使用siRNA组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法

专利名称：使用siRNA 组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法
使用siRNA组合进行疾病治疗和在RNAi中提高siRNA效力的方法 发明领域
本发明涉及关于RNAi和siRNA的治疗学和分子生物学领域。特别地，本发明提供 了一种用于治疗疾病或病症的方法和一种提高RNAi效力的方法。本发明还提供了用于 治疗疾病或病症以及用以提高siRNA效力的组合物。本发明一些实施方案提供了治疗疾 病例如黑素瘤和乙型肝炎的方法。
背景技术：
下面是关于RNA干扰(RNAi)和小干扰RNA(siRNA)，及其在疾病治疗中的应用的 简单描述。本描述只是为了更好地理解后面所述的发明。本描述并不能被认为是承认所 述任何工作都已是本发明的现有技术。
RNAi是一种在几乎所有真核生物中广泛保守的转录后基因沉默(PTGS)的现象， 其中双链RNA (dsRNA)诱导在细胞质中的同类mRNA进行序列依赖性降解，而这导致 相应基因的表达下调(参见Fire et al., 1998; Bosher et al.， 2000; Elbashir et al.， 2001; and Dykxhoometa1.，2003)。 RNAi现象最初于1990年在转基因植物中报道。随后几年中， RNAi在几乎所有真核生物中被观察到，包括秀丽隐杆线虫(Cae"oWw6&toe/eg"""、果 蝇、斑马鱼和小鼠。
在果蝇中已经确立了 RNAi机制的基本原理。当dsRNA被导入细胞中或由转基因 表达后，其首先被RNA III型酶家族的一个成员Dicer切割成为小干扰RNA(siRNA)， 所述siRNA长度大约为21—23核苷酸，在每条链3'末端含有两个核苷酸的突出(参见 Bernstein et al.， 2001)。然后siRNA被解旋酶分解为单链RNA分子并被引导进入RISC (RNA诱导的沉默复合物)以形成一个新的复合物。下一步，RISC中的单链RNA引导该 复合物寻找并降解其同类mRNA (参见Hammond etal., 2000)。由此相应基因的表达被下 调或抑制。在RNAi中，siRNA具有关键作用。
RNAi被认为在植物中具有清除入侵病毒的重要作用，并且在秀丽隐杆线虫和小鼠 的发育中调节基因表达。除了在各种真核生物中的生理学作用外，RNAi也已经被证明 是在体外和体内对特定基因进行基因敲除的有力工具，并且据信siRNA在治疗涉及某些 基因的异常表达的疾病中也是一种有力工具，其中所述基因可以是人类基因或者是病毒 基因。
RNAi调节下游靶基因的表达，但是干扰本身也被认为是处于调节之下的。例如， 在秀丽隐杆线虫中发现的ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)和一种高度保守的具有核
酸外切酶活性的蛋白质ERI-1(增强的RNAi，其在人类和小鼠中的同源物称为THEX-1， 在小鼠中也称为MERI-1)己经被提示涉及RNAi调节(参见Yang et al., 2005; Knight et al., 2002; Tonkin et al.， 2003;和Kennedy et al., 2004)。然而，RNAi调节的机制还没有被阐 明。因此，明白RNAi调节的机制对于开发RNAi的有效的治疗、诊断及研究应用将是 必需的。在本领域中需要明白并应用RNAi调节的机制。明白RNAi调节的机制在高效 应用siRNA的方法中也将是有用的。
发明概述
在一些实施方案中，本发明提供了用于治疗疾病或病症的方法，包括对于一个对 象施用一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调 一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。
