专利名称：用于对 p －糖蛋白和其他细胞表面受体、泵和蛋白的构象改变进行定性和构象依赖性定 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于对P-糖蛋白和其他细胞表面受体、泵和蛋白的构象改变进行定性和构象依赖性定量检测的抗体竞争试验(ACT)及其用途。更具体地讲，本发明的目的优选是一种抗体竞争试验“ACT”，该试验可用于检测在一种蛋白，即通常决定多药物抗性的P-糖蛋白(Pgp)结合受体之后，或在参与HIV感染的CD4的受体结合配体之后构象的改变。根据本发明，测定了两种抗体或其他特异性蛋白结合物质的结合比例，所述物质用两种不同颜色的染料进行过合适的荧光标记，并且根据这种比例的改变，通过其他配体的作用，了解所述蛋白构象的改变。用两种染料分别标记的以上两种抗体可以对相同的、重叠的、或别构偶联的表位具有特异性。本发明涉及这种情形其中，在通过某种类型的配体结合产生的受体/泵/蛋白的构象作用下，以上两种抗体(标记过的配体)的结合不会发生相同程度或相同方向的改变。一方面，与任何抗体本身的唯一结合的改变相比，这种比例的改变更精确地体现了所述构象的改变，另一方面，两种抗体的同时结合的相对程度，可能是高度依赖于构象的。
本发明基本实施方案的实质归纳在下图中 在存在第三种配体(“C”)的条件下，与细胞表面受体(在这里是泵)结合的两种抗体(“A”和“B”)，以修饰过的比例结合。十字符号表示抗原；椭圆形符号表示细胞。
与相同受体结合的两种抗体或配体，以与其使用浓度或其亲和力(Kassoc)成比例的形式与特定蛋白结合。如果所述蛋白的构象发生改变的话，所述后几种参数可能发生改变。可以解释为所述抗体或配体的这种Kassoc的改变一般是很小的，其检测是不可靠的，并且其灵敏度不充分。如果两种抗体或配体与相同的、或重叠的或与别构偶联的受体或表位结合的话，其中之一的结合的增强，可能伴随着另一成分的结合的减弱。在这种情况下，通常测定两种结合，可能导致对构象改变的非常精确和非常灵敏的检测能力。
背景技术：
肿瘤通常对化疗有抗性，这样化疗剂的细胞内浓度会降低到低于毒性水平。ABC(ATP结合盒)转运蛋白——一种P-糖蛋白(Pgp)，它通常决定多药物抗性(MDR)症状，它能够消除所述细胞的多种细胞抑制，破坏化疗治疗[Gottesman MM.Pastan I由多种药物转运蛋白介导的多药物抗性的生物化学，Annu.Rev.Biochem.62，385-427(1993)]。Pgp的特征是可以转运多种两亲性-亲脂性物质，它们彼此之间在结构上并不是非常相似，并且其大小在很大范围内改变[Gottesman MM.PastanI由多药物转运蛋白介导的多药物抗性的生物化学，Annu.Rev.Biochem.62，385-427(1993)；Gottesman，M.M.，Hrycyna，C.A.，Schoenlein，P.V.，Germann，U.A.and Pastan，I.多药物转运蛋白的遗传学分析，Annu.Rev.Genet.29，607-649(1995)；Seelig，AP-糖蛋白的底物识别的一般模式，European Journal ofBiochemistry 251，252-2619(1998)]。人类恶性肿瘤的大约一半Pgp是在这种水平上表达的，即它本身可能导致临床上相关的药物抗性[Gottesman MM.Pastan I由多药物转运蛋白介导的多药物抗性的生物化学，Annu.Rev.Biochem.62，385-427(1993)；Gottesman，M.M.，Hrycyna，C.A.，Schoenlein，P.V.，Germann，U.A.和Pastan，I.多药物转运蛋白的遗传学分析，Annu.Rev.Genet.29，607-649(1995)；Nooter K.Sonneveld P.造血恶性肿瘤中P-糖蛋白表达的临床相关性，Leukemia Res.，18，233-243(1994)；Bosch，I.和Crop，J.P-糖蛋白多药物抗性和癌症，Biochimica et Biophysica Acta1288，37-54(1996)；Sonneveld，P:: Prognostic significance andreversal of MDR in multiple myeloma，pp.463-471，INMultidrugresistance in cancer cells.Molecular，biochemical，physiological and biological aspects，Ed.Gupta S.and TsuruoT.，John Wiley and Sons(1996)；Aran，JM.，Pastan，I.和Gottesman，MM.涉及多药物抗性表型的治疗方法在基因治疗中作为目标、化学保护剂和选择标记的MDR，Adv.Pharmacology 46，1-42(1999)；Doige C.A.和Ames，G.F.细菌和人体内的ATP-依赖性转运系统与囊性纤维化和多药物抗性的相关性，Ann.Rev.Microbiol.47，291-319(1993)]。被普遍接受的理论是，Pgp在肿瘤细胞中的存在，提供了在肿瘤发展期间的选择优点[Gottesman，M.M.，Hrycyna，C.A.，Schoenlein，P.V.，Germann，U.A.和Pastan，I.多药物转运蛋白的遗传学分析，Annu.Rev.Genet.29，607-649(1995)；Seelig，AP-糖蛋白对底物识别的一般模式，European Journal of Biochemistry251，252-2619(1998)；Bosch，I.and Crop，J.P-糖蛋白多药物抗性和癌症，Biochimica et Biophysica Acta 1288，37-54(1996)；Sonneveld，P:: Prognostic significance and reversal of MDR inmultiple myeloma，pp.463-471，InMultidrug resistance incancer cells.Molecular，biochemical，physiological andbiological aspects，Ed.Gupta S.and Tsuruo T.，John Wiley andSons(1996)；Aran，JM.，Pastan，I.和Gottesman，MM.涉及多药物抗性表型的治疗方法在基因治疗中作为目标、化学保护剂和选择标记的MDR1基因，Adv.Pharmacology 46，1-42(1999)]。就此而言，对其细胞表面表达的定量表征，对于很多肿瘤的临床表现具有预测作用，并且它可以指导对化疗方案的选择。