸配体。例如，为了分离对GPVI具有特异性的核酸配体，可通过加入足量的GPVI活化剂或结合剂(例如胶原、convulxin或CRP或相关化合物)， 而进行与该蛋白结合的配体的洗脱。GPVI受体可以是用于SELEX方法的重组表达的和纯化的蛋白。在某些实施方案中，GPVI核酸配体在生理条件下与GPVI受体结合。生理条件通常涉及溶液的盐和pH水平。 在体外，生理条件通常可在包含150mM NaCl、2mM CaCl2,20mM HEPES，pH约7. 4的缓冲液中再现。在某些实施方案中，如上所述地使用天然的、通常是未激活的血小板，以筛选核酸配体群体并提供富含有针对血小板上存在的蛋白质的配体的集群体。再针对过量表达所需 GPVI受体的稳定细胞系，或已经用该蛋白瞬时转染的细胞系，来使用富集群体。二次筛选可如下完成通过使用改良SELEX方法，对于来自这些细胞的分离的受体或对于完整细胞，通过配体竞争研究或通过鉴定对胞内信号转导途径的作用。在某些实施方案中，可使用固定化蛋白来鉴定针对特异性GPVI靶标的核酸配体。 在某些这样的实施方案中，可将纯化蛋白通过化学接头与固体基质连接。在其它实施方案中，可使用去垢剂例如阴离子型去垢剂(例如胆酸盐)来提取过量表达特定蛋白的细胞的膜，以分离与固定化人工膜偶联的蛋白和混合物的某部分。通常，认为可通过除去去垢剂而完成重新组织，在其间脂质和蛋白重新组织并与通常在支持基质(例如珠)上的固定化人工膜的烃链形成层。可通过筛选核酸配体抑制特定激动剂诱导的血小板功能和/或由GPVI诱发的胞内信号转导事件的能力，鉴定由这些SELEX方法所分离的对GPVI具有特异性的核酸配体 (其也具有所需的功能活性)。因为所需核酸配体不仅是结合伴侣，而且是受体信号转导的抑制剂，所以可以通过评价配体对血小板活性的作用而鉴定具有所需功能的配体。这可包括表征配体对已知由GPVI调节的不同信号途径的作用。例如，GPVI信号转导可导致GPVI 蛋白簇集，并导致激酶激活而开始激活磷脂酶C γ 2的事件的局部信号链，释放使得Ca2+水平升高和蛋白激酶C激活的第二信使1，4，5_肌醇三磷酸和二酰甘油。可使用本领域普通技术人员众所周知的方法测定任何这样的第二信使系统或信号。另外，可在这些系统中测定在GPVI核酸配体存在或不存在时的GPVI的胶原结合。也可在血小板功能测定(例如在富含血小板的血浆和洗涤血小板制剂中进行的透光聚集度测定(Light Transmittance Aggregometry)或在全血中进行的阻抗聚集度测定(Impedance Aggregometry))中筛选配体对血小板聚集的抑制。另外，也可在静态条件或在流动的全血中筛选配体对血小板与胶原包被的表面的相互作用的抑制。GPVI的给定核酸配体的特异性可进一步通过配体阻断由给定受体的已知激动剂所触发的胞内信号转导事件的能力区别。例如，GPVI核酸配体抑制剂可望阻断由例如蛇C型凝集素convulxin、胶原或胶原相关肽(CRP)所触发的信号转导。GPVI的给定核酸配体的特异性还进一步通过在聚集由激活并非GPVI的受体的激动剂所触发时不存在对血小板聚集的作用来区别。任何上述方法的应用，单独或联用，都将得到多种对GPVI具有特异性的核酸配体。一旦鉴定了具有所需抑制特性的核酸配体之后，可按照下文所述鉴定该配体的调节剂。D. GPVI的核酸配体
本文所公开的GPVI配体优选是核酸配体，例如配体。使用在下文和实施例1中更详细描述的SELEX方法，筛选与GPVI胞外结构域(ECD)(氨基酸残基Gln21-Lys267 ；SEQ ID NO 2)特异性结合的GPVI配体，然后将其修饰以增加稳定性、对GPVI的亲和力和/或调节 GPVI活性的能力。本发明的GPVI核酸配体由分离的核酸序列组成，所述序列可以是DNA或RNA，并且其可以用修饰的核糖核酸或脱氧核糖核酸合成。如本文所述，如果使用RNA的碱基结构， 所述结构在碱基序列中将包含尿苷(U)来替代胸苷(T)。在本文所述的某些实施方案中， 核酸序列被写为RNA序列。同样，在本文所述的某些实施方案中，其中核酸配体最初被鉴定为DNA分子，核酸序列被写为DNA序列。可以理解，作为DNA序列以文本形式呈现的核苷酸序列固有地提供相应RNA序列的描述，其中DNA序列内的胸腺嘧啶⑴被尿苷⑶替换，以得到相应的核苷酸RNA序列。同样，可以理解，作为RNA序列以文本形式呈现的序列固有地提供相应DNA序列的描述，其中RNA序列内的尿苷⑶被胸腺嘧啶⑴替换，以得到相应的 DNA序列。对通过SELEX方法获取的若干GPVI核酸配体进行测序并对其序列进行比对。图 4所示的序列比对导致对通过筛选过程而富集的6个独特序列的鉴定。称为“A”至“F”的 6个序列的比对表明UAA序列的存在。此外，该完全保守序列包含在以下序列之中(G/A) UAA。通过各侧与GC相接的(G/A) UAA序列产生保守GC (G/A) UAAGC序列。然后对独特的GPVI配体进行二级结构预测分析。二级结构有助于配体的功能特性。正如技术人员所充分理解的，可根据茎和环结构描述二级结构，因为它们在分子中存在于5’-3’方向上。根据以下实施例2所示的二级结构预测，GPVI E⑶配体具有包含3茎和 4环的二级结构。5’ -3’构型包括第1茎(茎1或Si)、第1环(环1或Li)、与第2和第3 环(环3或L3)相连的第2茎(茎2或S2)、第3环、第3茎(茎3或S3)和第4环(环4 或L4)(参见图8A-8C)。在某些实施方案中，第2茎与第1、第2和第3环连接，而第3茎与第3和第4环连接。在一个实施方案中，第3茎在5’-3’方向上邻近第1茎。序列GC(G/ A) UAAGC构成茎3 (GC碱基对)和环4 ((G/A) UAA)。序列GAC构成环1。由SELEX所鉴定的GPVI配体的突变分析显示，UA、UU或UG的环3序列支持配体与 GPVI的高亲和力结合。因此，在某些实施方案中，GPVI核酸配体的环3包含序列5’-YD-3’， 其中Y代表嘧啶，D代表U、G或A。在某些实施方案中，使用技术人员已知的方法，可用间隔基取代GPVI核酸配体的环2。间隔基可以是提供类似于环2结构的非核苷酸间隔基，使得当环2被间隔基取代时， GPVI配体维持其结构和功能。通过将(9-0-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2_氰基乙基)-(N，N-二异丙基)]-亚磷酰胺(参见图13A-13B)掺入到GPVI核酸配体中而达到用六甘醇间隔基对环2进行取代，结果对GPVI的亲和力无损失。因此，本领域普通技术人员将会理解，可以用各种市售的非核苷酸间隔基取代环2。所述间隔基的实例包括但不限于通过将以下化合物掺入到GPVI核酸配体中而得到的那些5’ -0-二甲氧基三苯甲基-1’ 2’ 二脱氧核糖-3’ - [ (2-氰基乙基)-(N, N- 二异丙基)]-亚磷酰胺；18-0- 二甲氧基三苯甲基六甘醇，I"[ (2-氰基乙基)-(N, N- 二异丙基)]-亚磷酰胺；和12- (4，4，- 二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1- [ (2-氰基乙基)-(N, N- 二异丙基)]-亚磷酰胺。GPVI配体在调节GPVI功能或治疗血小板介导的疾病中的功效主要取决于配体以足够的亲和力与GPVI蛋白结合的能力。因此，在通过SELEX方法得到GPVI配体之后，对每种配体测序，然后可表征其对靶分子的结合。本文的配体与靶标(GPVI)的结合亲和力可用 Kd来定义。该解离常数值可通过众所周知的方法例如实施例1所述的放射性配体结合方法来直接测定。然而，已经观察到对于某些小寡核苷酸而言，直接测定Kd有时很困难，并且可导致错误的高结果。在这样的情况下，对于已知与靶标或候选物结合的物质而言，可进行靶分子或其它候选物质的竞争结合测定。在理想条件下发生50%抑制的浓度值(Ki)就等于 Kdo然而，决不能是Ki小于Kd。