在另一些实施方案中，本发明提供了提高siRNA效力的方法，包括对于一个生物 学系统施用一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达的siRNA以及一种或多种能够 下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。
在另一些实施方案中，本发明提供了组合物，所述组合物包括一种或多种能够下 调一个或多个靶基因表达的siRNA或其前体，以及一种或多种能够下调一个或多个 RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体。
'在另外--些实施方案中，本发明提供了在治疗疾病或病症的方法以及提高siRNA 效力的方法中确定能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调 一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA的最佳比例的方法,所述方法包括下述步骤
a) 使用任何siRNA分子诱导编码RNAi负调节物的基因的表达；
b) 确定能够诱导RNAi负调节物的高表达的siRNA分子的有效剂量；
c) 基于(b)中RNAi负调节物的高表达，确定将RNAi负调节物的表达下调至基 础表达水平的siRNA的剂量；以及
d) 基于(c)中的RNAi负调节物的下调，确定将一个或多个靶基因的表达下调至 最低水平的siRNA的剂量。
根据本发明一些实施方案中所提供的方法，耙向编码RNAi负调节物的Aex/基因 和/或任何其他与RNAi负调控相关的基因的siRNA可以与耙向耙基因的siRNA组合使 用，以显著提高所述靶向靶基因的siRNA的治疗效果或效力。本发明优选的实施方案所 提供的方法还可以在治疗应用中进一步降低靶向靶基因的siRNA的施用剂量，从而可以 降低治疗成本。本文提供的方法对于治疗癌症、病毒导致的疾病和任何涉及正常基因异 常表达的疾病都是有力的方法。
附图简述


图1示出了表达具有茎环节构的dsRNA的质粒载体pET-loop的图谱。
图2示出了 pET-loop-2C-MYC的图谱。 图3示出了 pET-loop-2HBVP的图谱。 图4示出了 pET-loop-2MERI-l的图谱。 图5示出了 pET-loop-2MADARl的图谱。
图6示出了使用CF-ll柱纯化的dsRNA。泳道1:含有pET-loop-2HBVP或 pET-loop-2MERI-l的大肠杆菌RNA提取物。泳道2:含有pET-loop的大肠杆菌RNA 提取物。泳道3:含有pET-loop-2HBVP或pET-loop-2MERI-l的大肠杆菌RNA提取物 用CF-ll纯化的样品。泳道4:含有pET-loop的大肠杆菌RNA提取物用CF-ll纯化的 样品。
图7示出了 esiRNA(大肠杆菌表达的及酶消化的siRNA)的制备及纯化。A:不同量 的His-RNaseIII对dsRNA水解的效果，在泳道1_7分别使用了 0、0.1吗、0.25ng、0.5吗、 lpg、 2吗或4|xg His-RNaseIII; B:在Superdex-75柱上纯化的21-23 bp esiRNA。 图8示出了 CHO-iHBS细胞中esiHBVP对HBsAg表达的抑制。 图9示出了用不同量的esiHBVP转染的小鼠的血清中HbsAg的相对水平。 图10示出注射了不同剂量esiRNA的小鼠肝脏中禾Q flifor-7基因表达的 RT-PCR分析。A组和B组琼脂糖凝胶上的//za-7和o^ "-/扩增产物的各自典型电泳 模式。C组和D组在三个独立实验中通过各自条带的强度分析确定的///^/和^/^^ 的mRNA水平的统计学分析。每条柱代表得自多于六只小鼠的测量的平均值。结果表 示为平均值士S.E.M.。 *户<0.05，显著不同于相应对照。
图11示出了在用esiHBVP组合esiMERI-l转染的小鼠血清中的相对HbsAg水平。 图12示出了在用不同量的esiC-MYC组合或未组合esiMERI-l或esiMADAR-l转 染后的小鼠中黑素瘤生长的数据图。
发明详述