即使是对于上述实际特征来说，了解导致Pgp表达程度的变异性的原因或与临床症状的相关性是重要的[Nooter K.Sonneveld P.在造血恶性肿瘤中P-糖蛋白表达的临床相关性，Leukemia Res.，18，233-243(1994)；Bosch，I.and Crop，J.P-糖蛋白多药物抗性和癌症，Biochimica et Biophysica Acta 1288，37-54(1996)]。在上述误差的方法学来源中[Sonneveld，P:: Prognostic significance and reversal of MDR in multiplemyeloma，pp.463-471，INMultidrug resistance in cancer cells.Molecular，biochemical，physiological and biological aspects，Ed.Gupta S.and Tsuruo T.，John Wiley and Sons(1996)]，主要涉及到与Pgp表达程度的临床相关性有关的不确定性(尚不确定了解何种水平的Pgp表达会导致临床多药物抗性，或者，低水平的抗性可能不依赖于Pgp)，以及其他抗性机制的增加或替代作用[(Koshiyama，M.，Yoshida，M.，Fujii，H.，Nanno，H.，Hayashi，M.和Tauchi，K.子宫内膜癌中与多药物抗性相关蛋白的表达与临床病理学和预后的关系。Ann.Diagn.Pathol.281-87.(1999)；Osmak，M.放疗前的人宫颈癌细胞对顺-二氯二胺铂(II)和长春新碱的抗性相关的多因素分子机制，Neoplasma 4097-101(1993)；Michieli，M.，Damiani，D.，Ermacora，A.，Masolini，P.，Raspadori，D.，Visani，G.，Scheper，R.J.和Baccarani，M.从头发生的急性非淋巴细胞白血病中的P-糖蛋白、肺抗性相关蛋白和多药物抗性相关蛋白生物学和临床意义。Br.J.Haematol.104328-335(1999))。本发明直接涉及上述前两种因素。
很多被称为调节剂或恢复剂(reverting agent)的物质(例如，Ca通道阻断剂(异搏定)、钙调蛋白抑制剂、甾体；最有效的Pgp抑制剂是环孢菌素A，在临床试验中，是SDZ PHC833(一种环孢菌素D衍生物)]和SDZ-280-466肽衍生物[Friche，E.和Beck，W.T.恢复多药物抗性的分子药理学及其临床意义，pp.362-374.InMultidrugresistance in cancer cells.Molecular，biochemical，physiological and biological aspects E.d.Gupta S.and TsuruoT.John Wiley & Sons(1996)；Cornwell，M.M.，Pastan，L和Gottesman，M.M.某些钙通道阻断剂能特异性地结合多药物抗性人KB癌膜小泡，并且抑制药物与P-糖蛋白的结合。Journal of BiologicalChemistry 262 2166-2170(1987)；Yusa，K.，Naito，M.和Tsuruo，T.P-糖蛋白对P-糖蛋白修饰剂的转运。pp.331-344.InMultidrugresistance in cancer cells.Molecular，biochemical，physiologycal and biological aspects.E.d.Gupta S.and TsuruoT.John Wiley & Sons 199612-14]能够抑制所述底物的转运。通过上述大多数物质证实，它们能提高所述细胞生长抑制剂在表达Pgp的细胞中的细胞内浓度，这种现象的最有可能的机制是指导与Pgp的相互作用，例如，竞争结合物质。一般，所述调节剂本身也被转运。不过，与此同时，不同的底物不一定抑制彼此的转运。由于Pgp分子是在正常组织中表达的，例如在小肠中、在胆管中、在肾小管中以及在大脑的毛细管中表达[Gottesman，M.M.，Hrycyna，C.A.，Schoenlein，P.V.，Germann，U.A.和Pastan，I.多药物转运蛋白的遗传学分析，Annu.Rev.Genet.29，607-649(1995)；Thiebaut，F.，Tsuruo，T.，Hamada，H.，Gottesman，M.M.，Pastan，I.，Willingham，M.C.多药物转运蛋白P170上的不同表位在正常组织中的免疫组织化学定位定位在大脑毛细管中以及一种抗性与一种肌肉蛋白的交叉反应性的证据。J.Histochem.Cytochem.37159-164(1989)]，当使用调节剂时，除了肿瘤组织之外(它通常是Pgp+)，在生理学上表达Pgp组织或其相邻组织中Pgp底物的浓度可能改变，导致出现意想不到的和不希望的副作用[Schinkel，A.H.，Mayer，U.，Wagenaar，E.，Mol，A.M.，Deemter，L.，Smit，J.J.M.，Valk，M.A.，Voordouw，A.C.，Spits，H.，Tellingen，O.，Zjilmans，J.M.，Fibbe，W.E.和Borst，P.在缺乏mdrl-型(药物转运)P-蛋白的小鼠体内的正常存活力和改变了的药代动力学。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94 4028-4033(1997)；Miller，T.P.，Grogan，T.M.，Dalton，W.S.，Spier，C.M.，Scheper，R.J.，Salmon，S.E.P-糖蛋白在恶性淋巴细胞中的表达，以及通过添加高剂量异搏定的化疗恢复临床药物抗性。verapamil.J.Clin.Oncol.9 17-24.(1991)；Friche，E.和Beck，W.T.恢复多药物抗性的分子药理学及其临床应用。pp.362-374.InMultidrug resistance incancer cells.Molecular，biochemical，physiological andbiological aspects E.d.Gupta S.和Tsuruo T.(1996)；Pennock，G.D.，Dalton，W.S.，Roeske，W.R.Appleton，C.P.，Mosley，K.，Plezia，P.，Miller，T.P.，Salmon，S.E.与高剂量异搏定输液和化疗治疗相关的系统毒性作用。J.Natl.Cancer Inst.83 105-110(1991)]。有效性及其耐受恢复剂的副作用体现了这种癌症化疗方法的极大的机会。