因此，备选地，对Ki的测定设定了 Kd值的最大值。在技术难题阻碍了对Kd进行精确测定的情况下，可合宜地替换为对Ki的测定，以提供Kd的上限。Ki 值也可用于证实本发明的配体与靶标结合。在表征GPVI配体结合特性时，可用已知的GPVI 结合分子(例如胶原、CRP(胶原相关肽)或C0nvuIxin(Cvx))的竞争结合或功能测定来分析特异性。在某些实施方案中，配体与GPVI结合的Kd范围可为约InM至约ΙΟΟηΜ，约IOnM至约50nM或约20nM至约0. InM。在其它实施方案中，配体与GPVI结合的Kd比配体与环境中的无关蛋白或其它伴随材料结合的Kd小至少2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。无关蛋白也可以是具有与GPVI中存在的模体相关的模体的蛋白，例如另一 Ig超家族成员或包含胶原结合结构域的另一种蛋白或另一种血小板激活或粘附受体。正如下文将要详述的那样，可使用各种各样的工程方法，对经SELEX方法而获取并鉴定的配体的结合活性进行进一步修饰或增强。在某些实施方案中，配体与GPVI的胞外结构域相互作用。配体可干扰GPVI受体与胶原结合。在某些实施方案中，配体可通过GPVI受体而抑制胞内信号转导，包括降低肌醇三磷酸的产生或降低胞内钙水平的波动。配体也可稳定或破坏受体构象，例如二聚体构象，使得受体与胶原或FcR γ相互作用的能力降低。配体可通过胶原或其它GPVI激动剂而影响血小板激活。配体也可影响血小板对胶原或胶原相关肽的粘附。配体可影响由胶原或其它GPVI激动剂诱导的血小板聚集。本文所述的核酸配体可起到活性可逆试剂的作用。它们是这样的试剂或药学活性分子其在给予患者之后可通过给予第二种试剂而受到直接控制。正如下文详述的那样，第二种试剂，在本文中称为调节剂，可关闭或微调配体的药理活性。结果，可通过并非例如药物清除的方式而逆转配体的药理活性。E.调节剂在某些实施方案中，GPVI的核酸配体是可逆的。一方面，本发明通过将GPVI配体的调节剂给予已被给予核酸配体的宿主而提供调节GPVI的核酸配体的活性的方法。本发明的调节剂包括可以所需方式与核酸配体结合并改变该配体与其靶分子间相互作用(例如通过改变核酸配体的结构)的任何药学上可接受的试剂，或降解、代谢、切割或以其它方式化学改变核酸配体以改变其生物学作用的任何药学上可接受的试剂。本发明调节剂的实例包括与至少部分的核酸配体序列互补的寡核苷酸或其类似物(包括核酶或DNA酶)。其它实例包括肽核酸(PNA)、吗啉代核酸(MNA)或锁定核酸(LNA)；核酸结合蛋白或肽；寡糖；小分子；或基于核酸结合聚合物、脂质、纳米粒或微球体的调节剂。调节剂可经设计，使其以高度特异性和所需亲和力程度与特定核酸配体结合。调节剂也可经设计，使得一旦结合后，配体结构被改变为更高或更低活性形式。例如，调节剂可经设计，使得一旦与靶核酸配体结合后，该配体的二级和/或三级结构发生改变，从而配体不再与其靶分子结合或以较低亲和力与其靶分子结合。备选地，调节剂可经设计，使得一旦结合后，配体的三维结构发生改变，以增强配体与其靶分子的亲和力。也就是说，调节剂可经设计，使得一旦结合后，结构模体被修饰，使配体亲和力增加。在另一个实施方案中，配体/调节剂对经设计，使调节剂与不能与目标靶标结合的核酸配体分子的结合可导致在配体内产生结构模体，从而允许配体与其靶分子结合。调节剂也可经设计，使其以足够亲和力与特定核酸配体或核酸配体组非特异性结合而形成复合物。这样的调节剂通常可通过电荷-电荷相互作用与核酸缔合。这样的调节剂也可同时与不止一个核酸配体结合。调节剂可经设计，使得一旦与一种或多种核酸配体结合后，核酸配体的结构并未与其活性形式有显著改变，但是，调节剂掩蔽或在空间上阻止了核酸配体与其靶分子的缔合。核苷酸调节剂可以是允许与配体分子有效结合的任何长度。例如，寡核苷酸调节的长度范围可为约10个核苷酸(nt)至约30nt、约IOnt至约20nt、或约15nt。核苷酸调节剂的长度可以是 8nt、9nt、10nt、lint、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、 21nt>22nt>23nt>24nt>25n25>26nt>27nt>28nt>29nt 或 30nt。本领域普通技术人员也可设想长度大于30nt的核苷酸调节剂。本文所述的核酸配体具有活性三级结构，其可受合适的稳定二级结构的形成的影响。因此，尽管互补的本发明寡核苷酸调节剂与核酸配体间双链体的形成机制类似于两个短的线状寡核糖核苷酸间的双链体的形成，但是分子内配体结构可同时影响到设计这样的相互作用的规则和所述产物形成的动力学。核酸配体与寡核苷酸调节剂间最初碱基对形成的成核率在最终稳定双链体形成中起到重要作用，并且通过将寡核苷酸调节剂靶向到核酸配体中存在的单链环和/或单链 3'或5'尾极大地提高该步骤的速率。对于分子间双链体最佳形成的发生，相对于靶向核酸配体内现有的分子内双链体的形成，自由能理想地有利于分子间双链体的形成。本发明在本文所述的调节剂通常是包含与至少部分的靶向核酸配体序列互补的序列的寡核苷酸。例如，调节剂寡核苷酸可包含与靶向配体的约6nt至25nt、8nt至20nt 或IOnt至15nt互补的序列。使用本文所述的和本领域普通技术人员已知的技术，考虑到靶向配体和所寻求的效果，可以容易地优化调节剂寡核苷酸的长度。可以用携带D或L立体化学的核苷酸或其混合物制备寡核苷酸。天然存在的核苷呈D构型。尽管本发明的寡核苷酸调节剂包含与至少部分的核酸配体互补的序列，但绝对互补性并非必需的。“与至少部分的核酸配体互补的”序列在本文中是指具有足够互补性以能与核酸配体杂交的序列。杂交能力可取决于核酸的互补性程度和长度。通常，杂交的寡核苷酸越大，其可含有的与靶配体错配的碱基就约多并且仍能形成稳定的双链体(或三链体，视情况而定)。本领域技术人员可通过使用测定杂交复合物熔点的标准程序来确定错配的可容忍程度。本发明的寡核苷酸可以是单链DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修饰形式。调节剂在核酸主链和单个核酸结构中都可包含修饰。在某些实施方案中，调节剂是与配体中的至少一个环区互补的核酸。在某些实施方案中，调节剂是至少具有在生理条件下与二维结构中的第4环杂交的序列的寡核苷酸，并且尤其是包含序列3’ -AUU-5’的寡核苷酸。在其它实施方案中，调节剂是在生理条件下与配体二级结构中的第1环杂交的寡核苷酸，并且尤其是至少包含序列3’-CUG-5’的寡核苷酸。根据调节剂的所需功能，可设计调节剂以破坏或稳定核酸配体的二级和/或三级结构。在某些实施方案中，调节剂经设计与配体上的“自杀位置”结合并因此破坏配体序列。自杀位置是对酶促切割敏感的配体的单链部分。在一个示例性的实施方案中，一旦调节剂与配体结合后，自杀位置就变为单链并且不稳定，并且可增强由循环例如血液中的酶或肝脏内切核酸酶对配体的切割。在某些实施方案中，调节剂与配体结合，然后配体就不再与其靶标相互作用。在一个示例性的实施方案中，调节剂包含选自SEQ ID NO :74-88的核酸序列。在某些实施方案中，调节剂序列包含至少一个经修饰的核苷酸。例如，2’-0_甲基和2’-氟代修饰，其可包含2’-0-甲基胞嘧啶、2’-0-甲基尿苷、2’-0-甲基腺苷、2’-0-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷。可使用不同策略以测定核酸配体内寡核苷酸调节剂所结合的最佳位点。可使用一个经验性的策略，其中互补寡核苷酸在核酸配体周围“步查(walk)”。依照该方法，可使用长度约15个核苷酸的寡核苷酸(例如2' -0-甲基或2’ -氟寡核苷酸)，其错开配体上的约5个核苷酸(例如与配体的1-15、6-20、11-25等互补的寡核苷酸)。经验性的策略特别有效，因为核酸配体三级结构对杂交效率的影响可能难以预测。