本发明基于如下令人惊讶的发现在细胞培养物和动物模型中，相对大剂量的纯
化的siRNA比低剂量的siRNA具有持续时间较短的抑制作用。
通过假设细胞中高剂量siRNA通过例如上调RNAi负调节物，包括THEX1和 ADAR1，而诱导RNAi的下调，本发明人进一步令人惊讶地发现RNAi负调节物的表达 也是通过RNAi调节的，例如基因Ae;c/的表达水平被耙向^ex/的siRNA降低。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了一种用于治疗疾病或病症的方法，包括 对于一个对象施用一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达的siRNA以及一种或多 种能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。
在一些实施方案中，本发明还提供了提高siRNA效力的方法，包括对于一个生物 学系统施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够 下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。
如本文所用，术语"RNAi"是指RNA干扰，这是一种在几乎所有真核生物中广 泛保守的转录后基因沉默(PTGS)的现象，其中双链RNA (dsRNA)诱导在细胞质中的同 类mRNA进行序列依赖性降解，而这导致相应基因的表达下调(或抑制)(即"千扰")。
如本文所用，术语"siRNA"是指小干扰RNA，或长度不超过30nt并且能够在体 内和/或体外诱导RNAi的任何基于核酸的分子。优选地，siRNA包含互补于一种RNA 分子的21至27个碱基，其诱导RNAi以例如下调靶基因，即产生所述互补RNA的基 因的表达。更优选地，siRNA包含互补于一种RNA分子的21至23个碱基。
如本文所用，"与...互补"是指一种核酸能够与另一种核酸通过传统Watson-Crick 模式或其他非传统模式形成氢键。也就是说，这两种核酸通过在其间形成碱基配对而互 相结合。如本领域所熟知的，传统Watson-Crick碱基配对模式是指腺苷与胸腺嘧啶核苷 或尿嘧啶核苷通过在其碱基之间形成两个氢键而结合；而鸟苷与胞嘧啶核苷通过在其碱 基之间形成三个氢键而结合。非传统碱基配对模式包括在其他核苷对之间的结合，例如 腺苷一肌苷结合、胞嘧啶核苷一肌苷结合等等。
如本文所用，术语"靶基因"是指从其中转录得到与被施用的siRNA的任一条链 互补的RNA分子的基因，并且所述基因的表达水平被所述互补siRNA下调。
如本文所用，术语"下调"是指在一个对象中一个基因的表达，或编码一或多个 蛋白质亚基的RNA或等价RNA的水平，或一或多个蛋白质亚基的活性被降低至在缺乏 给所述对象施用的核酸分子时所观察到的情况。
如本文所用，术语"RNAi负调节物"是指一种生物学分子例如蛋白质或RNA分 子，其对于RNAi具有抑制作用。
在本发明的一些优选的实施方案中，所述RNAi负调节物选自由核酸外切酶和腺苷 脱氨酶组成的一组。
在本发明更优选的一些实施方案中，所述核酸外切酶是THEX1或其类似物。
如本文所用，术语"核酸外切酶"是指一种酶，其能够从核酸的游离末端顺序切 下核苷酸碱基。
如本文所用，当涉及蛋白质或多肽时，术语"类似物"是指两或多个蛋白质或多 肽分子的氨基酸序列部分或全部相同。
在本发明一些优选的实施方案中，所述腺苷脱氨酶是ADAR1或其类似物。
如本文所用，术语"提高siRNA效力"是指使用较少的siRNA分子获得相同水平 的siRNA抑制效果，或者使用相同量的siRNA分子获得更强的抑制siRNA效果。
如本文所用，术语"施用"是指根据需要将核酸送递至对象或任何生物学系统。 或者所述核酸分子(例如siRNA)可以从被送递至所述对象或生物学系统的DNA和/或 RNA载体中表达。
送递核酸分子的方法是本领域熟知的。例如，核酸分子可以通过各种方法施用， 所述方法例如但不限于包被于脂质体中、通过离子电渗疗法、或通过掺入其他载体中， 所述载体例如水凝胶、环式糊精、生物学可降解的纳米胶囊、以及生物粘性微球体。或
