专利名称：疾病治疗用试剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及疾病治疗用试剂，具体涉及通过T细胞表面受体⑶4活化⑶4+⑶25+调节T细胞而进行的治疗。本发明涉及用于鉴定此类试剂、能够活化⑶4+⑶25+调节T细胞的试剂的筛选方法，以及它们在治疗疾病、特别是自体免疫疾病中的应用和在体外进行的方法中的应用。
背景技术：
T细胞属于淋巴细胞并且负责免疫系统中的许多关键功能。在哺乳动物中，T细胞(胸腺细胞)在胸腺中由在骨髓中形成的造血祖细胞分化。该分化过程的一部分是表达特征性表面受体，主要是糖蛋白⑶4和⑶8。表达⑶4的T细胞(称为⑶4+T细胞)与MHCII 类复合物结合(Reinerz 和 Schlossman, Cell 19,821-827 (1980) ;Reinerz 等，PNAS USA77，1588-1592(1980))，同时 CD8+T 细胞与 MHC I 类复合物结合(Fitch,Microbiol. Rev. 50，50-69(1 986))。T细胞释放于血液和淋巴中。⑶4阳性细胞可以分化为T辅助细胞亚群(Thl和Th2)以及调节T细胞。调节T细胞还能被分为亚类，得到评估最多的是源自胸腺的亚类(nTreg)和可诱导亚类(iTreg)。虽然存在其他Treg亚群(例如，Trl或Th3)，但本发明涉及⑶4阳性的源自胸腺的Treg(nTreg)和可诱导Treg,两者均表达转录因子Foxp3。作为主要差异,Foxp3在nTreg中稳定且持久地表达从而证实为不可逆Treg表型；而可诱导Treg展现出可诱导的或瞬时的Foxp3表达,该表达是可逆的。Treg分泌如IL_10、TGF ^或IL-35等免疫调节性细胞因子并且经由数种机制在效应T细胞上发挥抑制活性，例如经由抑制促炎性细胞因子的生成、直接细胞-细胞接触和调节抗原呈递细胞(APC)上的活化状态或功能(Shevach等，Immunity (2009) 30 ;636_645)。⑶4阳性⑶25 Treg细胞的主要特征是其无能表型(anergic phenotype),意味着其在受到TCR刺激时不会增殖，可通过添加外源性IL-2恢复。Treg的显著作用包括维持与免疫响应和自身耐受性相关的体内平衡。Treg功能障碍与自体免疫疾病相关。通常，调节T细胞可经由表面受体糖蛋白⑶4、⑶25分离并通过F0XP3的细胞内染色来表征。另一种表面蛋白的代表为⑶127 (IL-7R)，其在Treg细胞中下调，且可用于进一步纯化Treg0另外,表达CD39 (核酸内切酶)(Borselino等，Blood (2007) 110,1225-1232)或 GARP (糖蛋白 A 重复主导物(GARP 或 LRRC32) (Wang 等，PNAS (2009) 106，32.13439-13444)。人⑶4在12号染色体上编码并且术语免疫球蛋白(Ig)超家族。其作为T细胞表面受体的天然功能与通过结合MHC II类复合物的T细胞活化有关。另外，CD4可以与HIV-lgpl20蛋白、P4HB/CDI蛋白和人疱疹病毒HHV-7衣壳蛋白结合。与HIV_lgpl20和Vpu蛋白的相互作用也已有报道。⑶4具有458个氨基酸。肽序列如图I所示。UniProt条目P01730提供了 CD4的域结构，如表I和图6中所示。前25个氨基酸是信号肽，其在生物活性形式中被切去。第26位至396位构成了胞外域，随后是第397位至418位的跨膜区。Asn296和Asn325是已知的糖基化位点(KSnig等，J. Biol. Chem. 263，9502-9507 (1988) ；Carr 等，J. Biol. Chem. 264，21286-21295 (1989))。最后一部分(第419位至458位)是胞质域。此处为酪氨酸蛋白激酶LCK(p56lek)(Rudd 等，PNAS USA 85,5190-5194(1988) ;Veillette 等，Cell 55,301(1988))的结合位点，其为由与CD4结合的配体活化的信号转导通路的一部分。表I.显示CD4的域结构的表格(依据UniProt P01730)
权利要求
1.一种筛选能与CD4结合的分子的方法，所述方法包括 (a)提供ー种或多于ー种候选分子； (b)确定所述ー种或多于ー种候选分子是否能与人CD4的一个或多于ー个以下区域结合氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192 ;和 (c)将步骤(b)所确定的分子选定为能与CD4结合。
2.如权利要求I所述的方法，其中，步骤(b)还包括确定所述ー种或多于ー种候选分子是否能与人⑶4的至少ー个以下氨基酸结合26、156、159和161。