在以下实施例中描述的测定可用于评价不同寡核苷酸与特异性核酸配体杂交的能力，尤其强调要达到与核酸配体完全结合，需要寡核苷酸摩尔过量。也可通过进行标准动力学研究，使用例如BIAC0RE测定，来确定不同寡核苷酸调节剂提高核酸配体与其靶分子的解离速率或配体与其靶分子的缔合速率的能力。可选择寡核苷酸调节剂，使得需要5-50 倍摩尔过量的寡核苷酸或更少，以便以所需方式修饰配体与其靶分子间的相互作用。备选地，靶向核酸配体可经修饰，使其包含单链尾(3'或5')，以促进与寡核苷酸调节剂的缔合。合适的尾可包含1-20个核苷酸、1-10个核苷酸、1-5个核苷酸或3-5个核苷酸。尾也可经修饰(例如2’ -0-甲基和2’ -氟代修饰，其可包含2’ -0-甲基胞嘧啶、 2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷、2’ -0-甲基鸟苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷)。可在结合和生物测定(例如以下实施例所述)中测试加尾配体，以证实单链尾的加入未破坏核酸配体的活性结构。可设计出可与尾序列形成例如1、2、3、4或5碱基对的一系列寡核苷酸(例如2' -0-甲基寡核苷酸)并测试它们单独与加尾配体缔合的能力，以及它们提高配体与其靶分子的解离速率或配体与其靶分子的缔合速率的能力。可使用错义序列(scrambled sequence)对照以证实作用是因为双链体形成而不是非特异性作用。在另一个实施方案中，调节剂是核酶或DNA酶。酶核酸通过首先与靶RNA或DNA 结合而起作用。这样的结合是通过酶核酸的靶结合部分而发生的，所述部分与可起到切割靶RNA的作用的分子的酶部分紧密接近。因此，酶核酸通过互补碱基配对先识别再结合靶 RNA或DNA，而且一旦结合正确位点后，起到酶促作用，以切割靶RNA，因而允许RNA配体失活。有至少5类核酶，其各自显示不同类型的特异性。例如，I组内含子的大小是约300至 > 1000个核苷酸并且在紧接切割位点的5'的靶序列中需要U并且在切割位点的5'侧与 4-6个核苷酸结合。另一类是RNaseP RNA(Ml RNA)，其大小为约四0_400个核苷酸。第3 类是锤头核酶，其大小为约30-40个核苷酸。它们在紧接切割位点的5'需要靶序列UH(其中H不是G)并且在切割位点两侧与不同数量的核苷酸结合。第4类是发夹核酶，其大小为约50个核苷酸。它们在紧接切割位点的3'需要靶序列GUC并在切割位点的5'侧与4个核苷酸结合并且在切割位点的3'-侧与不同数量结合。第5组是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小为约60个核苷酸。DNA酶是单链的并且切割RNA和DNA 二者。已经提出了 DNA 酶的一般模型，其被称为“10-23”模型。遵循“10-23”模型的DNA酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，其侧翼连接各自具有7-9个脱氧核糖核苷酸的两个底物识别结构域。在另一个实施方案中，调节剂本身是核酸配体。在该实施方案中，产生与所需治疗靶标结合的第1配体。在第2步骤中，使用本文所述的SELEX方法或另一方法，产生与第1 配体结合的第2配体，并且其调节治疗性配体与靶标间的相互作用。在一个实施方案中，第 2配体使第1配体的作用失效。在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于PNA、MNA、LNA或PCO的调节剂。本发明寡核苷酸调节剂的核酸碱基(NuclecAase)可通过核酸碱基间键而连接，所述键例如肽键(例如在肽核酸(PNA)的情况下；Nielsen等(1991) Science 254，1497和美国专利号 5，539，082)和吗啉代键(Qin 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10,11(2000)； Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,187(1997) ；Summerton 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,63(1997) ；Taylor 等，J Biol Chem. 271,17445 (1996)； Partridge 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6，169 (1996))，或通过任何其他天然的或经修饰的键。寡核苷酸碱基(oligonucleobase)还可以是锁定核酸(LNA)。Nielsen等，J Biomol Struct Dyn 17,175(1999) ；Petersen 等，J Mol Recognit 13,44(2000) ；Nielsen 等，Bioconjug Chem 11,228(2000) PNA是类似于寡核苷酸、但组成不同的化合物。在PNA中，寡核苷酸的脱氧核糖主链被肽主链取代。肽主链的各亚基与天然存在的或非天然存在的核酸碱基连接。PNA通常具有由N-(2-氨基乙基)甘氨酸单位组成的非手性聚酰胺主链。嘌呤碱基或嘧啶碱基通过亚甲基羰基接头(1-3)与各单位连接，以靶向互补核酸。PNA按照Watson-Crick碱基配对原则以平行或反向平行方向与互补RNA或DNA结合。与天然同型双链体相比，PNA寡聚体不带电荷的特性增强了杂合PNA/DNA(RNA)双链体的稳定性。吗啉代核酸如此命名，是因为它们从吗啉代亚基装配而来，其各自含有与6元吗啉环连接的4种遗传碱基(腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)中的一个。这4种亚基类型的18-25个亚基通过非离子型磷酸二酰胺(phosphorodiamidate)的亚基间键以特定顺序相连，得到吗啉代寡聚物。LNA是一类DNA类似物，其具有可使其成为本发明调节剂的首要候选者的某些特性。LNA单体是结构类似于RNA单体的双环化合物。LNA与DNA和RNA共享大部分化学性能， 它是水溶性的，可以经凝胶电泳分离、乙醇沉淀等(Tetrahedron，54，3607-3630 (1998))。然而，将LNA单体引入DNA或RNA寡聚物中，导致具有互补DNA或RNA的双链体具有高的热稳定性，同时又服从Watson-Crick碱基配对原则。假环状寡核苷酸碱基(PCO)也可用作本发明的调节剂(参见美国专利号 6，383，752)。PCO含有通过其3' -3'或5' -5'端连接的2个寡核苷酸区段。PCO的区段之一(“功能性区段”)具有某些功能性(例如与靶RNA互补)。另一区段(“保护性区段”)与功能性区段的3'-或5'-末端互补(取决于通过其与功能性区段连接的末端)。
