化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用的制作方法
【专利摘要】本发明化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。本发明是通过计算机分析，筛选出HSV2病毒gE糖蛋白内的强抗原表位，第21个氨基酸至第414个氨基酸，共394个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成抗原表位的全新基因序列，利用基因工程技术，表达该基因片段、制备HSV2病毒gE糖蛋白的强抗原表位片段。表达的HSV2病毒gE糖蛋白的强抗原表位片段，可用于HSV2疫苗研制、抗体的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。
【专利说明】化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gE糖蛋白。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等，本发明涉及基因工程技术、疫苗和诊断试剂领域。
【背景技术】
[0002]单纯疱疫病毒(Herpers simplex virus, HSV)属于疱疫病毒科α亚科,是人类感染的常见病毒之一，根据血清型可分为I和II型两种。其中，I型主要通过口面部感染，也存在性传播，II型主要通过性传播，并且和女性宫颈癌的发生密切相关。近期越来越多的研究表明，HSV I对阿兹海默症的发生有关联，HIV的感染和HSV II也有联系。HSV在全球普遍流行，HSV I型在成人血清中阳性率高达85%以上，HSV II型全球血清阳性率约为20%，并且发病人数以每年25%速度增加。
[0003]HSV可在感染组织或附近部位繁殖形成原发病灶，并在三叉神经核脊神经建立终身的潜伏感染，当机体受到外界刺激或免疫力下降是，HSV病毒下行至表皮大量增殖，形成复发感染。HSV反复发作与HSV免疫逃逸相关，HSV通过躲避人体免疫系统的攻击实现潜伏感染和复发感染，因此HSV —旦感染，很难被清除，患者受到长期疾病折磨。
[0004]病毒糖蛋白(glycoproteins, gp)是病毒毒粒表面的抗原决定簇，目前已发现并正式命名的包膜糖蛋白共有12个(gB、gC、gD、gE、gG、gH、g1、gK、gL和gM等)。gB和gD糖蛋白参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，已被选作候选疫苗，对其研究较多。近年研究发现，gE2是免疫逃逸相关的包膜糖蛋白。HSV病毒包膜蛋白gE与IgG Fe端结合，从而阻断多个补体介导的免疫途径，使HSV病毒成功躲避机体的免疫系统攻击。因此他是造成病毒潜伏感染的蛋白分子之一。选取gE糖蛋白用于免疫机体，阻断病毒的潜伏感染，有希望成为理想的候选疫苗。
[0005]本发明通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达产物具有较好的抗原性和特异性，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等。
【发明内容】
[0006]本发明是化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区的全新基因片段，利用基因工程技术，制备重组HSV2病毒gE糖蛋白胞外区片段。通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区片段，第21个氨基酸一第414个氨基酸，共394个氨基酸，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达该基因。表达的蛋白可用于疫苗、HSV2病毒抗体或抗原的检测及用于免疫制备抗HSV2病毒单抗和多抗等。
[0007]本发明通过计算机分析，筛选出含强抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区片段，选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，利用基因工程技术表达，表达产物具有较好的抗原性和特异性，表达的蛋白可用于疫苗及HSV2病毒抗体或抗原的检测等。
[0008]化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段及其表达、应用是釆取以下步骤实现的:
1.HSV2病毒gE糖蛋白胞外区抗原表位的筛选及其基因片段的化学合成:
利用ANTHEWIN等软件，通过计算机分析HSV2病毒gE糖蛋白的氨基酸序列，发现gE糖蛋白的N端(第21氨基酸一第414氨基酸)含有较强的抗原决定簇。选择真核和原核生物均偏爱的密码子，化学合成全新的基因序列，并且在5’端增加了及^RI酶切位点(下划线部分)、起始密码子(ATG)、信号肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGITCAITCTGCC)，在3’ 端增加了His标记(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、终止密码子(TGA)取Himd III酶切位点(下划线部分)，使该基因片段易于克隆至质粒PMCE5内的及^RI和Himd III酶切位点内。
[0009]筛选的HSV2病毒gE糖蛋白内的抗原表位氨基酸序列(第21个aa —第414个aa):
【权利要求】