3.如权利要求I或权利要求2所述的方法，其中，步骤(b)包括确定所述ー种或多于ー 种候选分子是否能在没有盐桥的情况下与CD4结合。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述ー种或多于ー种候选分子是抗体、源自抗体的分子、肽、寡核苷酸、siRNA、模拟表位、肽模拟物、折叠体、小分子、基于天然或エ程化脂质运载蛋白的识别蛋白、DARPin、纤连蛋白、Affibody、Kunitz型抑制剂、肽适体、核酶或毒素。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述抗体是人源化抗体或骆驼抗体。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述ー种或多于ー种候选分子是抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含BT061轻链的⑶Rl和⑶R2以及BT061重链的⑶Rl和CDR3，并且在所述CDR序列中可选地具有氨基酸取代，条件是(i)轻链CDRl 包含Ser32 ；Gly33 ;和 Tyr34 ；(ii)轻链CDR2 包含Leu54 和 Ile57 ；(iii)重链CDRl 包含:Asp31、Glu31、Thr31、Cys31、Pro31、Met31 或 Tyr31 ;和(iv)重链CDR3 包含:Tyrl03、Phel03 或 Hisl03 ；Argl04 ；Tyrl05 ；Aspl06 ;和 Trpl 10,PhellO、His 110 或 TyrllO。
7.如权利要求6所述的方法，其中，BT061轻链的⑶Rl和⑶R2以及BT061重链的⑶Rl和CDR3的序列中的所述氨基酸取代选自表4和表5中所列的那些氨基酸取代。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Tyr53或Phe53的轻链和含有Ser28的重链。
9.如权利要求6 8中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Asp64的轻链和/或含有Glu 56的重链。
10.如权利要求6 9中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段还包含BT061轻链的⑶R3和/或BT061重链的⑶R2，并且在这些⑶R的序列中可选地具有氨基酸取代，其中所述取代选自表4和表5中所列的那些氨基酸取代。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(a) (c)在计算机系统上进行。
12.如权利要求11所述的方法，所述方法还包括步骤(d):制备步骤(c)中所选定的分子。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法还包括步骤(e):使步骤(d)中制备的分子在体外与CD4+细胞接触或与包含人CD4的一个或多于ー个以下区域的肽或多肽接触氨基酸148 154、氛基酸164 168和氛基酸185 192。
14.如权利要求13所述的方法，其中，步骤(e)包括确定步骤(d)中制备的分子是否 (i)与包含人CD4的一个或多于ー个以下区域的肽结合氨基酸148 154、氨基酸.164 168和氨基酸185 192 ； (ii)活化CD4+CD25+调节T细胞；和/或 (iii)减少⑶4表达细胞上的⑶4受体表达。
15.如权利要求I 10中任一项所述的方法，其中，步骤(a) (c)在体外进行，并且步骤(b)包括使所述ー种或多于ー种候选分子与包含人CD4的一个或多于ー个以下区域的肽或多肽接触氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192。
16.如权利要求15所述的方法,其中,所述ー种或多于ー种候选分子是分子库。
17.如权利要求16所述的方法，其中，所述库是噬菌体展示库。
18.如权利要求14 17中任一项所述的方法，其中，所述确定步骤包括进行X射线晶体学分析或NMR并且选择在没有盐桥的情况下与所述肽或多肽结合的分子。
19.如权利要求15 18中任一项所述的方法，所述方法还包括步骤(d)和/或步骤(e)，其中步骤(d)为对步骤(c)中所选定的分子的活化CD4+CD25+调节T细胞的能力进行筛选，步骤(e)为对步骤(c)中所选定的分子的減少在CD4表达细胞上的CD4受体表达的能力进行筛选。
20.如权利要求13 19中任一项所述的方法，其中，所述肽或多肽被固定于膜或等同的合适表面，或者与磁性珠偶联。
21.如权利要求13 20中任一项所述的方法，其中，所述肽或多肽包含人CD4的Ig样C2型I域或包含人⑶4的Ig样V型域和Ig样C2型I域。
22.如权利要求13 21中任一项所述的方法，其中，所述肽或多肽模拟野生型CD4表位的构象。
23.如权利要求14 22中任一项所述的方法，其中，所述接触步骤包括使所述肽和所述分子与具有BT061的重链和轻链可变域的竞争抗体或抗体片段接触，以确定所述候选分子或所选定的分子是否能阻断所述竞争抗体或抗体片段与所述肽或多肽的所述区域的结合。
24.一种制备治疗性组合物的方法，所述方法包括 (a)利用权利要求14或权利要求19所述的方法选择经确定能够活化CD4+CD25+调节T细胞的分子；和 (b)制备包含所选分子的治疗性组合物。
25.一种能通过权利要求24所述方法获得的治疗性组合物，其中，所述分子不包含BT061 重链的 CDR1、CDR2 和 CDR3 以及 BT061 轻链的 CDR1、CDR2 和 CDR3。