21由于功能性区段与保护性区段间的互补性，在靶核酸(例如RNA)不存在时，PCO构成分子内假环状结构。PCO比常规寡核苷酸更稳定，因为存在3' -3'或5' -5'键并形成分子内假环状结构。在小鼠中进行的药物动力学、组织分布和稳定性研究表明，PCO与PS-寡核苷酸相比一般具有更高的体内稳定性，以及类似的药物动力学和组织分布特征，但从所选组织中快速消除。当荧光团和猝灭剂分子与本发明的PCO适当连接时，如果所述分子呈线状构型则会发荧光，但呈环状构象时荧光就会被猝灭。该特性可用于筛选PCO作为潜在调节剂。在另一个示例性的实施方案中，调节剂是基于肽的调节剂。基于肽的核酸配体调节剂代表了寡核苷酸或其类似物的调节剂的一类备选分子。如果靶核酸配体的足够活性的寡核苷酸调节剂因缺乏足够的单链区而不能促进靶标与寡核苷酸调节剂间成核，因而无法分离，那么这类调节剂就特别有用。另外，与寡核苷酸调节剂相比，肽调节剂提供不同的生物利用度和药物动力学。在一个示例性的实施方案中，调节剂是鱼精蛋白(Oney等，2009， Nat. Med. 15 :1224-12 )。鱼精蛋白是水溶性的，受热不凝结，并且含有精氨酸、丙氨酸和丝氨酸(大部分还含脯氨酸和缬氨酸而且许多含甘氨酸和异亮氨酸)。调节剂也包括鱼精蛋白变体(参见例如Wakefield等，J. Surg. Res. 63 :280(1996))和鱼精蛋白的修饰形式，包括美国公开号20040121443中描述的那些。其它调节剂包括鱼精蛋白片段，例如美国专利号6，624，141和美国公开号20050101532中描述的那些。调节剂通常也包括调节肝素活性的肽、其它糖胺聚糖或蛋白聚糖(参见例如美国专利号5，919，761)。在一个示例性的实施方案中，调节剂是含有阳离子-NH基团并能稳定电荷-电荷相互作用的肽，例如聚-L-赖氨酸和聚-L-鸟氨酸。可使用若干策略以分离能结合并因此调节靶核酸配体活性的肽。例如，已经描述了固定在珠上的编码肽组合文库，并已证明其中含有能结合病毒RNA序列并破坏病毒RNA 与病毒调节蛋白间相互作用的肽，所述病毒调节蛋白与所述RNA特异性结合(Hwang等， Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999,96 :12997) 使用这样的文库，核酸配体调节剂可如下分离通过给靶核酸配体挂上标记并在有利于文库的某些成员与核酸结合的条件下将带标记的靶标与固定在珠上的肽文库一起温育。核酸配体与给定珠上的特异性肽结合，使该珠通过核酸配体上的标记而“着色”，因此使能够通过简单的珠分离而鉴定出能与靶标结合的肽。使用描述用于鉴定核酸配体调节剂的多种结合测定，可以证实经这类筛选方法所分离出的肽与靶核酸配体之间的直接相互作用并对其进行定量测定。可通过合适的生物测定， 证实所述肽调节靶核酸配体活性的能力。在一个另外的实施方案中，调节剂是基于寡糖的调节剂。寡糖可与核酸相互作用。 例如，氨基糖苷类抗生素是链霉菌(Streptomyces)的产物并与多种RNA分子(例如各种核酶、核糖体的RNA组分以及HIV-I的TAR和RRE序列)特异性相互作用。因此寡糖可与核酸结合并可用于调节核酸配体活性。在另一个实施方案中，调节剂是基于小分子的调节剂。插入配体与靶标之间或者以其它方式破坏或改变配体与靶标之间结合的小分子也可用作治疗调节剂。通过在有或无小分子时在测定配体与靶标之间结合改变的测定中筛选候选者，或者通过使用测定在有或无小分子时配体对靶标的生物学作用的差异的体内或体外测定，就可以鉴定这样的小分子。一旦鉴定了表现出所需作用的小分子后，组合方法等技术就可用于优化用于所需调节作用的化学结构。在再一个示例性的实施方案中，调节剂是核酸结合聚合物、脂质、纳米粒或微球体。在再一些非限制性实例中，调节剂可选自1，2-二油酰-Sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱 (EDOPC) ；二月桂酰乙基磷脂酰胆碱(EDLPC) ；EDLPC/ED0PC ；吡啶鐺表面活性剂；二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE) ； (士)-N- (3-氨基丙基)-N，N- 二甲基-2，3- 二(十二烷氧基)丙基溴化铵(GAP-DLRIE)加中性辅脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) (GAP-DLRIE/D0PE) ； (士)_N， N-二甲基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-2，3-二(二油酰氧基-1-propaniminium petahydrochloride (DOSPA) ；二月桂酰乙基磷脂酰胆碱(EDLPC)；乙基二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(EDMPC) ； (士)-N，N，N-三甲基-2，3-二(ζ-十八-9-烯-酰氧基(oyloxy))-I-丙基氯化铵(DOTAP) ； (士)-N-2-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)丙基溴化铵(DMRIE) ； (士)-N，N，N-三甲基-2，3-二(ζ-十八-9-烯氧基)-1-丙基氯化铵(DOTMA)； 5-羧基精胺基甘氨酸双十八烷基-酰胺(D0GQ ；二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺5-羧基精胺基酰胺(DPPEQ ；1，3 二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基-酰胺基(DOSPER)；四甲基四棕榈酰基精胺(TMTPQ ；(四甲基四油酰基精胺(TMTOQ ；四甲基四月桂基精胺(TMTLS)； 四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMQ ；四甲基二油基精胺(TMD0Q ；二植烷酰基磷脂酰-乙醇胺 (DPhPE)；和(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷氧基)丙基溴化铵 (GAP-DLRIE)。在其它实施方案中，调节剂选自脱乙酰壳多糖；脱乙酰壳多糖衍生物；1，5_ 二甲基-1，5-二氮杂十一亚甲基聚甲溴化物；聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物；聚-L-赖氨酸； 聚酰胺基胺(PAMAM)；含β-环糊精的聚阳离子(CDP)；含β-环糊精的聚阳离子(含咪唑的变体)(CDP-Im)；聚氨基磷酸酯聚合物(8kDa，30kDa) (PPA-DPA 8k，PPA-DPA 30k)；聚凝胺(polybrene)；精胺；PEG-嵌段-PLL-树状聚合物；聚乙烯亚胺(PEI)；甘露糖-PEI ；转铁蛋白-PEI ；线状(Iinera)-PEI(IPEI)；明胶；甲基丙烯酸/甲基丙烯酰胺；聚(β -氨基酯)；聚电解质复合物(PEC)；聚(乙烯胺)(PVA)；胶原；聚丙烯亚胺(PPI)；聚丙烯胺；聚乙烯吡啶；氨基缩醛化聚(乙烯醇)；丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物；Newkome树状聚合物；聚亚苯基；二甲基双十八烷基溴化铵(DAB)；十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)；白蛋白；经酸处理的明胶；聚赖氨酸；聚鸟氨酸；聚精氨酸；DEAE-纤维素；DEAE-葡聚糖；和聚(N，N- 二甲氨基乙基甲基丙烯酸)；和聚丙胺(POPAM)。在一个实施方案中，调节剂选自脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物。脱乙酰壳多糖衍生物包括水溶性脱乙酰壳多糖纳米粒(例如以下文献所述美国专利号6，475，995 ； 美国专禾Ij 申请号 2006/0013885 ；Limpeanchob 等(2006) Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles ；Nareusan University Journal 14(2) 27-34)。给定脱乙酰壳多糖聚合物(本质上是由重复葡糖胺单体组成的非常大的聚胺聚合物)的聚阳离子特性，脱乙酰壳多糖可用于在注入宿主之后在体内将配体聚集和/或包入聚电解质复合物中。这部分是基于脱乙酰壳多糖上存在的伯胺与配体的磷酸二酯主链的相互作用。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖聚合物上的伯胺可被充分修饰，以改变水溶性和电荷状态。