尚不了解将所述底物结合在所述细胞上和从所述细胞上除去的确切机制，不过，可以获得在单细胞和细胞培养物水平上的有关很多药物的转运和可调性的分子机制和动力学特征的详细资料。但是，能接受很多疏水化合物的所述分子识别过程的细节尚不清楚。进一步细化疏水性标准，补充进一步的结构参数(所述化合物中的至少一个杂环，电子供体基团的相对距离等)也没有导致发现这样的关系，这种关系将表现出底物-酶关系的实质，并且使得能够设计所述底物。与此同时，所述宽的底物范围具有非常特异的特征通过导致某些氨基酸改变的点突变的作用，以底物特异性方式显著改变泵送效力。根据最常引用的泵送机制的理论，作为底物接受的疏水性分子是从亲脂性介质中转运的，所述介质来自膜，甚至在它们到达胞质溶胶之前。这一理论得到了Sarkadi及其同事的钙黄绿素-AM实验的最直接的支持-所述化合物仍然是作为acethoxymethylesther(仍然处在它的″AM阶段″)转运，并且甚至还没有时间通过胞质溶胶的脂酶的作用来被崩解[Homolya，L.，Hollo，Zs.，Germann，U.A.，Pastan，L，Gottesman，M.M.和Sarkadi，B.由多药物抗性蛋白排出的荧光细胞指示剂。Journal of BiologicalChemistry 268 21493-21496(1993)；Hollo，Zs.，Homolya，L.，Davis，C.W.和Sarkadi，B.作为多种药物转运蛋白的荧光剂量功能测定的钙黄绿素积累。Biochimica et Biophysica Acta 1191 384-388199420，21]。根据与其他ABC转运蛋白的详细X-光晶体学数据外推，ATP结合位点周围的构象的改变会扩展到底物结合区，导致所述底物从位点内转移到位点外。
所述实验还涉及到构象改变，除了所述泵的底物-饱和之外，这些实验还检测了某些单克隆抗体的不同的结合特征[Mechetner，E.B.，Schott，B.，Morse，SB.，Stein，W.，Druley，T.，Davis，K.A.，Tsuruo，T.和Roninson，I.可通过示差免疫反应性检测的与构象转变相关的P-糖蛋白功能。Proceedings of the National Academy ofSciences，USA 94 12908-12913(1997)；Jachez B.Cianfriglia M.Loor F.通过温度和/或抗性调节剂调节人P-糖蛋白表位表达。Anti-Cancer Drugs 5 655-665(1994)]。所述构象敏感性抗体之一是UIC2抗体，通过其底物依赖性结合特征体现的构象事件与本发明密切相关(？)。UIC2抗体的结合提高了2-4倍，例如，在存在异搏定、长春碱或环孢菌素A等的条件下[Jachez B.Cianfriglia M.Loor F.通过温度和/或抗性调节剂调节人P-糖蛋白表位表达。Anti-Cancer Drugs 5655-665(1994)]。这种现象是所谓的UIC2-转变(shift)，其发现者推荐将其用于检测功能性Pgp，或用于提高少量Pgp的可检测性，例如披露于美国专利5,872,014中。适用于检测Pgp的方法和物质披露于以下美国专利中5,994,088，5,972,598，5,830,697，5,786,344，5,773,280和5,434,075。在存在调节剂、底物的条件下，其他抗体的结合没有改变，或者几乎不改变[Mechetner，E.B.，Schott，B.，Morse，SB.，Stein，W.，Druley，T.，Davis，K.A.，Tsuruo，T.和Roninson，I.可通过示差免疫反应性检测的与构象转变相关的P-糖蛋白功能。Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 9412908-12913(1997)；Schinkel，A.H.Arceci，R.J.Smit，J.J.M，Wagenaar，E.，Baas，F.，Dolle，M.，Tsuruo，T.，Mechetner，E.，Roninson，LB.和Borst，P.识别人mdrl P-糖蛋白的外部表位的单克隆抗体的结合特征。glycoprotein.Int.J.Cancer 55 478484(1993)]。还可将某些所述构象敏感型抗体用作所述泵的有效抑制剂[Mechetner EB.Roninson IB.用单克隆抗体有效抑制P-糖蛋白介导的多药物抗性。Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 89 5824-5828(1992)]。UIC2(Pgp-抑制剂)抗体的一个有趣的特征是，它只能结合部分细胞表面Ppg分子，其他结合位点-例如，一直可以供MRK16抗体使用-只有在存在Pgp底物的条件下才能供UIC2使用(同时所述抗体的结合常数也发生改变，不过所述结合位点数量的改变被认为是一种显性因素)。根据用由不同抗体识别的表位制作的(部分假设的)图谱，所述表位是由连接12个跨膜螺旋的环的细胞外成员构成的。例如，MRK16抗体有可能识别由1号和4号细胞外环形成的复杂的表位[Mechetner EB.Roninson IB.用单克隆抗体有效抑制P-糖蛋白介导的多药物抗性。Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 89 5824-5828(1992)；Georges，E.，Tsuruo，T.和Ling，V.通过MRK-16单克隆抗体的表位作图确定的P-糖蛋白的拓扑学Journalof Biological Chemistry 268 1792 1798(1993)]。对于UIC2来说，报导过1号环参与所述抗体结合[Schinkel，A.H.Arceci，R.J.Smit，J.J.M，Wagenaar，E.，Baas，F.，Dolle，M.，Tsuruo，T.，Mechetner，E.，Roninson，LB.And Borst，P.识别人mdrl P-糖蛋白的外部表位的单克隆抗体的结合特征。Int.J.Cancer 55 478484(1993)]。构成本发明基础的我们的实验结果[下文详细披露]与上文所披露的UIC2转变现象密切相关。
发明公开本发明与上述现象相关，并且归纳如下。对于P-糖蛋白(Pgp)来说，当使用调节剂时，有多出2-4倍的UIC2抗体结合到细胞表面Pgp-s上(参见上文所引用的美国专利)。本发明证实，这种UIC2信号的增强伴随着其他抗体结合的很多倍(甚至超过60倍)的改变，并且可以更灵敏地检测导致所有这种改变的构象的改变。这就是本发明提供了所谓UIC2方法的显著改进的原因，这种改进是基于UIC2抗体结合的增强。由于某些恢复剂(调节剂)会导致UIC2转变，但是不会导致与上文提到的改变相当的改变，本发明方法的应用并不是简单地敏化UIC2-转变方法，而是另一种技术、方法，它甚至使用了相反的方法步骤以便检测Pgp构象的改变(参见下文)。