26.—种筛选能与CD4结合的抗体或抗体片段的方法，所述方法包括 (a)提供抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含BT061轻链的CDRl和CDR2以及BT061重链的⑶Rl和⑶R3，并且在所述⑶R序列中可选地具有氨基酸取代，条件是(i)轻链CDRl 包含Ser32 ；Gly33 和 Tyr34 ；(ii)轻链CDR2 包含Leu54 和 Ile57 ；(iii)重链CDRl 包含:Asp31、Glu31、Thr31、Cys31、Pro31、Met31 或 Tyr31 ;和(iv)重链CDR3 包含:Tyrl03、Phel03 或 Hisl03 ；Argl04 ；Tyrl05 ；Aspl06 ;和 Trpl 10,PhellO、His 110 或 TyrllO ； (b)确定所述抗体或抗体片段是否能与CD4结合；和(C)将步骤(b)所确定的抗体或抗体片段选定为能与CD4结合， 其中，所述抗体或抗体片段不包含BT061重链的⑶R1XDR2和⑶R3以及BT061轻链的CDR1、CDR2 和 CDR3。
27.如权利要求26所述的方法，其中，BT061轻链的⑶Rl和⑶R2以及BT061重链的CDRl和CDR3的序列中的所述氨基酸取代选自表4和表5中所列的那些氨基酸取代。
28.如权利要求26或权利要求27所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Tyr53或Phe53的轻链和含有Ser28的重链。
29.如权利要求26 28中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Asp64的轻链和/或含有Glu56的重链。
30.如权利要求26 29中任一项所述的方法，其中，所述抗体或抗体片段还包含BT061轻链的⑶R3和/或BT061重链的⑶R2，并且在这些⑶R的序列中可选地具有氨基酸取代，其中所述取代选自表4和表5中所列的那些氨基酸取代。
31.如权利要求26 30中任一项所述的方法，其中，步骤(a) (c)在计算机系统上进行。
32.如权利要求31所述的方法，所述方法还包括步骤(d):制备步骤(c)中所选定的抗体或抗体片段。
33.如权利要求32所述的方法，所述方法还包括确定步骤(d)中制备的抗体或抗体片段是否 ⑴活化CD4+CD25+调节T细胞； (ii)与⑶4的一个或多于ー个以下区域结合氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192 ;和/或 (iii)下调⑶4表达细胞上的⑶4表达。
34.如权利要求26 31中任一项所述的方法，其中，步骤(a) (c)在体外进行。
35.如权利要求34所述的方法，其中，步骤(b)包括确定所述抗体或抗体片段是否 ⑴活化CD4+CD25+调节T细胞； (ii)与⑶4的一个或多于ー个以下区域结合氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192 ;和/或 (iii)下调⑶4表达细胞上的⑶4表达。
36.如权利要求14、19,33和35中任一项所述的方法，其中，所述⑶4表达细胞是PBMC。
37.一种制备治疗性组合物的方法，所述方法包括 (a)选择根据权利要求33或35鉴定为能够活化CD4+CD25+调节T细胞的抗体或抗体片段；和 (b)制备包含所选分子的治疗性组合物。
38.一种能通过权利要求37所述方法获得的治疗性组合物。
39.ー种能够活化CD4+CD25+调节T细胞的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含BT061轻链的⑶Rl和⑶R2以及BT061重链的⑶Rl和⑶R3，并且在所述⑶R序列中可选地具有氨基酸取代，条件是(i)轻链CDRl 包含Ser32 ；Gly33 ;和 Tyr34 ；(ii)轻链CDR2 包含Leu54 ;和 Ile57 ；(iii)重链CDRl 包含:Asp31、Glu31、Thr31、Cys31、Pro31、Met31 或 Tyr31 ;和(iv)重链CDR3 包含:Tyrl03、Phel03 或 Hisl03 ；Argl04 ；Tyrl05 ；Aspl06 ;和 Trpl 10,PhellO、HisllO 或 TyrllO， 且其中所述抗体或抗体片段不包含BT061重链的⑶R1、⑶R2和⑶R3以及BT061轻链的 CDR1、CDR2 和 CDR3。
40.如权利要求39所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含以下序列 102030405060DIVMTQSPDS LAVSLGERAT INCXXXXXXS XSGYSYXYffY QQKPGQPPKL LIYLASILEX 708090100110120GVPDRFSGSG SGTDFTLTIS SLQAEDVAVY YCQHSXXXPff XFGQGTKVEI KRTVAAPSVF 130140150160170180IFPPSDEQLK SGTASVVCLL NNFYPREAKV QffKVDNALQS GNSQESVTEQ DSKDSTYSLS 190200210 218STLTLSKADY EKHKVYACEV THQGLSSPVT KSFNRGEC 其中，处于第24 29、31、37、60、96 98和101位的氨基酸选自表4中相应位置所示的那些氨基酸， 并且还包含以下序列 