脱乙酰壳多糖衍生物包括三甲基脱乙酰壳多糖氯化物(TMC)，其可在不同季铵化程度下合成；一羧基甲基化脱乙酰壳多糖(MCC)，其是聚两性电解质聚合物；戊二醛交联的衍生物(CSGA)；硫醇化脱乙酰壳多糖(Lee等(2007)Pharm. Res. 24:157-67) ；二醇脱乙酰壳多糖(GC)，一种与乙二醇缀合的脱乙酰壳多糖衍生物(Lee等J Pharm.)； [N-(2-羧基苄基)脱乙酰壳多糖(CBCS) (Lin 等(2007)Carbohydr Res. 342(1) :87-95)； β-环糊精-脱乙酰壳多糖聚合物(Venter，等(2006) Int J Pharm. 313(1-2) :36-42)； 0-羧基甲基脱乙酰壳多糖；N，0-羧基甲基脱乙酰壳多糖；或通过将黄原酸酯基引到其主链上而进行化学修饰的脱乙酰壳多糖。在一个实施方案中，产生空的脱乙酰壳多糖纳米粒并用作调节剂。可使用分子量范围为10，OOODa至> 1，000, OOODa的脱乙酰壳多糖或脱乙酰壳多糖衍生物。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖是500，OOODa或更小。在某些实施方案中，脱乙酰壳多糖是100，OOODa 或更小。在某些实施方案中，所述化合物介于10，000和100，OOODa之间、介于10，000和 90，000之间、介于10，000和80，000之间、介于20，000和70，0000之间、介于30，000和 70，000 之间、约 30，000、约 40，000、约 50，000 或约 60，OOODa0在某些实施方案中，使用含有不同程度脱乙酰化伯胺的脱乙酰壳多糖聚合物。在这些实施方案中，不同脱乙酰化程度改变了聚合物的电荷状态并因此改变聚合物的结合性能。一旦脱乙酰壳多糖纳米粒与宿主中的配体接触之后，配体可与纳米粒表面结合并被捕获在其上，或进入纳米粒并因离子相互作用而被包入。在另一个实施方案中，调节剂是聚磷酸聚合物微球体。在某些实施方案中，调节剂是这样的微球体的衍生物，例如聚(L-丙交酯-共-亚磷酸乙酯)或P(LAEG-EOP)等，如美国专利号6，548, 302所述。可制备这样的聚合物，使其含有各种各样的官能团作为聚合物主链的组成部分。在一个实例中，聚合物可含有在生理PH下带正电荷的季胺，使得它们在与一个或多个核酸接触后可与之复合或将其包入。在某些实施方案中，聚合物不含正电荷。本发明也提供鉴定核酸GPVI配体调节剂的方法。通常可通过结合测定、分子建模或者测定生物学功能改变的体内或体外测定来鉴定调节剂。在一个实施方案中，通过凝胶迁移测定(gel shift assay)来测定调节剂与核酸的结合。在另一个实施方案中，通过 BIAC0RE测定来测定调节剂与核酸配体的结合。标准结合测定可用于鉴定和选择本发明的调节剂。非限制性实例是凝胶迁移测定和BIAC0RE测定。也就是说，可在试验条件或典型生理条件下使试验调节剂与待靶向的核酸配体接触，并确定试验调节剂是否真的与配体结合。再在合适生物测定(其因配体及其靶分子的不同而异，例如凝结试验)中分析被发现与核酸配体结合的试验调节剂，以确定试验调节剂是否能影响配体对其靶分子所引起的生物学作用。凝胶迁移测定是众所周知的用于评价结合能力的技术。例如，先将含有试验序列的DNA片段与试验蛋白或含有推定结合蛋白的混合物一起温育，再通过凝胶电泳在凝胶上分离。如果DNA片段与蛋白结合，它的尺寸就会比较大，因此其迁移就比游离片段更迟缓。 例如，电泳凝胶迁移率迁移测定的一个方法可以是(a)在合适条件下在混合物中使核酸结合蛋白与包含分子探针的非放射性或放射性标记的核酸分子接触，以促进正形成复合物中的蛋白与核酸间的特异性结合相互作用，其中所述探针选自dSDNA、SSDNA和RNA;(b)将混合物电泳；和(c)通过检测复合物中的非放射性或放射性标记而检测与膜结合的复合物。BIAC0RE技术测量传感器芯片表面上的结合事件，使得与表面连接的相互作用物确定分析特异性。测试相互作用的特异性包括简单分析不同分子是否可与固定化的相互作用物结合。结合使表面等离子共振(surface ρlasmon resonance, SPR)信号立即发生变化，使得相互作用是否发生直接显而易见。基于SPR的生物传感器通过测定接近表面的生物分子的质量浓度而监测相互作用。通过连接相互作用伴侣之一使表面具特异性。含有其它伴侣的样品流过表面当来自样品的分子与连接在表面上的相互作用物结合时，局部浓度变化并测得sra响应。该响应与同表面结合的分子质量直接成比例。当光在某些条件下在不同折射率的两种介质的界面上从传导膜反射时，产生SPR。 在BIAC0RE技术中，介质是样品和传感器芯片的玻璃，而传导膜是芯片表面上的金薄层。 SI^R在特定反射角引起反射光强度降低。该角度随接近反射光相对侧表面的折射率不同而变化。当样品中的分子与传感器表面结合时，表面处的浓度改变和因此折射率改变，并检测 SPR响应。将响应针对相互作用过程期间的时间来作图，提供对相互作用过程的定量度量。 BIAC0RE技术测定最小反射光强度的角度。光不被样品吸收而是光能通过金膜中的SI^R而耗散。sra响应值用共振单位(RU)来表示。1 RU代表强度最小角度的0.0001°的变化，对于大部分蛋白质，这大致等于在传感器表面上的约lpg/rnm2的浓度改变。RU与表面浓度间的准确转换因子取决于传感器表面性能和造成浓度改变的分子的特性。有许多其它测定可测定寡核苷酸或其类似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能与配体结合，其结合方式使得改变与靶标的相互作用。例如，电泳迁移率迁移测定(EMSA)JfS 量热术、闪烁亲近测定、使用分析用超速离心的沉降平衡测定(参见例如靈cores. Utah, edu/interaction)、荧光偏振测定、荧光各向异性测定、荧光强度测定、荧光共振能量转移 (FRET)测定、硝基纤维素滤膜结合测定、ELISA、ELONA(参见例如美国专利号5，789，163)、 RIA或平衡透析测定都可用于评价试剂与核酸配体结合的能力。可以进行直接测定，其中直接测定试剂与核酸配体间的相互作用；或者可以进行竞争测定或置换测定，其中测定试剂将配体从其靶标置换的能力(例如参见Green，Bell和Janjic，Biotechniques 30(5)， 2001，第1094页和美国专利号6，306，598)。一旦鉴定候选调节剂后，就可在生物测定中证实其调节核酸配体对其靶标的活性的能力。备选地，如果试剂被鉴定为可调节配体与其靶标的相互作用，那么这样的结合测定可用于证实该试剂与配体直接相互作用并可测定所述相互作用的亲和力。在另一个实施方案中，质谱可用于鉴定与核酸配体结合的调节剂、调节剂与核酸配体间相互作用位点和试剂对配体的相对结合亲和力(参见例如美国专利号6，329，146)。 这样的质谱方法也可用于筛选化学混合物或文库，尤其是组合文库，用于筛选出与所选靶配体结合的各个化合物，其可用作配体调节剂。此外，质谱技术可用于针对例如化合物的组合文库同时筛选多个靶核酸配体。此外，质谱技术可用于鉴定多个分子物类(尤其是“小” 分子)与靶配体上分子相互作用位点间的相互作用。评价调节剂在改变核酸配体与靶标间相互作用中的有效性的体内或体外测定对于待治疗的疾病是特异性的。有许多标准测定用于生物学特性，所述测定是众所周知的并可使用。生物学测定的实例在本申请中所引用的专利中提供，其描述了某些核酸配体用于特定应用。在某些实施方案中，调节剂是小分子。例如，在某些实施方案中，核酸配体与生物素分子连接。在这样的情况下，给予链霉抗生物素或抗生物素蛋白，以结合和逆转配体的作用(参见 Savi 等.J Thrombosis and Haemostasis，6 :1697-1706)。抗生物素蛋白是鸟类、 爬行类和两栖类输卵管中产生的四聚体蛋白，其沉积在它们的卵白中。