专利名称：对人癌细胞新粘蛋白样糖蛋白抗原的特异性单克隆抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同人类癌抗原结合的单克隆抗体，特别是涉及一种同存在于人类乳腺癌和其它腺癌癌细胞表面和/或细胞质内，以及正常人乳腺上皮细胞表面上的特大分子量的粘蛋白样糖蛋白复合物特异性结合的单克隆抗体。
已经制备出能识别存在于正常人乳腺上皮细胞表面上的大分子量的粘蛋白样糖蛋白复合物的单克隆抗体。可详见如下报道Petersonetal.，ImperialCancerResearchFund，London，England，March2-3(1981);Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983)。另外一些研究人员既用人乳脂肪球作为免疫剂制备单克隆抗体;见如下报道;Taylor-Papadimitrionetal.，Int.J.Cancer，2817-21(1981);Cerianietal.，SomticCellGenetics，9415-427(1983)，和以不同的乳腺肿瘤细胞作为免疫剂制备单克隆抗体。详见Papsideroetal.，CancerResearch，431741-1747(1983);Kufeetal.，Hybridoma，3223-232(1984);Frankeletal.，J.Biol.ResponseMod，4273-286(1985);Colcheretal.，Proc.Natl.Acad.Sci，USA，783199-3203(1981);Fosteretal.，VirchowsArch，394279-293(1982);Ellisetal.，Histopathology，8501-516(1984);Ashalletal.，lancet，21-11(1982)上述单克隆抗体也用于识别一种粘蛋白样糖蛋白。按照Shimizu等人的报告(Shimizuetal.，BiochemJ.，233727-730(1985)发现这些单克隆抗体能识别约250，000道尔顿至超过一百万道尔顿大小的粘蛋白样糖蛋白，这取决于免疫原的制备。
在人乳脂肪球膜的大分子量的粘蛋白样糖蛋白生化研究中，Shimizu等人(Shimizu，etal.，Biochem.J.233725-730(1986))建议这些糖蛋白是含有至少三个不同成分的复合物，而这三个成分至少分别代表三个不同的分子实体。因此，人乳脂肪球膜的粘蛋白样糖蛋白显示为大分子复合物，由于它们的大小，该复合物被认为具有无数的抗原决定簇。人们已制备出能同正常乳腺上皮细胞和恶性乳腺癌细胞的粘蛋白样糖蛋白结合的单克隆抗体，如Ceriani等人描述的Mc5单克隆抗体(Cerianietal.，SomaticCellGenetics，9415-427(1983))。另外，一种对豚鼠乳脂肪球膜特异性的单克隆抗体D-274被用于判断人乳腺浸润导管型癌和良性纤维囊性病中的大于400，000道尔顿的粘蛋白样糖蛋白的分布。参见(Greenwaltetal.，AmJ.Pathol.，118351-359(1985))。
现有技术中已制备的单克隆抗体将同正常人乳腺上皮细胞，乳腺癌细胞以及其它组织的某些上皮细胞结合。提供一种在正常乳腺上皮细胞表面和其它组织的某些癌细胞及人乳腺细胞表面和/或细胞质内表达的独特的抗原决定基相结合的单克隆抗体将会大大地有益于肿癌细胞的鉴定、诊断、预后和治疗。
一种同人乳腺癌细胞和其它腺癌癌细胞的表面和/或细胞质内的，以及同正常人乳腺上皮细胞表面的新颖的粘蛋白样糖蛋白抗原相结合的单克隆抗体，该单克隆抗体不与心脏、肝脏、卵巢、脾脏、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子宫正常组相结合。
被这种单克隆抗体识别的抗原被称作BrE2，其特征在于具有大于400，000道尔顿的大分子量。BrE2单克隆抗体的特异性有利于在评估和治疗乳腺癌时进行鉴别诊断、预后、诊断以及可能的治疗中加以应用。
用正常去脂人乳脂肪球做成免疫制剂，制备BrE2单克隆抗体。
用Kohler和Milstein描述的标准工作程序(Kohler&Milstein，Nature，256495-493(1975))制备本发明的单克隆抗体。使用Ceriani等人描述的制备方法制备的完全去脂人乳脂肪球(HMFG)免疫宿主动物。(Cerianietal.，Prcc.Natl.AcadSciUSA.74582-586(1977))。宿主动物是新西兰小黑鼠(NZBmice)，在适当时间的保温之后，采集小鼠脾细胞。