者所述核酸/载体组合可以通过直接注射或使用灌注泵而局部送递。其他方法包括使用各
种输送和携带系统，例如通过使用缀合物和生物学可降解的聚合物。
如本文所用，术语"对象"是指可以施用本发明的核酸分子的人或非人动物。优
选地，所述对象是人。但对象是人或非人动物时，所述对象在很多情况下需要治疗。
如本文所用，术语"生物学系统"是指包含基因表达体系的体内或体外系统，通 过所述基因表达体系，携带DNA片段的基因可以被表达。在一些优选的实施方案中， 所述生物学系统是动物、植物、细胞系、或人工基因表达体系。
在本发明一些优选实施方案中，能够下调靶基因表达的siRNA与能够下调RNAi 负调节物的表达的siRNA的比例处于大约5:1至大约20:l(w/w)的范围内。在本发明更 优选的实施方案中，能够下调靶基因表达的siRNA与能够下调RNAi负调节物的表达的 siRNA的比例为10:1 (w/w)。
在本发明一些优选实施方案中，所述siRNA是同时施用的。然而，外源性送递的 治疗性核酸分子例如siRNA可以在对象体内保持一段时间的稳定并保持其活性。这段时 间从几小时到几天不等，例如这样一段时间可以是3天。因此，在一些其他的实施方案 中，能够下调靶基因表达的siRNA在能够下调RNAi负调节物的表达的siRNA被施用 后的一段时间内被施用，在这段时间内所施用的能够下调RNAi负调节物的表达的 siRNA保持其活性。在一些优选的实施方案中，能够下调靶基因表达的siRNA在能够 下调RNAi负调节物的表达的siRNA被施用后3天内被施用。在另外一些优选的实施方 案中，能够下调RNAi负调节物的表达的si.RNA在能够下调靶基因表达的siRNA被施 用后的一段时间内被施用，在这段时间内所施用的能够下调靶基因表达的siRNA保持其 活性。在一些优选的实施方案中，能够下调RNAi负调节物的表达的siRNA在能够下调 靶基因表达的siRNA被施用后3天内被施用。
如本文所用，术语"保持其活性"是指被施用的核酸分子没有被完全降解，并且 保留其对于靶基因的最大抑制作用的至少10%，优选地，其保留其对于耙基因的最大抑 制作用的至少30%，最优选地，其保留其对于靶基因的最大抑制作用的至少50%。 在优选的实施方案中，所有或一部分所述siRNA是化学合成的。 在另一些优选的实施方案中，所有或一部分所述siRNA是在体内或体外利用核酸 序列合成的。
在一些优选的实施方案中，所述siRNA是通过化学修饰、生物学修饰、或其组合 而衍生得到的。
如本文所用，术语"化学合成的"是指所述siRNA分子利用单一核苷酸经过一系 列化学反应而合成。合成RNA分子的方法是本领域已知的(参见例如美国专利No. 7,056,704)。
如本文所用，术语"利用核酸序列合成的"是指下调靶RNA分子的分子是从插入
到DNA或RNA载体中的转录单位中表达得到的。所述重组载体优选地是DNA质粒或 病毒载体。对于体内合成，所述能够表达siRNA分子的重组载体通过前面所述的方法送 递，并在耙对象中持续存在。 一旦被表达，所述siRNA分子与靶RNA结合并下调其功 能或表达。本领域技术人员认识到任何核酸都可以在真核细胞内从合适的DNA/RNA载 体上表达。
如本文所用，术语"前体RNA"是指从其中可以通过例如酶切、保护基团添加等 等衍生出siRNA分子的RNA分子。
如本文所用，术语"化学修饰"是指任何通过化学反应对RNA分子进行的改变。 例如，可以添加5'和/或3'-帽结构以保护所述分子不在体内被降解。优选地，这些化学 修饰不降低siRNA分子的活性并且不具有对对象的毒性。
如本文所用，术语"生物学修饰"是指通过生物学活性对RNA分子进行的任何改 变。例如长前体RNA分子可以被RNA酶例如RNA酶III消化以产生siRNA分子。
在优选的实施方案中，所述通过本发明的方法治疗的疾病是癌症。