链霉抗生物素是从细菌阿维丁链霉菌(Sti^ptomyces avidinii)中纯化的四聚体蛋白。该四聚体蛋白含有4 个相同的亚基(同型四聚体)，其各自可以高度亲和力和特异性与生物素(维生素B7、维生素H)结合。在某些实施方案中，调节剂是阳离子型分子。在某些实施方案中，配体形成鸟嘌呤四联体(quartet) (G_四联体或G-四链结构(quadruplex))结构。这些结构为阳离子型分子所结合。在某些实施方案中，所述分子是金属螯合分子。在某些实施方案中，调节剂是卟啉。在某些实施方案中，化合物是TMPyP4。参见Joachimi等.JACS 2007，129，3036-3037 和 iToro 等· Analytical Biochemistry 2008，8 月 1 日，379 ⑴ 8-15。在一个实施方案中，在小于10. O微摩尔浓度(uM)、1. O微摩尔浓度(uM)、优选小于0. IuM和更优选小于0. OluM的调节剂浓度下，调节剂在溶液中具有与核酸配体充分结合的能力。“充分”是指在靶标存在下通过调节而观察到靶生物活性至少降低50%，并且降低 50%在本文中称为IC5tl值。F.优化配体和调节剂为了使配体适合用作治疗药，优选配体合成便宜，在宿主中使用安全并且在体内稳定。野生型RNA和DNA寡核苷酸在体内通常都不稳定，因为它们对核酸酶的降解敏感。通过在2'-位掺入修饰基团可极大地提高对核酸酶降解的抗性。可将2’ -氟代或氨基基团掺入到寡核苷酸池中，随后从中选择配体。在本说明书中，在体外转录反应中使用2’-氟嘧啶以产生最初的寡核苷酸池，用于配体选择(参见实施例1)。然而，选自在各嘌呤位置上含有2’ -羟基糖的这类文库的所得配体，虽然因此在体内比类似RNA或DNA配体更稳定，但是需要另外优化。因此，随后经各种方式对用本文所述方法鉴定的配体进行修饰，以获取功能和稳定性增强且用于大规模制备工艺的可行性增加的配体。在最初鉴定配体(通过例如SELEX)和调节剂(例如根据序列互补性设计)之后， 可经各种方式对配体和调节剂进行修饰或工程改造，以改进它们的所需结构、功能和/或稳定性。这些包括但不限于取代特定糖残基，改变配体中特定区域和/或结构的组成和大小，并且设计可被调节剂更有效调节的配体。核酸配体的设计和优化包括评价配体的二级结构以及二级结构与调节剂控制之间的关系。与修饰核酸的常规方法不同，设计针对GPVI蛋白的配体可包括考虑改变配体对潜在调节剂设计的影响。如果配体通过例如截短而被修饰，那么相应调节剂应当设计为控制截短的配体。可通过本领域普通技术人员已知的各种方法，对通过SELEX方法鉴定的配体二级结构进行预测。例如，可用以下软件程序来分析各序列例如Mfold(mfold.bioinfo.rpi. edu ；另见 Zuker，2003，Nucleic Acids Res. 31 :3406-3415 和 Mathews 等，1999，J. Mol. Biol. 288 :911-940)。随后，可使用不同所选序列的比较序列分析，根据保守共有二级结构元件比对序列，以达到预测GPVI配体的二级共有结构(参见实施例2)。例如上述分析允许设计并测试通过SELEX获得的序列变体，以产生功能和稳定性增强的配体。可通过改变配体总长度以及茎和环结构的长度，修饰本发明的GPVI核酸配体。例如，可产生配体截短，其中在SELEX方法中所选的配体的5’和/或3’端的部分缺失。为了测定配体所能耐受的截短程度，所用的一个方法可以是加热退火与配体5’或3’端区域互补的寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸)，然后比较有或无退火寡核苷酸的配体的结合。如果有或无退火寡核苷酸的配体之间未观察到显著的结合差异，那么这表明配体的退火部分并非配体与靶蛋白结合所必需的。可使用与不同长度的配体5’或3’端退火的寡核苷酸来进行该方法，以测定提供完整功能性配体的5’和3’边界。在另一个实施方案中，设计包括降低配体大小。在另一个实施方案中，与配体大小相关地改变调节剂的大小。在又一个实施方案中，将鸟嘌呤串减少至小于4个鸟嘌呤，或小于3个鸟嘌呤，或小于2个鸟嘌呤或无鸟嘌呤。然而，这些改变的联合效果必需满足产生配体的挑战，所述配体提供足够的活性但又容易被调节剂所中和。对于调节剂的靶向，也可修饰改进的配体，使其包含单链尾(3'或5')，以促进与寡核苷酸调节剂的缔合。合适的尾可包含Int至20nt，优选Int至IOntUnt至5nt或 3nt至5nt。容易理解，这样的尾可包含经修饰的核苷酸，如下文将会更详细描述的那样。可在结合和生物测定(例如下文所述)中测试加尾配体，以证实单链尾的加入未破坏配体的活性结构。可设计出可与尾序列形成例如1、3或5碱基对的一系列寡核苷酸 (例如2' -0-甲基寡核苷酸)，并测试它们单独与加尾配体缔合的能力，以及它们提高配体与其靶分子的解离速率或缔合速率的能力。可使用错义序列对照以证实作用是因为双链体形成而不是非特异性作用。对共有结构的测定也有助于配体的工程改造，以鉴定可增强或降低配体结构和功能的一个或多个核苷酸。例如，可更有效地鉴定和测试特定茎和环结构的核苷酸添加、缺失和取代(参见实施例3)。对共有二级结构的知识也使我们能够避免可能对配体结构和功能不利的修饰。例如，某些修饰在共有二级结构内可能是保守的，例如茎或环区内的2’ -氟代。在这些情况下，从配体的茎或环中除去2'-氟代可导致活性丧失。在某些实施方案中，配体是选自表1-7的核酸分子，包括其截短的和基本同源的序列。如本文所用，就同源区而言，“基本同源的”序列是通过Watson-Crick碱基配对在特定分子内形成相同二级结构的序列。在某些实施方案中，如果序列与指定配体共享至少80 %、 85%或更高序列同一性，例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 序列同一性时，则序列是“基本同源的”。就指定长度(例如50个或更少核苷酸)的核酸配体而言，在允许Watson-Crick结合而形成相同二级结构的任何区域内可找到同源序列，无论该指定区域内序列同一性如何。配体也可经设计而具有自杀位置，其允许配对的调节剂更有效的调节。一旦调节剂与配体结合，自杀位置就变为单链并且不稳定，因此利于由天然存在于血液中的酶(例如血液或肝脏的内切核酸酶)对配体的切割。这提供了从循环中有效且基本上是立即消除活性配体的方式。化学修饰在核酸的治疗用途中遇到的一个问题是，呈其磷酸二酯形式的寡核苷酸在表现所需作用之前，在体液中可被胞内和胞外酶(例如内切核酸酶和外切核酸酶)快速降解。核酸配体的某些化学修饰可提高核酸配体的体内稳定性或者增强或介导核酸配体的递送。另夕卜，某些化学修饰可通过稳定或促进核酸配体内所需结构元件的形成或者提供与靶分子的另外的分子相互作用而增强核酸配体对其靶标的亲和力。配体的修饰可包括但不限于提供化学基团的修饰，其向核酸配体碱基或向作为整体的配体掺入额外电荷、极化率、疏水性、氢键、静电相互作用和官能度。这样的修饰包括但不限于2'-位的糖修饰、5-位的嘧啶修饰、8-位的嘌呤修饰、在环外胺上的修饰、4-硫代尿苷的取代、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的取代、主链修饰、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修饰、甲基化、不常见的碱基配对组合(例如异碱基(isobase)异胞苷(isocytidine)和异胍 (isoguanidine))等。修饰也可包括3'修饰和5'修饰，例如加帽。SELEX方法包括鉴定含有修饰核苷酸的高亲和力核酸配体，修饰核苷酸赋予配体改进的特性，例如改进的体内稳定性或改进的递送特性。这类修饰的实例包括在核糖和/ 或磷酸和/或碱基位置上的化学取代。