本发明基于一种惊人的现象业已发现，UIC2抗体只能对MM12.10抗体产生微弱的影响[Romagnoli G.Poloni F.Flego M.Moretti F.Di Modugno F.Chersi A.Falasca G.Signoretti C.Castagna M.Cianfriglia M.通过合成肽扫描和噬菌体展示技术对外部MDR1 P-糖蛋白结构域的单克隆抗体MM12.10进行表位作图。Biol.Chem.380553-559(1999)](即在结合UIC2之后，MM12.10仍然能结合)，但是，如果用某些调节剂/底物处理表达Pgp的细胞系的话，在用UIC2抗体预温育之后，MM12.10的结合大大减弱或终止。使用选择的(KB-V1)和人mdrl转染的(NIH3T3 MDR1)细胞系很好地再现了这种现象(参见
图1和2)。在用相反的顺序温育时，MM12.10同样影响了UIC2的结合(抑制其结合)，但是，这种影响并不是以调节剂依赖性方式为主(参见图5)。
并非所有的调节剂都具有类似行为(参见图1和2)。尽管环孢菌素A和长春碱会导致上述现象，但是即使是有效剂量(能导致接近最大Pgp功能抑制作用)的异搏定，也不能导致所述作用。还比较了很多其他恢复剂和底物。可以区分两种极端不同类型的调节剂/底物，其中一种能实现所述构象改变，在UIC2之后能抑制MM12.10的结合，而另一种则不能。第一组环孢菌素A(CSA)，PSC 833，长春碱和真菌霉素，第二组异搏定、Tween 80、硝苯地平、黄体酮、放线菌素D、哌唑嗪和短杆菌肽。还使用两种抗体进行了荧光共振能量转移和共聚焦显微镜测定我们的初步实验证实，在缺乏竞争的条件下，两种不同的抗体不能结合相同的Pgp分子。上面提到的我们的资料表明，可以区分相同细胞上的两种不同的Pgp群体。
通过同时进行三种方法研究了ACT，UIC2-转变和染色积累测试结果之间的相关性(参见图3)。R竞争，R活性和R转变参数，即在存在和缺乏竞争抗体的条件下测定的平均荧光强度的比例相互之间进行作图。与1.5-2倍的R转变值相比，CSA-诱导的R竞争为30-60倍。在上述实验中，Pgp功能的调节大致相同。所述功能调节一直伴随着UIC2-转变，而无论所述指示剂是柔红霉素(DNR)或钙黄绿素。与此同时，所述功能调节在ACT中并非总会导致很大的R竞争值。
由于ATP的耗尽会导致已知的UIC2反应性的提高[Mechetner EB.Roninson IB.单克隆抗体对P-糖蛋白介导的多药物抗性的有效抑制。Proceedings of the National Academy of Sciences，USA 895824-5828(1992)]，还研究了寡霉素或叠氮化钠和2-脱氧-D-葡萄糖处理对ACT结果的影响。从图4中可以看出，与CSA类似，在ACT中ATP的耗尽同样会产生大的R竞争值。
将抗Pgp抗体的可能的组合一个接一个地用在活的、Pgp阳性细胞上，用其他抗体对也能够观察到，在存在或缺乏调节剂的条件下，随后添加的抗体的结合存在显著差异(图5)。例如，在不存在调节剂、底物的条件下，首先添加结合MRK16的UIC2(参见上文引用的美国专利)或随后添加MM8.15抗体[Cianfriglia M.Loor F.通过温度和/或抗性调节剂调控人P-糖蛋白表位的表达。Anti-Cancer Drugs 5 655-665(1994)]，不会受到显著影响(最多50％)。不过，如果存在调节剂、底物的话，UIC2与上述四种抗体的任一种结合会受到完全抑制。
详细披露了本发明。附图归纳如下附图简述图1表示用恢复剂处理对Pgp-特异性抗体在KB-V1细胞上的结合比例的影响(流式细胞术曲线)。
图2表示在存在不同恢复剂的条件下，UIC2抗体对FITC-MM12.10抗体在NIH3T3 MDR1细胞上的结合的抑制作用(流式细胞术曲线)。
图3表示ACT(UIC2/FITC-MM12.10抗体对的R竞争)、UIC2-转变(R转变)和Pgp功能(R活性)之间的相关性研究。每一种符号表示独立的实验数据。
图4表示ATP-消耗试剂对NIH3T3-mdr细胞的影响(ACT)。
图5表示不同的抗体组合在NIH3T3细胞上的ACT研究结果。
图6表示CD4-连接对两种抗体结合比例的影响。
实施本发明的最佳方式本发明披露了一种用于检测包括P-糖蛋白和CD4在内的细胞表面受体、泵、蛋白的构象改变的抗体竞争方法。根据本发明的方法，将两种抗体和/或配体连接在由它们识别的受体、泵和/或蛋白上，并且通过结合的差异推断所述受体或抗原的构象状态或构象状态的改变。
在本发明的一种优选实施方案中，将其他受体、抗原、泵用在细胞表面或膜制备物上或用在分离的蛋白或人工生产的蛋白上，用于检测所述蛋白的构象状态或构象状态的改变，或检测其与配体、抗体、底物、调节剂的结合。
在一种优选实施方案中，本发明被用于与膜制备物上多种药物转运相关的P-糖蛋白或其他泵，或用于分离的蛋白或人工生产的蛋白，以便检测所述蛋白的构象状态或构象状态的改变，或用于检测其与配体、抗体、底物和调节剂的结合。
在一种实际应用中，本发明被用于检测P-糖蛋白与配体(即底物，恢复-化学敏化-调节剂)的相互作用、结合。
除了上述用途之外，本发明的方法提供了一种用于开发和/或检测新的恢复(＝化学敏化或调节)剂的、非常精确的和可以重现的方法。对于细胞表面P-糖蛋白泵蛋白来说，在评估恢复(＝化学敏化或调节)剂的调节能力方面是非常有用的，所述蛋白是导致源于人类的细胞系和细胞的多药物抗性的原因，用于基础研究、诊断和治疗等。
本发明的方法通常可用于任何类型的细胞表面泵，这些泵通常导致了所述多药物抗性。所述方法可有利地用于细胞表面P-糖蛋白泵，并且本发明主要是针对这一点进行说明的。不过，对于专业人员来说，显而易见的是，所附权利要求书的范围并不局限于上述蛋白的用途，而且，还可将其用于任何其他细胞表面泵和受体、配体结合蛋白。
根据本发明的方法，可以使用专业人员所已知的任何抗体或配体，所述抗体或配体能够与细胞表面上的受体、抗原、泵、膜制备物、分离的或人工蛋白起反应。并非仅仅是所述抗体或配体，通过化学或遗传工程方法制备的它们的不同部分也可以使用。
根据本发明的最优选的实施方案之一，将用不同荧光染料标记过的两种单克隆或多克隆抗体或配体同时或依次连接在由它们识别的Pgp表位上，并且测定其结合。优选通过流式细胞术或其他适合检测荧光的方法测定，以便根据两种信号的比例或根据该比例的改变推断由所述抗体或配体识别的受体或抗原的构象状态。
本发明的一种实施方案是将细胞表面上的受体、抗原、泵、膜制备物、分离的或人工蛋白用于检测所述蛋白的构象状态或构象的改变，或用于检测所述蛋白与配体、抗体、底物、调节剂的结合。所述检测基于结合抗体的某种间接的(生物素化，第二抗体的使用等)荧光信号。