然后，使用熟知的聚乙烯二醇技术将采集到的小鼠脾细胞同P3-X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞进行融合。用Ceriani等人(Cerianietal.，SomatciCellGenetics，9415-427(1983))描述的在微量滴定盘的孔内采用固相放免结合测定法和用HMFG以及HMFG成分的ELISA测定法完成筛选鉴定产生本发明单克隆抗体的杂交瘤或杂交细胞系。然后，筛选出对宫颈癌和结肠癌细胞系上HMFG阳性的各孔。找到一种未被这些癌细胞系染色的单克隆抗体，并且分离出产生那种抗体的杂交细胞。这样单克隆抗体被认为是抗-BrE2(Anti-BrE2)。用Towbin等人报告的WesternBlottest(法)(Towbinetal.，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，764350-4354(1979)和Ceriani等人报告的固相结合测定法(Cerianietal.，MonoclonalAntibodiesandFunctionalCellLines，PlenumPress，NewYork，398-402(1984)测定经BrE2单克隆抗体鉴定的抗原的分子量。
在WesternBlot试验法中，用7%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离HMFG，然后将HMFG电印迹法转到硝化纤维素膜上。将硝化纤维素膜切成条状，恒温保温该条。高分子量标准品同时在凝胶上平行段泳动。
在固相结合测定法中，如LaemmliVK在自然杂志227期第680页(1970)描述那样，HMFG在7%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。凝胶道被切成许多片段，洗脱该切片，然后将洗提液干燥在微量滴定板上。使用放免结合测定技术检测单克隆抗体的结合情况。在使用WesternBlot试验法和固相结合测定法电泳HMFG的时侯，只能在聚丙烯酰胺凝胶的原点找到BrE2单克隆抗体鉴定一种物质。因此，由BrE2单克隆抗体识别的粘蛋白样糖蛋白抗原也保留在原点，而不穿透聚丙烯酰胺凝胶。使用固相结合测定法在少于7%的聚丙烯酰胺凝胶上电泳HMFG。然后用高分子量标准品计算由BrE2单克隆抗体识别的粘蛋白样糖蛋白抗原的分子量。这样抗原的分子量估计超过400，000道尔顿。在BrE2和Mc5单克隆抗体之间进行一些实验，以判断它们对于糖蛋白抗原的竞争。发现BrE2单克隆抗体对与Mc5单克隆抗体结合的同一抗原决定簇不具有竞争性结合。
用BrE2单克隆抗体对含有乳腺癌细胞或分子的体液分析表明，我们确定对小于400，000道尔顿分子量的糖蛋白分子实体也发生结合。推测被BrE2单克隆抗体结合的高分子量的粘蛋白样糖蛋白抗原在体液中已经变性，如变成碎片。显然，BrE2单克隆抗体可识别一个共通的抗原决定簇，它既存在于高分子量抗原，也存在于分子实体或片段上，这方可说明此现象。所以，虽然BrE2单克隆抗体特异性地结合超过400，000道尔顿的高分子量抗原，它也结合这样一种分子实体上的共通抗原决定基。这可能是因为高分子量的抗原为一种分子实体的复合物。
可用小鼠IgG1免疫球蛋白试剂盒鉴定BrE2单克隆抗体同型物。
为了进一步确定BrE2单克隆抗体的组织特异性，广泛地研究了其与组织学切片的结合。采用标准免疫过氧化酶分析法以研究其与人正常和癌组织的组织切片的结合。按BattiforaH，(BaltiforaH，Lab.Invert.，55244-248(1986))报告的方法制备多种肿瘤组织块。通过将各种固定的组织用腹膜或小肠缠起包埋在石蜡内以制备每一种组织块。然后组织块切片以供结合研究。用这种方式，大量的不同组织用单一染色进行评价。
显示，BrE2单克隆抗体特性的乳腺组织块含有21种不同的标本，这些标本采自正常乳腺、22个腺瘤和33个乳腺癌。用BrE2单抗染色所有的受试组织。