经SELEX鉴定的含有经修饰核苷酸的核酸配体描述于美国专利号5，660，985，其描述了含有在嘧啶的5-位和2'-位上进行化学修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利号5，580，737描述了含有经2'-氨基O' -NH2), 2'-氟代议-F)和/或2' -0-甲基议-OMe)修饰的一个或多个核苷酸的特异性核酸配体。 美国专利号5，756，703描述了含有不同2'-修饰嘧啶的寡核苷酸。SELEX方法包括将所选寡核苷酸与其它所选寡核苷酸和非寡核苷酸功能性单元组合起来，如美国专利号5，637，459和5，683，867所述。美国专利号5，637，459描述了含有经 2'-氨基O' -NH2),2'-氟代O' -F)和/或2' -0-甲基O' -OMe)修饰的一个或多个核苷酸的高度特异性核酸配体。SELEX方法还包括将所选核酸配体与亲脂性或非免疫原性的高分子量化合物组合在诊断用或治疗用复合物中，如美国专利号6，011，020所述。如果核酸配体经SELEX方法得到，那么修饰可以是SELEX前或后的修饰。SELEX前修饰可得到对其靶标具有特异性且具有改进的体内稳定性的配体。对2'-羟基(2’-0H) 核酸配体进行的SELEX后修饰可导致改进的体内稳定性，而不有害地影响核酸配体的结合能力。在一个实施方案中，配体的修饰包括在分子的3'端的3' -3'反向磷酸二酯键，以及某些或所有核苷酸的2'氟代O' _F)、2'氨基O' -NH2)、2’脱氧和/或2' 0甲基 (2' -OMe)修饰。本文所述的配体首先通过SELEX使用转录物文库而产生，所述文库中C残基和U 残基是2’ -氟取代的，而A残基和G残基是2’ -OH取代的。尽管这样的修饰产生适于筛选的配体分子，但是高2’羟基含量却使它们并不适于作为药物开发候选者，这是因为以下事实这些位置对体内核酸酶降解非常敏感，限制了胃肠外给予之后所能达到的最大浓度以及它们的循环半衰期。因此，一旦例如通过SELEX方法鉴定了功能性序列后，就可通过评价取代对配体结构、功能和稳定性的影响来测试单个残基对这些取代的耐受性。在某些实施方案中，组成配体的核酸包含经修饰的糖和/或经修饰的碱基。在某些实施方案中，修饰包括稳定化修饰，例如2’ -稳定化修饰。在一个实施方案中，2’ -稳定化修饰可包括在糖环上的2’ -氟代、2’脱氧或2’ -0-甲基修饰。在一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或这两者的2'-羟基含量。在另一个实施方案中，设计包括降低配体或调节剂或这两者的2’ -氟含量。在另一个实施方案中，设计包括提高配体或调节剂或这两者的2’ -0-甲基含量。寡核苷酸可包含至少一个经修饰的碱基部分，其选自包括但不限于以下的碱基部分5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5_(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基硫代尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、Ν6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2， 2- 二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2 α-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν&异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸、怀丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基)和2，6_ 二氨基嘌呤。本文所述的配体和调节剂的寡核苷酸可包含经修饰的糖基，例如，一个或多个羟基被卤素、脂族基团置换或官能化为醚或胺。在一个实施方案中，呋喃糖残基的2'-位被 0-甲基、0-烷基、0-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或卤基中的任何一个取代。在另一个实施方案中，本发明的核酸配体或调节剂可包含至少一个选自包括但不限于以下的经修饰的糖部分阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖、己糖、2'-氟代核糖、2' -0-甲基核糖、2' -0-甲氧基乙基核糖、2' -0-丙基核糖、2' -0-甲巯基乙基核糖、2' -0-二乙氨基氧乙基核糖、 2' -0-(3-氨基丙基)核糖、2' -0-( 二甲氨基丙基)核糖、2' -0-(甲基乙酰氨基)核糖和2' -0-( 二甲氨基乙氧基乙基)核糖。配体或调节剂可包含至少一个选自包括但不限于以下的经修饰的磷酸主链硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。还可通过用更稳定的环结构取代一个或多个核酸环结构，进一步稳定包含茎和环结构的配体分子，用于治疗用途。例如，对于本文所述的GPVI配体，发现用六甘醇间隔基取代环2，导致具有类似亲和力的GPVI配体和具有核苷酸基环的抗GPVI配体。图13A显示在合成中使用的用于六甘醇接头的起始亚磷酰胺。图13B显示当掺入到核酸配体的两个核苷酸之间时的六甘醇间隔基。在药物组合物中可提供配体，其形式例如改进溶解度或生物利用度的盐形式。本发明的任何寡核苷酸都可通过本领域已知的标准方法来合成，例如通过使用自动化DNA合成仪(例如可购自例如Biosearch，Applied Biosystems)。配体和修饰剂(modifier)在本文中用技术人员容易理解并记录如下的缩略语来描述“rA”是2' OH A或腺苷；“A”是2’-脱氧A或2’-脱氧腺苷；“mA”是2' -0-甲基A或2’-甲氧基-2’-脱氧腺嘌呤；“rG”是2' -OH G或鸟苷；“G”是2’ -脱氧G或 2’ -脱氧鸟苷；“mG”是2' -0-甲基G或2’-甲氧基-2’脱氧鸟苷；“fC”是2'-氟C或 2’-氟_2’脱氧胞苷；“mC”是2' -0-甲基C或甲氧基-2’-脱氧胞苷；“fU”是2'-氟 U或2’-氟-尿苷；“mU”是2' -0-甲基U或2’-甲氧基-尿苷；“iT”是反向2' H T, (C6L)是己基氨基接头；(6GLY)是六甘醇间隔基；(PEG40KGL2-N0F)是大约40kDa的支化 PEG(SUNBRIGHT 产品号GL2-400GS2)，(6FAM)是6-羧基荧光素；(s)是两个核苷酸间的硫代磷酸酯键。与载体偶联GPVI配体也可包含改进生物利用度或稳定性的修饰。这样的修饰可包括与可包含但不限于亲水性部分或疏水性部分的载体分子缀合。一个实例是与核酸序列缀合的聚乙二醇分子。与例如下文所述的聚合物缀合，可限制血浆区室的分布并增加循环半衰期。糖修饰，如上所述，可确保稳定性，但它们却不能保证核酸配体为治疗活性的足够药物动力学。在健康个体中，配体在IV注射的数分钟内就被从血浆中清除掉，可能是通过肾排泄。通过将配体与较大的大分子例如聚乙二醇(PEG)缀合，实现在注射后将完整配体保留在血液中达数小时至数日。通过将配体包埋在脂质体中，也可降低配体的血浆清除率。因此，在一个实施方案中，可将GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂与非免疫原性的高分子量化合物例如聚乙二醇(PEG)或其它水溶性药学上可接受的聚合物共价结合或以其它方式连接，所述聚合物包括但不限于聚氨基胺(PAMAM)；多糖例如葡聚糖；或聚噁唑啉 (ΡΟΖ)。GPVI核酸配体或GPVI配体调节剂可通过共价键与高分子量化合物缔合。当使用共价连接时，高分子量化合物可共价连接在配体或调节剂的多种位置上。