根据本发明的另一种优选实施方案，细胞表面上的受体、抗原、泵，或膜制备物、分离的或人工蛋白的结合的检测是通过直接荧光标记进行的，并且检测特异性识别上述蛋白的配体。
在实际使用所述制剂的本发明的方法中，与所述蛋白结合并且荧光标记过的两种配体和抗体彼此竞争一个结合位点，或结合重叠的结合位点，或别构影响彼此的结合。
根据本发明方法的一种优选实施方案，仅对用于检测构象改变的抗体或配体之一进行标记，而另一种不进行标记，并且与标记过的试剂竞争，或别构影响其结合。
根据本发明方法的一种特别优选的实施方案，将用两种不同的荧光染料标记过的抗体或配体的混合物提供给生长或保存在微量滴定板上的细胞，并且将不同的试剂添加到孔中，并且通过合适的方法检测两种不同抗体或配体的结合比例，并且研究或测定所添加的试剂对结合的荧光分子的比例的影响。
上述方法的一种例子是生长或保存在微量滴定板上的表达任何P-糖蛋白的细胞系或来自体内的细胞质，将不同的调节剂(恢复剂等)或推测具有这种作用的物质、或它的不同浓度的溶液添加到滴定板的孔中，并且测定两种不同(例如绿色和红色荧光)抗-Pgp抗体的混合物，或者依次使用这两种抗体，并且(在洗掉未结合的抗体之后)检测两种荧光信号，确定所述孔的这两种信号的比例，并且由此选择对该比例具有最大影响的物质。
上述方法的另一种例子是生长或保存在微量滴定板上的表达CD4的细胞或细胞系，将不同的CD4-结合配体(金精三羧酸衍生物，gp120的遗传操作过的变体等)或推测具有这种作用的物质，或它的不同浓度的溶液添加到所述平板的孔中，并且测定两种不同的(例如绿色和红色荧光)抗CD4抗体的混合物，或依次使用这两种抗体，并且(在洗掉未结合的抗体之后)检测两种荧光信号，确定所述孔的这两种信号的比例，并且由此选择对该比例具有最大影响的物质。
本发明方法的另一种优选的实施方案是CD4分子的应用。
CD4分子在免疫学识别方面同样具有作用，不过，在淋巴细胞上，该分子的表达使得HIV病毒(导致AIDS)能进入CD4阳性细胞，这是通过HIV与CD4的已知表位的结合完成的。同时，CD4发生构象改变[Szabo，G.jr.，Pine，P.S.，Weaver，J.L.，Kasari，M.，Aszalos，A.通过光学漂白荧光共振能量转移措施，使用激光扫描显微系统进行表位作图。Biophys.J..61，661-670(1992)；Szabo，G.，jr.，Pine，P.S.，Weaver，J.L.，Rao，P.E.，Aszalos，A.CD4在配体结合之后CD4改变构象。J.Immunol..149，3596-3604(1992)；Szabo，G.Jr.，Pine，P.S.，Weaver，J.L.，Kasari，M.，Aszalos，A.在TcR/CD3-并列抑制状态下CD4的交联pFRET研究。Biophys.J.，.68，1170-1176(1995)；Yachou A和Sekaly RP.可溶性重组HN外被糖蛋白rgp120的结合，能诱导细胞膜锚定CD4分子的构象改变。Biochemical andBiophysical Research Communications 265428-433(1999)]。这种构象的改变同样体现了结合在其他分子表位上的两种抗体的结合比例的改变(图6)。这样，通过同时测定两种抗体的细胞表面结合，可以检测CD4构象的改变，并且可以识别CD4的特异性配体结合。
因此，采用本发明的方法可以寻找并且筛选新的天然的和人工的不是已知的结合CD4的配体，以便开发HIV治疗方法。所述方法还提供了根据上述理论对CD4分子或其片段进行荧光测定的可能性，所述分子是由活的或死亡的细胞或分离的或人工生产的细胞携带的，并且发现和/或分离以不同的CD4结合形式发生了突变或由于其他原因而改变了的病毒。
本发明的方法明显不同于以前所开发的方法，并且这也是该方法更有效的原因。在与Pgp相关的本发明方法的一种例子中，通过流式细胞术测出UIC2抗体的竞争(在CSA-处理的细胞上，在第二个步骤中使用FITC标记过的抗体)荧光强度表现出60倍的改变。这样，与UIC2转变相比，提高了构象改变检测的灵敏度。与UIC2转变相比，另一种差别是某些恢复剂被证明有效(CSA，长春碱、真菌霉素)，而其他恢复剂(异搏定，Tween 80)无效这一事实。因此，迄今为止，使尚不了解的恢复剂的类型、分类，不同恢复剂的分离成为可能。上面所提到的事实涉及到UIC2-转变实验和抗体竞争实验(″ACT″)之间的很大差别。
根据文献(参见上述美国专利)和抗体竞争实验(ACT)了解到，UIC2-转变实验的比例的特征是，在前一种情况下，当使用调节剂时，通常有多出2-4倍的UIC2抗体结合到细胞表面Pgp-s上。从图1和2的数据可以看出，UIC2信号的这种加强伴随着其他抗体结合(例如MM12.10)的很多倍(甚至是60倍)的改变，因此，可以更灵敏地检测导致所有上述现象的构象改变。这意味着我们的ACT方法同时意味着UIC2转变方法的显著发展，这种发展基于UIC2抗体结合的增强。由于上述某些恢复剂能导致UIC2转变，但是在两种抗体结合比例方面，不会导致与前者相当的改变(参见图3)，该ACT的使用并非简单地敏化UIC2-转变技术，而是一种不同的用于检测Pgp构象的技术、方法。
与测定R123的积累[Lee，JS.，Paull，.K.，Alvarez，M.Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates inthe National Cancer Institute Drug Screen.Mol.Pharmacol.46627-638(1994)]，或最近的钙黄绿素-AM[Homolya，L.，Hollo，Zs.，Germann，U.A.，Pastan，L，Gottesman，M.M.和Sarkadi，B.通过多药物抗性蛋白挤出的荧光细胞指示剂。Journal of BiologicalChemistry 268 21493-21496(1993)；Hollo，Zs.，Homolya，L.，Dayis，C.W.和Sarkadi，B.作为多种药物转运蛋白的荧光测定功能测试的钙黄绿素积累。Biochimica et Biophysica Acta 1191 384-388199420，21]；Homolya，L.，Hollo，Zs.，Mller，M.，Mechetner，E.B.，Sarkadi，B.用于定量评估肿瘤细胞中P-糖蛋白相关的多药物抗性的新方法。Br.J.Cancer 73 849-855(1996)；Hollo，Zs.，Homolya，L.，Hegeds，T.，Muller，M.，Szakacs，G.，Jakab，K.，Antal，F.，Sarkadi，B.人多药物抗性蛋白，P-糖蛋白和MRP1的平行功能和免疫学检测。Anticancer Res.18 2981]类似，在活细胞上进行的染料积累试验，是测定Pgp功能的一种非常有效的方法，该方法可用于诊断其他泵的存在。不过，该方法的突出缺陷是，它们只能在活细胞上使用，最好在取样现场使用。不过，同时本发明方法的一大优点或根据该方法的测定可能性是，该方法实施简单，并且在固定所述细胞之后的任何时间具有绝对的可靠性。不过，所述方法甚至可以以这样的方式实施，在用抗体标记之前固定所述细胞。在这种情况下，UIC2抗体的结合表明了在所述细胞表面上的Pgp分子是UIC2-结合构象的，同时其他抗体的结合(例如MM12.10)，表明了在存在调节剂(化学敏化剂、底物)的条件下，所述Pgps只能用UIC2标记。就是说，在这种情况下，我们在不用调节剂处理的情况下进行了实验，由此得到了比UIC2-转变测试更多的信息。