1.一种化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白的胞外区基因片段，该基因片段编码含强抗原表位的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区基因片段，即第21个氨基酸至第414个氨基酸，共419个氨基酸，在5’端增加了 AcoRI酶切位点(下划线部分)、起始密码子(ATG)、信号肽(GGCTGGAGCTGTATTATCCTGTTCCTGGTCGCCACTGCCACTGGAGTTCA TTCTGCC)，在 3’ 端增加了 His 标记(CAC CAC CAC CAC CAC CAC)、终止密码子(TGA)和历III酶切位点(下划线部分)，化学合成的基因序列全长1282 bp，序列如下:
GAATTC GCC GCC ACC ATG GGC TGG AGC TGT ATT ATC CTG TTC CTG GTC GCC ACT GCCACT GGA GTT CAT TCT GCC GCC CCT CGG ACA TCT TGG MA AGG GTG ACC AGC GGA GAG GATGTG GTC CTG CTG CCT GCA CCA GCT GAA AGG ACA CGA GCA CAC MG CTG CTG TGG GCA GCTGAG CCT CTG GAC GCA TGC GGT CCA CTG CGA CCA TCT TGG GTG GCC CTG TGG CCA CCT AGGCGG GTC CTG GAG ACC GTG GTC GAT GCA GCC TGT ATG AGA GCT CCC GAA CCT CTG GCA ATCGCC TAC TCT CCA CCC TTC CCA GCA GGC GAT GAG GGA CTG TAT AGT GAA CTG GCT TGG AGAGAC CGC GTG GCA GTG GTC AAC GAG TCC CTG GTC ATC TAC GGC GCC CTG GAA ACA GAT AGCGGA CTG TAT ACT CTG TCA GTG GTC GGA CTG TCC GAC GAG GCA CGA CAG GTG GCT TCC GTGGTC CTG GTG GTC GM CCA GCA CCA GTG CCT ACT CCA ACC CCA GAC GAT TAC GAC GAG GAAGAC GAT GCT GGC GTG ACT AAC GCA AGA CGC TCA GCC TTC CCT CCA CAG CCA CCT CCA AGGAGG CCC CCT GTG GCA CCA CCA ACC CAC CCA CGC GTC ATC CCA GAG GTG TCC CAC GTC CGAGGA GTG ACT GTC CAT ATG GAG ACC CTG GAA GCT ATT CTG TTC GCA CCT GGG GAA ACA TTTGGT ACT AAT GTG AGT ATC CAC GCT ATT GCA CAT GAC GAT GGA CCC TAT GCT ATG GAC GTGGTC TGG ATG CGA TTT GAT GTG CCT TCC AGC TGC GCC GAC ATG AGG ATC TAC GAG GCT TGTCTG TAT CAT CCT CAG CTG CCA GM TGC CTG TCC CCT GCC GAT GCT CCA TGT GCC GTG TCTAGT TGG GCC TAC CGA CTG GCT GTG CGT AGC TAT GCT GGC TGC TCT AGG ACC ACA CCT CCACCC CGG TGT TTC GCA GAG GCC AGA ATG GAA CCT GTG CCA GGA CTG GCT TGG CTG GCA AGTACA GTG AAC CTG GAG TTT CAG CAC GCA TCA CCA CAG CAT GCC GGG CTG TAC CTG TGC GTGGTC TAT GTG GAC GAT CAC ATC CAT GCC TGG GGT CAT ATG ACC ATT AGC ACA GCT GCA CAGTAC AGG AAT G CT GTG GTC GAG CAG CAC CTG CCA CAG CGT CAG CCA GAG CCT GTG GAA CCAACC CGC CCT CAT GTC AGA GCA CCC CAC CCC GCC CCT TCA GCC AGA GGA CCC CTG CGT CACCAC CAC CAC CAC CAT TGA TAAGCTT 。
2.权利要求1所述的化学合成的基因片段，采用基因工程技术表达该基因序列编码的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区基因片段，纯化表达的蛋白片段，具体方法如下: 表达HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区基因片段重组质粒的构建: 用I琳Himd III双酶切质粒pMCE5和化学合成的HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区基因片段，电泳回收后，用T4 DNA连接酶连接，使HSV2病毒的gE糖蛋白胞外区基因片段插入到载体PMCE5内的I热Himd III位点之间，与载体上的起始密码子翻译框架一致，表达一个融合蛋白，全长419个氨基酸，该融合蛋白N端融合了载体上的19个氨基酸，C端包含HSV2病毒的gE糖蛋白内的第21个氨基酸至第414个氨基酸及His标签(6个氨基酸)，全长419氨基酸序列如下:
Ala Ala Pro Arg Thr Ser Trp Lys Arg Val Thr Ser Gly Glu Asp Val Val Leu LeuPro Ala Pro Ala Glu Arg Thr Arg Ala His Lys Leu Leu Trp Ala Ala Glu Pro Leu AspAla Cys Gly Pro Leu Arg Pro Ser Trp Val Ala Leu Trp Pro Pro Arg Arg Val Leu GluThr Val Val Asp Ala Ala Cys Met Arg Ala Pro Glu Pro Leu Ala lie Ala Tyr Ser ProPro Phe Pro Ala Gly Asp Glu Gly Leu Tyr Ser Glu Leu Ala Trp Arg Asp Arg Val AlaVal Val Asn Glu Ser Leu Val He Tyr Gly Ala Leu Glu Thr Asp Ser Gly Leu Tyr ThrLeu Ser Val Val Gly Leu Ser Asp Glu Ala Arg Gln Val Ala Ser Val Val Leu Val ValGlu Pro Ala Pro Val Pro Thr Pro Thr Pro Asp Asp Tyr Asp Glu Glu Asp Asp Ala GlyVal Thr Asn Ala Arg Arg Ser Ala Phe Pro Pro Gln Pro Pro Pro Arg Arg Pro Pro ValAla Pro Pro Thr His Pro Arg Val He Pro Glu Val Ser His Val Arg Gly Val Thr ValHis Met Glu Thr Leu Glu Ala He Leu Phe Ala Pro Gly Glu Thr Phe Gly Thr Asn ValSer He His Ala He Ala His Asp Asp Gly Pro Tyr Ala Met Asp Val Val Trp Met ArgPhe Asp Val Pro Ser Ser Cys Ala Asp Met Arg lie Tyr Glu Ala Cys Leu Tyr His ProGln Leu Pro Glu Cys Leu Ser Pro Ala Asp Ala Pro Cys Ala Val Ser Ser Trp Ala TyrArg Leu Ala Val Arg Ser Tyr Ala Gly Cys Ser Arg Thr Thr Pro Pro Pro Arg Cys PheAla Glu Ala Arg Met Glu Pro Val Pro Gly Leu Ala Trp Leu Ala Ser Thr Val Asn LeuGlu Phe Gln His Ala Ser Pro Gln His Ala Gly Leu Tyr Leu Cys Val Val Tyr Val AspAsp His He His Ala Trp Gly His Met Thr He Ser Thr Ala Ala Gln Tyr Arg Asn AlaVal Val Glu Gln His Leu Pro Gln Arg Gln Pro Glu Pro Val Glu Pro Thr Arg Pro HisVal Arg Ala Pro His Pro Ala Pro Ser Ala Arg Gly Pro Leu Arg 重组质粒的筛选与鉴定: 将重组质粒转化大肠杆菌DH5 α，涂布含氨苄青霉素(100 μ g / ml) LB平板，置.37 0C过夜；次日随机挑取转化菌落、I个对照菌(质粒PMCE5转化菌)I个阳性对照菌(pUC57-gE2)，菌液PCR扩增HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段，含HSV2病毒gE糖蛋白胞外区基因片段的阳性重组质粒，应扩增出长约1282bp的基因片段；在提取阳性单菌落质粒，进行双酶切鉴定及测序； 重组质粒在CHO细胞中的表达鉴定: CHO细胞在不含血清的细胞表达培养基在锥形瓶中震荡培养，370C，5% CO2,转染前一天，以适当的浓度将CHO细胞接种于不含血清的细胞表达培养基中，震荡悬浮培养，37°C，5%CO2 ;用DNA和PEI混合物转染重组质粒，转染后第五天收集细胞上清，检测蛋白表达水平，第六天收集所有上清用于纯化重组蛋白； 重组蛋白的纯化、鉴定和浓度检测: 收集细胞上清100ml，离心后将上清以lml/min的速度加入His Trap? FF crudecolumn 中；10 倍体积平衡液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, 20mmol/L imidazole,ρΗ7.4)洗脱杂蛋白，再加入 Iml 洗脱液(I XPBS, 0.5mol/L NaCl, 500mmol/L imidazole,pH7.4)洗脱目的蛋白，静置20分钟后洗脱，收集洗脱液，用透析液(lXPBS，0.5mol/L NaCl，pH7.4)透析过夜，即为纯化的目的蛋白，SDS-PAGE、Western Blot检测，并测定蛋白浓度；纯化获得的gE2蛋白分子量约为55kD。
3.权利要求1所述的化学合成的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区的基因片段序列，利用细菌、酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞及转基因动植物进行重组表达、制备。
4.权利要求2或权利要求3所述的方法制备的HSV2病毒gE糖蛋白胞外区片段，用于HSV2病毒亚 单位疫苗的研制及抗体检测。
【文档编号】A61P31/22GK103740736SQ201310751325
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月31日 优先权日:2013年12月31日
【发明者】李越希, 潘英, 周洁, 尚彦红, 徐悦玥, 许桂丽, 张素芬, 马颖, 袁敬宇, 李素芹, 李丙军, 陈乐如, 蔡冉 申请人:李越希