在某些实施方案中， 配体或调节剂可包入脂质体内部，用于给予有需要的宿主。在一个实施方案中，将配体或调节剂与聚乙二醇(PEG)连接。可将聚乙二醇(PEG) 与生物活性化合物缀合，作为“惰性”载体以潜在地(1)延长化合物在循环中的半衰期，(2) 改变化合物的分布概况和/或C3)伪装化合物，从而降低其免疫原性潜力并保护其免遭酶促降解。可将配体或调节剂通过共价键与PEG分子连接。例如，可通过马来酰亚胺或乙烯基砜官能团将寡核苷酸配体或调节剂与5'-巯基连接。通常，活化PEG和其它活化的水溶性聚合物用适于与治疗药上的所需位点偶联的合适活化基团来活化。将这些聚合物与活性剂缀合的代表性聚合物试剂和方法是本领域已知的，并进一步描述于例如 Zalipsky，S.等，“Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides “载于 Polyethylene Glycol Chemistry Biotechnical and Biomedical Applications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)；和 Zalipsky，Advanced Drug Reviews, 1995,16 :157_182。这样的试剂也有市
佳口。例如，在一个用于制备酰胺连接的缀合物的方法中，使带有活化酯(例如NHS酯， 例如mPEG-琥珀酰亚胺基-α -甲基丁酸酯)的水溶性聚合物与活性剂的胺基反应，由此得到活性剂与水溶性聚合物之间的酰胺键。能与活性氨基反应的另外的官能团包括例如 N-羟基琥珀酰亚胺基酯、对硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亚胺基碳酸酯、醛、缩醛、N-酮-哌啶酮、马来酰亚胺、羰基咪唑、氮杂内酯类、环状酰亚胺硫酮、异氰酸酯、异硫氰酸酯、三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)和卤素甲酸酯等。在一个实施方案中，可将多个GPVI配体或GPVI配体调节剂与一个PEG分子缔合。 配体和调节剂可以是相同或不同的序列和修饰。在还一个实施方案中，可将多个PEG分子彼此连接。在该实施方案中，可将针对相同GPVI蛋白靶序列或不同GPVI蛋白序列靶标的一个或多个GPVI配体或GPVI配体调节剂与每个PEG分子缔合。在将对相同靶标具有特异性的多个配体或调节剂与PEG连接的实施方案中，有可能使相同靶标彼此紧密接近，以产生相同靶标之间的特异性相互作用。在将对不同靶标具有特异性的多个配体或调节剂与PEG 连接时，有可能使不同靶标彼此紧密接近，以产生靶标间的特异性相互作用。尽管用于亲水性部分(例如PEG分子)缀合的各种接头和方法是本领域技术人员众所周知的，但是以下仍提供了若干实施方案。在一个实施方案中，氨基接头，例如图14所示的C6己基氨基接头，即6-(三氟乙酰氨基)己醇O-氰基乙基-N，N-二异丙基)亚磷酰胺，可用于将己基氨基接头添加到合成寡核苷酸的5’端。以下描述了可用于将接头添加到合成寡核苷酸上的其它接头亚磷酰胺以下结构的TFA-氨基C4CED亚磷酰胺(可得自ChemGenes，目录号CLP-1453)
权利要求
1.一种包含第1分离的核酸序列的GPVI配体，其中所述GPVI配体与糖蛋白VI (GPVI) 结合，且所述GPVI配体包含二级结构，所述二级结构在5’ -3’方向上包含第1茎、第1环、 第2茎、第2环、第3环、第3茎和第4环；并且其中所述第4环包含UAA0
2.权利要求1的GPVI配体，其中所述第2环被间隔基取代。
3.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述第1核酸包含至少一个经修饰的核苷酸。
4.前述权利要求中任一项的GPVI配体，所述配体与载体缀合。
5.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述载体是亲水性部分。
6.前述权利要求中任一项的GPVI配体，其中所述亲水性部分是聚乙二醇(PEG)分子。
7.前述权利要求中任一项的GPVI配体，所述配体包含经修饰的磷酸主链。
8.权利要求1的GPVI配体，所述配体包含SEQID NO :69，其中间隔基掺入到SEQ ID NO 69的11位的2’ 0-甲基G与12位的2’ 0-甲基C之间。
9.权利要求8的GPVI配体，所述配体包含经修饰的磷酸主链。
10.权利要求8或9的GPVI配体，所述配体还包含聚乙二醇部分。
11.权利要求8-10中任一项的GPVI配体，其中所述GPVI配体选自RB569、RB570和 RB571。
12.包含前述权利要求中任一项的GPVI配体的药物组合物。
13.—种与GPVI配体特异性结合的调节剂， 其中所述调节剂包含第2核酸序列；和其中所述GPVI配体与糖蛋白VI (GPVI)结合；和其中所述GPVI配体包含包含二级结构的第1核酸序列，所述二级结构在5’ -3’方向上包含第1茎、第1环、第2茎、第2环、第3环、第3茎和第4环；并且其中所述第4环包含 UAA。
14.权利要求13的调节剂，其中所述第2核酸序列由约IOnt至约50nt组成。
15.包含权利要求13或14的调节剂的药物组合物。
16.包含SEQID NO 84的调节剂。
17.权利要求16的调节剂，其中所述调节剂是RB515。
18.包含权利要求13-17中任一项的调节剂的药物组合物。
19.治疗有效量的GPVI配体在治疗血小板介导的病症中的用途，所述用途包括给予有需要的宿主治疗有效量的GPVI配体。
20.权利要求19的用途，其中所述血小板介导的病症选自血管病症、脑血管疾病、血小板介导的炎性病症、糖尿病相关疾病或癌症。
21.权利要求20的用途，其中所述血管病症选自急性冠状动脉综合征、血栓形成、血栓栓塞、外周血管病和短暂性缺血发作。
22.权利要求20的方法，其中所述脑血管疾病选自短暂性缺血发作、缺血性发作和栓O
23.权利要求20的用途，其中所述血小板介导的炎性病症选自关节炎、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、反应性关节炎、炎性肠病、强直性脊柱炎和硬皮病。
24.权利要求20的用途，其中所述糖尿病相关疾病选自糖尿病性视网膜病、糖尿病性血管病、动脉粥样硬化、缺血性发作、外周血管病、急性肾损伤和慢性肾衰竭。
25.权利要求20的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、骨癌禾口肝癌。
26.GPVI配体在调节有需要的宿主中的血小板功能的用途，所述用途包括将有效量的所述GPVI配体给予所述宿主。
27.权利要求沈的用途，其中所述宿主正在接受心脏介入。
28.权利要求19-27中任一项的用途，所述用途还包括将调节剂给予所述宿主，其中所述调节剂与所述GPVI配体特异性结合。
全文摘要
本发明一般而言涉及调节血小板生物学的药理学系统，所述系统基于可与血小板糖蛋白GPVI结合并调整其活性以调节血小板功能的核酸配体。使用调节剂，这些核酸配体也是活性可逆的，所述调节剂抑制所述核酸配体的活性以中和该药理作用并因此恢复GPVI功能，包括胶原结合、血小板粘附、胶原诱导的血小板激活和胶原诱导的血小板聚集。本发明还涉及包含所述核酸配体的组合物、包含所述配体和调节剂的组合物，产生所述核酸配体及其调节剂的方法，并涉及在药物治疗和诊断过程中使用这些试剂和组合物的方法。
文档编号A61P9/10GK102459599SQ201080035295
公开日2012年5月16日 申请日期2010年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者C·P·鲁斯科尼, D·布鲁克斯, J·M·莱泽, S·L·泽伦科夫斯克 申请人:雷加多生物科学公司