。
通过以下实施例对本发明作详细说明。不过，对于专业人员来说，必须理解的是，本发明可以通过不同于所披露的步骤和材料实现，并且，所附权利要求的范围并不局限于这些实施例。
材料和方法细胞系KB-3-1(Pgp-)和弱抗性KB-8-5和强抗性KB-V1(Pgp+)人表皮癌细胞系，NIH3T3 MDR1转染过的细胞系。这些细胞系来自MichaelGottesman博士的实验室(NIH，Bethesda)[例如，参见P-糖蛋白在多药物抗性KB细胞中的稳定性和共价修饰。Richert ND，Aldwin L，Nitecki D，Gottesman MM，Pastan I.Biochemistry 27 20 7607-13(1988 okt.4)；来自多药物抗性KB细胞的P-糖蛋白ATP-结合特征。Cornwell MM，Tsuruo T，Gottesman MM，Pastan I.FASEB J.1 51-4(1987 julius 1)]。
所述细胞系可以作为单层培养物，在37℃下，在5％CO2中，在Dulbecco′s基本必需培养基(添加了10％的胎牛血清，25微克/毫升庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺)上培养。在存在合适药物(180nM长春碱(KB-V1)，25nM秋水仙素(KB-8-5)，和690nM阿霉素(NIH3T3 MDR1))的条件下，连续培养所述药物抗性细胞。在该实验之前2-3天，对所述细胞进行胰蛋白酶消化，并且在不含药物的培养基中温育直到使用。
药物异搏定，长春碱，环孢菌素A，放线菌素D，哌唑嗪，黄体酮，真菌霉素，硝苯地平，短杆菌肽Sigma-Aldrich(Budapest)。Tween 80SERVA(Heidelberg，Germany)。用于处理细胞的调节剂浓度为50μM异搏定，10μM环孢菌素A，70μM长春碱，0.002％ Tween 80，10μM真菌霉素5μM放线菌素D，10μM哌唑嗪，10μM黄体酮，50μM硝苯地平，5μM短杆菌肽。ATP-消耗试剂的浓度为5μM寡霉素和5μM叠氮化钠(与5mM 2-脱氧-D-葡萄糖一起使用)。细胞培养基和添加剂Sigma。6-(荧光素-5-羧酰胺基)己酸琥珀酰酯(5-sFx)和荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)分子探针(Eugene，OR)。所有其他化合物都是分析级的(Sigma)。在本发明中所使用的FITC偶联方法的说明，可以参见有关文献[DePetris S.Methods in Membrane Biology Vol.9.(Ed.Korn，E.D.)Plenum Press，New York，pp.1-201(1978)；Spack，EG.Jr.Packard，B.Wier，ML.Edidin，M.用于减少罗丹明标记过的抗体的非特异性染色的疏水性吸收层析。Anal.Biochem.158 233-237(1986)]。
ACT方法的说明按常规方法对所述细胞进行胰蛋白酶消化，用PBS(磷酸缓冲的盐水，pH7.4)洗涤2次。在37℃下，用不同的药物、调节剂将106细胞/1ml PBS(加8mM葡萄糖)预温育20分钟，在不洗涤所述细胞的情况下，将第一(″A″)单克隆抗体添加到所述样品中。再温育(在37℃下)30分钟之后，将FITC或5-sFx偶联的第二(″B″)抗体添加到所述样品中(同样不洗涤所述细胞)，并且在37℃下再温育30分钟。对于UIC2-转变测试来说，用UIC2抗体温育所述细胞，洗涤2次，并且在冰上，在100μl的PBS中，用山羊抗小鼠IgG2a FITC偶联物(F/P＝4，3，Sigma)温育45分钟。将洗涤2次的所述样品重新悬浮在500μl PBS中，并且用流式细胞计分析。所使用的抗体浓度为8μg/ml MRK16，MC57，MM8.15，MM12.10和10μg/ml UIC2。柔红霉素(DNR)和钙黄绿素积累测试参见Goda，K.等Practical guide to physical ahalysis of cellsurface receptors，Ed.Krasznai，Z.and Matyus，L.，pp.110-125(1998)；Homolya，L.，Hollo，Zs.，Germann，U.A.，Pastan，L，Gottesman，M.M.和Sarkadi，B.由多药物抗性蛋白挤出的荧光细胞指示剂。Journal of Biological Chemistry 268 21493-21496(1993)；Hollo，Zs.，Homolya，L.，Davis，C.W.和Sarkadi，B.作为多种药物转运蛋白的荧光测定功能分析的钙黄绿素积累。Biochimica etBiophysica Acta 1191 384-388 199420，21]。
通过Becton Dickinson FACScan(Mountain View，CA)测定每个细胞的平均荧光强度。通过碘化丙锭染色从所述分析中排除死亡细胞。用对数值的形式对荧光信号进行作图，这两种水平的分析是通过BDISCellQuest和FloWin软件(SoftFlow Ltd.，Pecs，Hungary)进行的。
抗体和标记UIC2[Mechetner EB.Roninson IB.用单克隆抗体有效抑制P-糖蛋白介导的多药物抗性。Proceedings of the National Academy ofSciences，USA 89 5824-5828(1992)]，MM12.10[Romagnoli G.PoloniF.Flego M.Moretti F.Di Modugno F.Chersi A.Falasca G.Signoretti C.Castagna M.Cianfriglia M.通过合成肽扫描和噬菌体展示技术对外部MDR1 P-糖蛋白结构域的单克隆抗体MM12.10进行表位作图。Biol.Chem.380 553-559(1999)]MRK16[Gottesman，M.M.，Hrycyna，C.A.，Schoenlein，P.V.，Germann，U.A.和Pastan，I.多种药物转运蛋白的遗传学分析，Annu.Rev.Genet.29，607-649(1995)]抗体。5-sFx[6-(荧光素-5-羧酰胺基)-乙酸琥珀酰酯]和X-TRITC(罗丹明redTM-X琥珀酰酯)标记是按照标准方法进行的。