102030405060EEQLVESGGG LVKPGGSLRL SCAASGFSFS XXXXYffLRQA PGKGLEffIGV XXXXXXXXXX 708090100110120XXXXXXXGRF TISRDDSKNT VYLQMNSLKT EDTAVYYCSA SYXRYDXXXX FXXffGQGTLV 130140150160170180TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSffNSGAL TSGVHTFPAV 190200210220230240LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE 250260270280290300LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE 310320330340350360EQYNSTYRVV SVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP 370380390400410420SRDELTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD 430440450 454KSRffQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK 其中，处于第31 34、51 67、103、107 110、111和112位的氨基酸选自表5中相应位置所示的那些氨基酸。
41.如权利要求39所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含来自BT061轻链的CDRl的序列SGYSY和/或来自BT061轻链的CDR2的序列LASILE和/或来自BT061重链的⑶R3的序列YYRYD。
42.如权利要求39所述的抗体或抗体片段，其中，所述CDR序列中的所述氨基酸取代是空间等排变体。
43.一种能活化CD4+CD25+调节T细胞的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含与抗体BT061的V域同性至少为80%的V域，所述V域包含 (i)轻链V域的⑶Rl中的序列基序SGYSY； (ii)轻链V域的⑶R2中的序列基序LASILE;和 (iii)重链V域的⑶R3中的序列基序3￥乂1^0，其中父为￥、？或!1， 前提条件是所述抗体或抗体片段不包含与抗体BT061的V域同一性为100%的V域。
44.如权利要求39所述的抗体或抗体片段，其中，BT061轻链的⑶Rl和⑶R2和/或BT061重链的⑶Rl和⑶R3的序列中的氨基酸取代选自表4和表5中所列的那些氨基酸取代。
45.如权利要求39或权利要求44所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Tyr53或Phe53的轻链和/或含有Ser28的重链。
46.如权利要求39、44或45中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Asp64的轻链。
47.如权利要求39、44 46中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段包含含有Glu56的重链。
48.如权利要求39、44 47中任一项所述的抗体或抗体片段，其中，所述抗体或抗体片段还包含BT061轻链的⑶R3和/或BT061重链的⑶R2，并且在所述⑶R序列中可选地具有氨基酸取代，其中所述取代选自表4和表5中所列出的那些氨基酸取代。
49.如权利要求39、44 48中任一项所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含BT061轻链的所述CDR序列和BT061重链的所述CDR序列并具有单个氨基酸取代，其中所述取代为 ⑴所述重链中的A63G ； (ii)所述重链中的R33K;或 (iii)所述轻链中的L98I。
50.如权利要求39、44 48中任一项所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包含BT061轻链的所述CDR序列和BT061重链的所述CDR序列和双氨基酸取代，其中所述取代为 ⑴所述重链中的R33K和A63G ;或 (ii)所述轻链中的L98I和所述重链中的R33K。
51.如权利要求49或50所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段还包含BT061的其余可变域序列。
52.如权利要求39 51中任一项所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段还包含能与⑶64结合的Fe受体。
53.如权利要求39 52中任一项所述的抗体，其中所述抗体是IgG抗体。
54.ー种分离肽，所述分离肽包含人⑶4蛋白中的少于50个的氨基酸并且包括人⑶4的两个或三个以下区域氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192。