在更优选的实施方案中，所述癌症选自由胰腺癌、黑素瘤、结肠癌、肺癌、肾癌、 胃肠道基质肿瘤(GIST)、慢性骨髓单核细胞白血病(CMML)、急性髓细胞白血病(AML)、 慢性髓细胞白血病(CML)、乳腺癌、成胶质细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、 肾细胞癌、甲状腺癌、淋巴细胞癌、膀胱癌、前列腺癌、子宫颈癌、非霍奇金淋巴瘤、 口腔及n欧癌、头颈细胞癌、胃癌、食道癌、喉癌、脑及ONS癌、肝及IBD癌、卵巢癌、 以及鼻咽癌组成的一组。通常地，由失控的、渐进性细胞增殖而导致的并且不具有任何 生理学功能的组织异常生长都被认为是癌症。癌症可以通过本发明优选的实施方案治 疗。优选的实施方案对于减轻及消除癌症是有效的。
在一个特别优选的实施方案中，所述癌症是黑素瘤。
在一些优选的实施方案中，所述通过本发明的方法治疗的疾病是由病毒导致的疾病。
在一些优选的实施方案中，所述疾病选自由获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、甲型 肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、流感、口蹄疫、登革热/出血病、麻疹/亚急性 硬化性全脑炎(SSPE)、脑炎及脑部感染、腺发热順性淋巴细胞白血病/淋巴瘤/鼻咽癌、 成熟T细胞白血病(ATL)和HTLV-I-相关骨髓病/热带痉挛性轻截瘫(HAM/TSP)、神经疾 病、巨细胞病毒相关疾病/移植动脉疾病、性传播感染(STI)、 口及颈部癌症/头肩部癌症/ 鳞状细胞癌、发热水泡、生殖器疼痛、以及流感样疾病组成的一组。
在特别优选的实施方案中，所述疾病是乙型肝炎。
在一些优选的实施方案中，所述靶基因是与疾病相关的基因，其下调使所述疾病好转。
在本发明优选的实施方案中，所述靶基因是编码选自如下一组的产物的基因 VEGF (血管内皮细胞生长因子)、VEGFR (血管内皮细胞生长因子受体)、
c-Raf(MAPKKK)/bcl-2、 CEACAM6 (癌胚抗原相关细胞粘附分子6)、 EGFR(表皮生长因 子受体)、Bcr-abl、 AML1/MTG8 (由t(8;21)染色体转座产生的导致AML的嵌合转录因 子)、Btk(酪氨酸蛋白激酶)、LPA1(溶血磷脂酸)、Csk(C-末端Src激酶)、PKC(蛋白激 酶C)-theta、 Biml (细胞死亡的Bcl2-作用调节物)、P53突变体、stat3 (信号转导及转录 激活蛋白3)、 c-myc、 SIRTl[sirtuin (静默交配型信息调节2类似物)l]、 ERK1、环加氧 酶-2、鞘氨醇I-磷酸(SIP)受体-l、胰岛素样生长因子受体、Bax、CXCR4 [趋化因子(CXC 基序)受体4]、 FAK(黏着斑激酶)、EphA2(促红细胞生成素相关酪氨酸激酶受体2)、基 质金属蛋白酶、BRAF(V599E)(v-raf鼠肉瘤病毒癌蛋白类似物B1)、 Brk(乳腺癌激酶)、 EBV(EB病毒)、FASE(脂肪酸合酶)、C-erbB-2/HER2 (人表皮生长因子受体2)、 HPV(人 乳头瘤病毒)E6\E7、 Livin/ML-IAP (细胞凋亡的黑素瘤抑制物)/KIAP、 MDR (多种抗药 性)、CDK-2(细胞周期蛋白依赖性激酶2)、 MDM-2、 PKC (蛋白激酶C)-a、 TGF-|3 (转化 生长因子-p)、 H-Ras、 K-Ras、 PLK1 (Polo样激酶)、端粒酶、S100A10 (结肠直肠癌细胞 中的癌基因)、NPM-ALK(核磷蛋白-退行发育淋巴瘤激酶)、Noxl (NADPH氧化酶类似 物l)、细胞周期蛋白E、 Gp210 (孔膜糖蛋白)、c-Kit、存活蛋白、费城染色体、核糖核 苷酸还原酶、RhoC、 ATF2(转录活化因子2)、 P13激酶的P110a、 P110B、 Wtl (维尔姆 斯瘤)、Pax2(人乳腺癌中的癌基因)、Wnt4、 beta-catanin、整联蛋白、尿激酶类型血纤 维蛋白溶酶原激活物、Hecl (癌症中高表达)、亲环蛋白A、 DNMT (DNA转甲基酶)、 MUC1 (粘液素1 ，跨膜)、乙酰辅酶A碳酸酶{alpha} 、Mirk (Midbrain相关的激酶)/Dyrk 