实施例1在临床上，主要是在血液增殖病理学方面，通过本发明的ACT方法研究Pgp表达，或检测多药物抗性细胞或被怀疑具有抗性的细胞上的Pgp，用于人类诊断目的。对于后者来说，本发明方法与在活细胞上测定染色泵的方法相比(钙黄绿素-AM或R123分析等)，本发明方法的显著优点是在固定之后标记过的细胞可以长时间保存，可以运输，并且，所述样品可以在远离其来源的地方分析，或者该方法甚至可以用采集的样品进行。根据我们的经验，我们的ACT方法比UIC2实验更灵敏(UIC2，钙黄绿素和ACT的更详细的比较参见下文)。
就肿瘤治疗而言，经常出现的并且难以回答的问题是，所述细胞是否是多药物抗性的，这一事实会影响治疗方案的选择。为了确定药物抗性，可以进行染料积累实验或抗体结合实验。前者的缺陷是，它只能用新鲜样品提供可靠的结果。后者的缺陷是，它只能检测泵蛋白的存在。通过在CSA之前和之后比较Pgp的UIC结合(最常见于多药物抗性的背景中)，检测功能性Pgp分子是可行的。该方法的一种更灵敏的改变形式是ACT。
用PBS(磷酸缓冲的盐溶液，pH7.4)将来自肿瘤细胞的单细胞悬浮液，例如白血病细胞洗涤2次。确定106细胞/1ml PBS(+8mM葡萄糖)细胞浓度，并且在用10μM CSA预处理10分钟之后，将所述样品分成两等份。然后，将一份样品(I)用浓度为10-100μg/ml的第一(″A″)单克隆抗体预温育。在第二份样品(II)中不添加抗体，而添加PBS。再温育30分钟(37℃)，以1-100μg/ml的浓度添加FITC或5-sFx偶联的第二(″B″)抗体(不洗涤细胞)，并且在37℃下再温育30分钟。用PBS洗涤所述样品2次，重新悬浮在1ml PBS中，并且用流式细胞计分析。在通过碘化丙锭染色排除死亡细胞之后，测定每个细胞的平均荧光强度。ACT值是通过样品I和II的平均荧光强度的比例计算的，即ACT＝II/I。该方法与固定细胞相同。在后一种情况下，在用抗体标记之后，用1％甲醛溶液(用PBS配制)，在4℃下固定所述样品30分钟，然后可以将所述细胞在4℃下保存在相同的甲醛溶液中(至少保存数周时间)。″A″抗体UIC2，″B″抗体MM1210或MRK16，所有这三种抗体都是以饱和浓度使用的。
所述前一种方法还可用于预测所设计的细胞抑制药物组合的效力。在这种情况下，将一等份的具有在起始部位(即血液)可预期的药物浓度的天然细胞与药物(而不是CSA)一起温育，并且进行ACT实验(按照上述方法进一步分割所述样品)。用这种方法制备的两种样品的平均荧光值的比例(在扣除自身荧光值之后)得到了ACT值ACT＝II/I，如果该值接近0的话，表示所述药物或药物组合与Pgp相互作用，就是说对于特定的样品或患者，这种治疗方法可能是无效的，或者甚至是其某些成分的多药物抗性调节特征，而大约0.5(0.2-0.9)的值或在没有药物的情况下测定的该值与所计算的ACT相同，表示缺乏Pgp和所使用的药物之间的相互作用，即计划治疗可能有效。
实施例2通过快速定量分析检测在Pgp调节期间出现的构象-拓扑学关系改变。这种实验方法是用于寻找更有效调节剂的新方法，并且可用于检测和研究在Pgp和不同的恢复剂和底物相互作用期间出现的构象改变。可将该方法用于筛选、测试恢复剂，或用于在化合物以前是已知的情况下确定这种类型的作用。与UIC2转变方法相比，我们的ACT方法只能用于检测最有效的恢复剂，而所述转变方法甚至能够检测异搏定作用。就是说，用不同于现有制剂的方法选择性检测所述恢复剂，并且选择性检测最有效的制剂，导致了可以完成最大的构象改变。
使用NIH3T3 MDR(或用人MDR1转染过的其他细胞系)的培养物[Homolya L.，Hollo Z.，Germann UA，Pastan I.，Gottesman MM.，Sarkadi B.由多药物抗性蛋白挤出的荧光细胞指示剂。Journal ofBiological Chemistry 268，29 21439-6(1993.okt.15)]。所述细胞通常是以单层培养物形式在37℃下，在5％CO2中，在Dulbecco′s基本必需培养基(存在10％胎牛血清，25μg/ml庆大霉素和2mM L-谷氨酰胺)中培养的。所述药物抗性细胞是在存在合适药物的条件下连续培养的(所述药物对特定细胞来说是最佳的，例如，在我们的实验中，是在存在690nM阿霉素的条件下进行的)。在该实验之前2-3天，对所述细胞进行胰蛋白酶消化，并且在不含药物的培养基中温育直到使用。用PBS(+8mM葡萄糖)洗涤所述细胞2次，在37℃下用不同的药物、调节剂预温育20分钟。在不洗涤所述细胞的情况下，将第一(″A″)单克隆抗体添加到所述样品中。在进一步温育(37℃)30分钟之后，将FITC或5-sFx偶联的第二(″B″)抗体添加到所述样品中(同样不洗涤细胞)，并且在37℃下温育30分钟。按常规方法重新悬浮洗涤2次的样品，例如悬浮在500μl PBS中，并且用流式细胞计分析。所添加的抗体浓度为8μg/ml MRK16，MC57，MM8.15，MM12.10和10μg/ml UIC2。通常，适合以饱和浓度使用所述抗体，尤其是对于第一(″A″)抗体来说更是如此。确定每个细胞的平均荧光强度。通过碘化丙锭染色从所述分析中排除死亡细胞。所述处理可以在微量滴定板上进行，所述洗涤-离心步骤可以在任何实验室中解决，或者所述步骤还可以自动化。除了流式细胞测定评估之外，还可以在3次PBS洗涤和最后的抗体温育之后用荧光微量滴定板读出每个孔的荧光强度，并且利用这些值可以计算出每孔的ACT值。
实施例3用于证实和研究Pgp的所谓其他构象状态的方法[例如Mechetner，E.B.，Schott，B.，Morse，SB.，Stein，W.，Druley，T.，Davis，K.A.，Tsuruo.T.和Roninson，I.可通过示差免疫反应性检测的与构象转变相关的P-糖蛋白功能。Proceedings of the National Academyof Sciences，USA 94 12908-12913(1997)]。
如果对两种抗体，即UIC2和MRK16进行标记的话，一种用绿色荧光染料(例如FITC)，另一种用红色荧光染料(例如TRITC或PE)标记，并且用流式细胞计或荧光微量滴定板读数器(或者甚至使用以显微镜为基础的仪器)测定两种不同颜色荧光的比例，然后还可以用这种具有较高灵敏度的方法检测更细微的差异(例如，在这种情况下，通过所述调节剂的作用UIC2信号增强，MRK16信号减弱)。由于在活细胞或膜制备物上在UIC2和MM12.10之间荧光共振能量转移的程度导致低于20％的强度改变，并且在这种级别上的改变最多可以预期为这种影响的结果，这种因素不会使我们的方法的“双色”应用复杂化。