BrE2单克隆抗体也被用于试验大量不同的正常和肿瘤组织试验组。不仅是正常的的乳腺组织和乳腺癌。BrE2单克隆抗体结合到肺泡衬细胞、肾远端曲管、胰腺上皮的尖端以及胃粘膜全层的正常织织。BrE2单克隆抗体不与心、肝、脾、卵巢、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子宫的正常组织结合。
BrE2单克隆抗体不仅同原发性乳腺癌(或称乳腺源)结合外，还同几种其它腺癌结合。在绝大多数的肿瘤中，可见尖端膜和细胞质的染色。BrE2单克隆抗体也同绝大多数肺和卵巢的腺癌结合。一种能产生BrE2单克隆抗体的杂交细胞样品已保藏在美国细胞培养物保藏机构(ATCC)，地址，美国马里兰州12301，RockVille，帕克劳恩道，12301号。保藏号NOHB9795，所述的杂交瘤细胞系已于1988年8月16日寄往ATCC，ATCC收到日为1988年8月17日。这种能产生BrE2单克隆抗体的杂交细胞样品已保藏在武汉，中国典型培养物保藏中心，该中心于1989年7月11日收到上述样品，其保藏号为。
BrE2单克隆抗体是独一无二与众不同的，因为它的高度特异性，即对存在于正常乳腺上皮细胞表面，乳腺癌细胞质内或细胞表面上的特大分子量的粘蛋白样糖蛋白复合物具有显著的特异性，而上述单克隆抗体对心脏、肝脏、卵巢、脾、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子管等正常组织不具有特异性。这样，可以有几种方式使用BrE2单克隆抗体。它可以用作抗乳腺抗体混合抗体(cock tail)的一个组分使用，每个组分具有不同的结合特异性。由于所述的合剂(cock tail)由对不同细胞和组织特异性的单克隆抗体组成，所以它可用于乳癌的诊断和治疗，以及研究细胞分化和细胞分型的特异性。例如，所述的单克隆抗体可用某种可检测的标记，如莹光分子或染料或肿瘤显像用的放射活性示踪剂，进行标记。最适合的追踪剂是碘131，铟111或者锝99。治疗用时，可以结合或者未结合形式的单克隆抗体在几种单抗合剂中使用，也可分别使用。BrE2单克隆抗体的适合的结合物包括化疗药物，毒素或者放射性同位素。如放射性同位素碘131可直接同BrE2单克隆抗体结合。如铟111或钇99放射性同位素可经使用螯合物或其它已知方法间接地同BrE2单克隆抗体结合。可以以单抗合剂或分别剂形使用(用药)结合或未结合的BrE2单克隆抗体。
BrE2单克隆抗体可用在体外诊断的免疫测定，在测定中用许多微球中来结合在其表面上的抗原或抗体，并进行适当的标记。其标记物可根据本文中讨论的和现有技术中已知的标记物中选择。例如，在体外应用时，按照所列文献中的测定指令，BrE2单克隆抗体可以测定盒的形式并配有其它的成分，用来完成生物学样品的测定。在体内用诊断和治疗同样也可行。可用流式细胞测定法检测分析细胞分化和细胞特异性。BrE2单克隆抗体也可用作肿瘤组织病理学中的预后研究工具，以判断如恶性肿瘤的后果，恶性肿瘤扩散的可能性或者其恶性的分期。这些在体内和体外应用并不排除BrE2单克隆抗体其它方面的应用。
权利要求
1.一种经杂交瘤技术制备的，对人乳腺癌细胞质内及细胞表面，人类其它腺癌癌细胞质内及细胞表面和人类正常乳腺上皮细胞表面上的特有的抗原决定簇能产生特异性的单克隆抗体的细胞系。
2.按权利要求1所述的细胞系，其中所述的抗原在人类乳腺癌细胞和人类正常乳腺上皮细胞的粘蛋白样糖蛋白分子复合物上被表达。
3.按权利要求2所述的细胞系，其中所述的单克隆抗体生产细胞是用去脂人乳脂肪球免疫过的小鼠脾细胞。
4.按权利要求2所述的细胞系，其中所述的单克隆抗体生产细胞是用正常人全乳脂肪球膜免疫过的小鼠脾细胞。
5.按权利要求2所述的细胞系，其中所述的单克隆抗体生产细胞是用正常人乳脂肪球成分免疫过的小鼠脾细胞。
6.按权利要求1所述的细胞系，其中在心脏、肝脏、脾、卵巢、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子宫的正常组织细胞表面，使用所述单克隆抗体不能测定到所述的抗原。
7.按权利要求6所述的细胞系，其中所述的单克隆抗体同肺泡衬细胞，肾远端曲管，胰腺泡上皮以及胃粘膜的正常上皮细胞相结合。
8.按权利要求1所述的细胞系，其中所述的单克隆抗体同乳腺、肺和卵巢的腺癌上皮细胞结合。
9.一种经杂交瘤技术制备的，具有美国细胞培养物保藏机构(ATCC)保藏样品基本特征的细胞系，该保藏机构地址在，美国，马里兰州20852，洛克维莉、帕克劳恩道，12301号，保藏号为HB9795。