55.ー种分离肽，所述分离肽包含人⑶4蛋白中的少于20个的氨基酸并且包括人⑶4的一个或多于ー个以下区域氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192。
56.ー种分离肽的模拟表位，所述分离肽包含少于50个的人CD4蛋白的氨基酸并且包括人⑶4的一个或多于ー个以下区域氨基酸148 154、氨基酸164 168和氨基酸185 192。
57.—种核酸,所述核酸编码权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段。
58.—种载体,所述载体包含权利要求57所述的核酸。
59.ー种宿主细胞或杂交瘤，所述宿主细胞或杂交瘤包含权利要求57所述的核酸或权利要求58所述的载体。
60.一种用于制备权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段的方法,所述方法包括以下步骤在允许所述抗体或抗体片段的表达的条件下在培养基中培养权利要求60所述的宿主细胞并且将所述抗体或抗体片段从所述培养基中分离。
61.ー种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段并且还包含药物可接受载剂。
62.如权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段还包含标记物。
63.一种活化CD4+CD25+调节T细胞的体外方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段接触。
64.—种治疗患有自体免疫疾病或移植排斥的受试者、或预防受试者患有自体免疫疾病或移植排斥的方法，所述方法包括对所述受试者施用权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段。
65.应用于医学的权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段。
66.如权利要求65所述的应用于医学的抗体或抗体片段，其中，所述应用是治疗自体免疫疾病或移植排斥。
67.权利要求65所述的抗体或抗体片段在制备用于治疗自体免疫疾病或移植排斥的药物中的应用。
68.权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段在⑶4+⑶25+调节T细胞的体外活化中的应用。
69.权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段在⑶4+⑶25+调节T细胞的体外鉴定中的应用。
70.权利要求54或权利要求55所述的分离肽或者权利要求56所述的模拟表位在筛选能与CD4结合和/或活化CD4+CD25+调节T细胞的分子中的应用。
71.—种筛选样品中是否存在CD4+CD25+T调节细胞的方法，所述方法包括使权利要求62所述的经标记的抗体或抗体片段与所述样品接触，洗涤所述样品以除去未结合的抗体和检测所述样品中是否存在所述标记。
72.如权利要求71所述的筛选方法，其中，所述CD4+CD25+T调节细胞被活化。
73.如权利要求71或权利要求72所述的筛选方法，其中，所述样品是取自患有自体免疫疾病或患有移植排斥的受试者的生物样品。
74.—种治疗患有自体免疫疾病或移植排斥的受试者、或预防受试者患有体免疫疾病或移植排斥的方法，所述方法包括从所述受试者中移取包含CD4+CD25+调节T细胞的样品，将所述样品与权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段接触以活化CD4+CD25+调节T细胞和将所活化的细胞施用于所述受试者。
75.ー种应用于医学的⑶4+⑶25+调节T细胞，所述⑶4+⑶25+调节T细胞由权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段活化。
76.如权利要求75所述的应用于医学的CD4+CD25+调节T细胞，其中，所述应用是治疗自体免疫疾病。
77.CD4+CD25+调节T细胞在制备用于治疗自体免疫疾病或移植排斥的药物中的应用，所述CD4+CD25+调节T细胞由权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段活化。
78.ー种用于分离CD4+CD25+调节T细胞的试剂盒，所述试剂盒包含涂布有权利要求39 53中任一项所述的抗体或抗体片段的磁性珠和第二抗CD4抗体或抗CD25抗体。
全文摘要
本发明提供了用于鉴定能与CD4结合并且能活化CD4+CD25+调节T细胞的分子的筛选方法。此外，本发明还提供了能活化CD4+CD25+调节T细胞的抗体和抗体片段，以及涉及所述抗体及其片段的方法和用途。
文档编号C07K16/28GK102687010SQ201080059459
公开日2012年9月19日 申请日期2010年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者A·英格利恩, H·沃梅尔, K·沃勒普, 克里斯托夫·尤尔克, 克里斯托夫·布鲁切尔, 尚塔尔·祖伯, 尼古拉斯·蔡洛特, 弗兰克·奥斯特罗斯, 本杰明·德尔肯, 格雷戈尔·舒尔茨 申请人:生物测试股份公司