实施例4恢复剂对Pgp-特异性抗体(位于ACT KB-V1细胞上)的结合比例的影响(图1)。
用调节剂(CSA或异搏定b-d，f)预处理所述细胞，或者在不进行预处理(对照a，e)的条件下在37℃下温育30分钟。然后用第一(″A″)抗体处理所述细胞(在有或没有UIC2，MM8.1或MC57的条件下温育)30分钟，并且用FITC-MM12.10(″B″)抗体标记所述细胞。有关曲线是来自每一种典型测定的流式细胞测定直方图。连续线条无″A″的对照；粗线条″A″＝UIC2；点划线″A″＝MM8.15(a-d)或MC57(e-f)。在两个独立实验中，通过间接免疫荧光证实″A″抗体。
实施例5流式细胞术实验数据(图2)在存在恢复剂的条件下，UIC2抗体能抑制FITC-MM12.10抗体结合在NIH3T3 MDR1细胞上。在有或没有UIC2预处理的条件下平均FITCMM12.10荧光强度的比例提供了R竞争值(黑色柱)。用恢复剂预处理细胞20分钟，并且用UIC2抗体再温育20分钟，最后使用FITC-MM12抗体(再温育30分钟)。在所述温育步骤之间不洗涤细胞。恢复剂的浓度异搏定(50μM)，Tween 80(0.002％)，长春碱(70μM)，环孢菌素A(10μM)，真菌霉素(10μM)。通过间接免疫荧光检测UIC2-转变；白色柱表示在进行和不进行恢复处理的条件下检测到的平均荧光强度的比例(R转变)。在插入的附图中，相同的UIC2-转变数据是以放大的比例作图的。示出了4-6次独立测定的平均值(±SEM)。
实施例6同时ACT(图3)研究(R竞争，UIC2/FITC MM12.10抗体对)，UIC2-转变(R转变)和Pgp功能(R活性)之间的相关性。每一种符号表示独立的实验数据。
实施例7用本发明的ACT方法研究了ATP-消耗试剂对NIH3T3-mdr细胞的作用。该研究的结果如图4所示。
实施例8在NIH3T3 MDR1细胞上进行ACT实验，使用不同的抗体组合。在UIC2或MM12.10(未用染料偶联)预处理之后，用FITC或5sFx偶联的MM12.10，UIC2，MRK16和MM18.15抗体标记所述细胞。在添加所述抗体之前，用CSA预处理所述细胞(灰色柱)或不进行预处理(黑色柱)。在图5中示出了两个独立实验的结果。
实施例9研究了CD4-连接对两种抗体结合比例的影响。在gp120，gp120+抗-gp120，或Leu3a预处理之后，同时用OKT4E-FITC(黑色柱)和OKT4-PE(灰色柱)抗体标记CD4-阳性人淋巴细胞的细胞表面受体，并且通过流式细胞术测定每个细胞的平均FITC(绿色)和PE(红色)荧光强度。在图6中示出了两个独立实验的结果。
权利要求
1.一种检测细胞表面受体、泵或蛋白的存在和/或构象改变的方法，包括在由抗体识别的受体、泵或蛋白上结合至少两种不同的抗体，并任选结合一种配体，并且测定所述抗体结合的改变。
2.如权利要求1的方法，其中，所述抗体是单克隆或多克隆抗体或其片段。
3.如权利要求1的方法，其中，使用单克隆抗体。
4.如权利要求1-3中任意一项的方法，其中，所述抗体之一是UIC2和/或其片段。
5.如权利要求1-4中任意一项的方法，其中，所述蛋白是P-糖蛋白。
6.如权利要求1-4中任意一项的方法，其中，所述蛋白是CD4细胞表面蛋白。
7.如权利要求1-6中任意一项的方法，其中，所述配体是底物或恢复性化学敏化和/或调节剂。
8.如权利要求7的方法，其中，所述底物是环孢菌素A，PSC833，长春碱或真菌霉素。
9.如权利要求7的方法，其中，所述底物是异搏定，Tween 80，硝苯地平，黄体酮，放线菌素D，哌唑嗪或短杆菌肽。
10.如权利要求4的方法，其中，第二抗体是MM12.10，MC57，MM8.15或MRK16。
11.如权利要求6的方法，其中，所述配体是抗CD4抗体，HIV病毒的任何成分或金精三羧酸。
12.如权利要求11的方法，其中，所述HIV病毒成分是天然存在的或人工生产的gpl20蛋白形式。
13.用于测定在多药物抗性情况下有效的细胞抑制药物组合的方法，其中，在体外将所述天然细胞与要测试的药物或药物组合进行组合，并且按照权利要求1的方法测试所述样品。
14.如权利要求13的方法，其中，用环孢菌素A调节剂实施权利要求1的方法。
15.用于检测多药物抗性调节剂的效力的方法，其中，在有已知调节剂或要测试的调节剂的条件下实施权利要求1的方法，并且比较所得到的活性值。
16.如权利要求15的方法，其中，在对照试验中使用环孢菌素A，PSC833，长春碱或真菌霉素。
17.如权利要求1-16中任意一项的方法，其中，至少一种抗体是标记过的。
18.如权利要求17的方法，其中，至少一种抗体是用荧光染料标记过的。
19.如权利要求17或18的方法，其中，两种抗体都标记过。
20.如权利要求19的方法，其中，所述两种抗体是用两种不同的荧光染料标记的。
21.如权利要求17-20中任意一项的方法，其中，所述测定是通过流式细胞术或适合测定荧光的其他方法完成的。
22.如权利要求21的方法，其中，使用了荧光微量滴定板方法。
23.如权利要求1-21中任意一项的方法，其中，在标记和结合测定之间固定用抗体标记的细胞。
24.如权利要求1-21中任意一项的方法，其中，在用抗体标记之前固定细胞。
25.用于检测受体，泵和蛋白的存在和构象改变，从而确定多药物抗性情况下有效的药物组合和/或用于检测调节剂的效力的诊断试剂盒，包含能够检测所述受体、泵或蛋白的第一抗体，能够检测所述受体、泵或蛋白的第二抗体，任选包含其他配体，以及一种系统，它能提供一种用于检测结合的系统。
全文摘要
本发明涉及对细胞表面受体、泵或蛋白的存在和/或构象改变的检测，此时两种不同的抗体和任选的配体与由所述抗体识别的泵和/或蛋白结合，并且检测抗体结合的改变。可将所述方法用于测定在多药物抗性中有效的细胞抑制药物联合，其中，在体外将所述天然细胞与要测试的药物或药物联合混合，并且用上述方法测试所述样品。所述方法还可用于检测多药物抗性调节剂的效力，其中，本发明的方法是在存在已知调节剂或要测试的调节剂的条件下进行的，并且比较了所得到的活性值。另外，本发明的目的是一种诊断试剂盒，用于检测受体、泵和蛋白的存在和构象改变，用于测定多药物抗性情况下的有效药物联合和/或用于检测包括能够检测所述受体、泵或蛋白，任选其他配体的第一种抗体，和一种用于检测结合的系统的调节剂的效力。
文档编号G01N33/50GK1703620SQ02809317
公开日2005年11月30日 申请日期2002年3月1日 优先权日2001年3月2日
发明者加伯·斯扎伯, 乔尔吉·拉斯特伊克, 亨里塔·纳吉, 卡塔林·戈达 申请人:软流匈牙利公司