10.一种同人类乳腺癌细胞和正常乳腺上皮细胞的高分子量粘蛋白样糖蛋白复合分子上的抗原决定簇特异性结合的单克隆抗体，其特征在于A.所述抗原是同BrE2抗原相同的，具有超过400，000道尔顿分子量的抗原，它可以使用抗原电泳和比较其同已知分子量的标记蛋白的移动加以鉴别。B.它可在乳腺癌细胞质内和/或表面上和正常乳腺上皮细胞的表面上表达。C.它属于1gG1小鼠同型物。
11.按权利要求10所述的单克隆抗体，其中所述的抗原也在具有小于400，000道尔顿分子量并同所述单克隆抗体相结合的分子实体的表面上表达一个抗原决定基。
12.按权利要求10所述的经杂交瘤制备的单克隆抗体，具有美国细胞培养物保藏机构(ATCC)保藏样品的基本相同特征，该机构的地址在美国，马里兰州，20852，洛克维莉，帕克劳恩道，12301号，保藏号为HB9795。
13.按权利要求10所述的单克隆抗体，其中在心脏、肝脏、脾、卵巢、睾丸、脑、前列腺、甲状腺、膀胱、结肠、食管和子宫正常上皮细胞上不能检测到所述的BrE2抗原。
14.按权利要求10所述的单克隆抗体，其中在乳腺、肺泡衬细胞、肾远端曲管、胰腺上皮和胃粘膜正常上皮细胞质内和/或表面上可检测到所述的BrE2抗原。
15.按权利要求10所述的单克隆抗体，其中在乳腺、肺和卵巢的腺癌上皮细胞的细胞质内和/或表面上可检测到所述的BrE2抗原。
16.一种检测在生物样品中含BrE2抗原人癌细胞或分子中ErE2抗原的方法，该方法涉及将偶联标记的同BrE2抗原特异性结合单克隆抗体和所述的生物学样品暂时接触，在足以形成所述单克隆抗体和抗原之间的免疫复合物的条件下，检测在底物反应可测产物上的免疫复合物。
17.按权利要求16所述的方法，其中检测到的所述单克隆抗体和抗原免疫复合物包括一个与BrE2单克隆抗体结合的表达一个普通抗原决定基的抗原分子实体。
18.按权利要求16所述的方法，其中所述的标记物被包裹在微球体的表面上。
19.按权利要求16所述的方法，其中从放射活性成分，莹光染料和酶中选择所述的标记物。
20.一种同某种化疗剂，光活性毒素或放射活性剂结合的BrE2单克隆抗体特异性结合的小鼠IgG1同型物的鼠单克隆抗体。
21.一种在生物学样品中检测BrE2抗原是否存在于含BrE2抗原人类乳腺癌细胞或分子上的方法，该方法包括，将该生物学样品同与BrE2抗原特异性结合的带标记的单克隆抗体暂时接触，在足以完成免疫反应的条件下，假如如此，该单克隆抗体同该抗原发生反应，然后检测反应中生成的免疫复合物。
22.按权利要求21所述的方法，其中从染料、莹光染料、放射活性成分和酶中选择所述的标记物。
23.一种从怀疑患有所述肿瘤患者身上检测癌瘤的方法，该方法包括暂时向该患者注入同某种放射活性成分衍生后的BrE2抗原特异性结合的单克隆抗体，在该单克隆抗体和所述肿瘤之间足以形成免疫复合物的条件下，用衍生后的单克隆抗体标记该肿瘤以检测到所述的肿瘤。
24.按权利要求23所述的方法，其中所述的放射活性成分是碘131、铟111或锝99。
25.按权利要求23所述的方法，其中所述的被检测到的癌瘤是乳癌。
26.按权利要求23所述的方法，其中所述的被检测到的癌瘤是肺癌和卵巢癌。
27.一种在怀疑患有所述肿瘤的患者体内杀死人乳腺癌肿瘤细胞的方法，该方法包括暂时向患者体内注入可同BrE2抗原和含BrE2抗原的细胞特异性结合物的一种单克隆抗体-毒素合剂，在所述单克隆抗体-毒素合剂同所述肿瘤之间足以形成免疫复合物的条件下，引起肿瘤的死亡。
28.按权利要求25所述的方法，其中所述的毒剂是放射活性剂。
29.按权利要求27所述的方法，其中所述的被杀的癌瘤是乳癌。
30.按权利要求27所述的方法，其中的被杀死的癌瘤是肺癌或卵巢癌。
31.一种经杂交瘤技术制备，具有中国典型培养物保藏中心保藏的样品基本特征的细胞系，该中心地址在中国武汉珞珈山武汉大学院内，保藏号。
全文摘要
一种能产生单克隆抗体的杂交瘤细胞系。该抗体可同人乳癌细胞和其它腺癌细胞表面和/或细胞质内以及正常人乳上皮细胞表面的特有的抗原决定簇结合。用选择一组免疫原和常规骨髓瘤细胞系同收集的小鼠脾细胞融合的免疫小鼠制备本发明的细胞系。
文档编号C07K16/30GK1040623SQ8910497
公开日1990年3月21日 申请日期1989年7月24日 优先权日1988年8月26日
发明者罗伯托·L·瑟列尼, 杰里·A·彼得森 申请人:约翰缪尔纪念医院约翰缪尔癌与老年研究所