1 b、 MTA1 (转移相关基因1) 、 SMYD3(组蛋白转甲基酶)、ACTR (也称为AIB1和SRC-3， 一种核受体共激活物)、Hathl (结肠腺癌中的基因)、Mad2(卵巢癌中的基因)、STK15(也 称为BTAK和aurora2，中心体相关激酶)、XIAP (胰腺癌细胞的细胞凋亡和化学抗性的 x-连锁抑制物)、CD147/EMMPRIN (胞外基质金属蛋白酶诱导物)、ENPP2 [胞外核苷酸 焦磷酸酶/磷酸二酯酶 2 (autotaxin)]/ ATX /ATX-X/FLJ26803/LysoPLD/NPP2/PD-IALPHA/PDNP2、 AKT(蛋白激酶B)、 PrPC (细胞月 元蛋白、糖基磷脂酰肌醇锚定的膜蛋白)、硫氧还蛋白还原酶1、 HSPG2 (硫酸肝素蛋白 聚糖2/perlecan)、 p38 MAP (有丝分裂原活化的蛋白)激酶、hTERT(人端粒酶逆转录酶)、 alphaB-晶状体球蛋白(乳腺癌中新发现的癌蛋白)、STAT6(信号转导及转录激活蛋白6)、 胆碱激酶、细胞周期蛋白D1/CDK4、 ASH1、骨桥蛋白(在喉鳞片细胞癌中过表达)、3-垸基腺嘌呤-DNA糖基化酶、质膜小泡相关蛋白-1、 SHP2 (含有Src类似物2的酪氨酸 磷酸酶)、STAT5 (信号转导及转录激活蛋白5)、 Gab2 (GRB2相关结合蛋白2，在EGF 诱导的ERK活化途径中有关键作用)、Etk/BMX(非受体蛋白酪氨酸激酶)、AFP(alpha-胎蛋白)、Idl/W3基因(在乳头状和骨髓甲状腺癌症中上调)、母系胚胎亮氨酸拉链激酶/ 鼠蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶38、磷脂酰乙醇胺结合蛋白4、 ATP柠檬酸裂解酶、亲环蛋 白A、 DNA-PK(DNA依赖性蛋白激酶)、CT120A(肺癌的一个新基因)、EBNA1 (EB核 抗原1)、 Pim家族激酶、缺氧诱导型因子lalpha、乙酰辅酶A碳酸酶alpha、 Racl/RAC3、Aurora-B(以前称为AIM-1， 一个保守真核有丝分裂蛋白激酶，在各种癌细胞中过表达)、 血小板衍生生长因子-D/血小板衍生生长因子受体beta、雄性激素受体、EN2(人乳腺癌 中的一个候选基因)、Vavl(T细胞受体(TCR)信号转导中需要的一个信号转导蛋白，发 动胸腺中的正负选择)、BRCA1 (乳腺癌易感基因)、非受体蛋白-酪氨酸激酶Pyk2(富含 脯氨酸的酪氨酸激酶2)、痩素、hLRH-l (人核受体1)、 p28GANK (肝细胞癌中的癌基 因)、MCT-1 (与细胞周期蛋白H的蛋白一蛋白结合结构域类似的一个新的癌蛋白候选 物)、成纤维细胞生长因子受体3、 p53R2[核糖核苷酸还原酶(RR)]、整联蛋白连接的激 酶、cdc42、 MAT2A(肝细胞瘤细胞中的癌基因)、胞间粘合分子(ICAMs)、 mimitin(食道 鳞片细胞癌的细胞增殖)、RET(原癌基因)、S期激酶相互作用蛋白2、 NRAS(成神经细 胞瘤RAS病毒(v-ras)癌基因类似物)、磷脂酰肌醇3-激酶、Fas配体、IGFBP-5 (胰岛素 样生长因子结合蛋白5) 、 E2F4(E2F转录因子4)、 FLT3 (fms相关酪氨酸激酶3)、雌激 素受体、LYN激酶(慢性髓细胞白血病细胞中过表达)、组织蛋白酶B、 ZNRD1、 ARA55 (雄性激素受体共调节物)、以及激活蛋白。
在本发明一个特别优选的实施方案中，所述靶基因是c-;nj;c基因。
在一些优选的实施方案中，所述靶基因是病毒基因。
在更优选的实施方案中，所述靶基因是选自如下一组的病毒的基因人免疫缺陷 病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、流感病毒、口蹄 疫病毒、登革热病毒2型、麻疹病毒、全脑炎病毒、EB病毒、人T细胞白血病病毒、 巨细胞病毒、人乳头瘤病毒、以及单纯疱疹病毒。
在特别优选的实施方案中，所述靶基因是编码乙型肝炎病毒聚合酶的基因。
如本文所用，术语"与疾病相关的基因"是指一个基因，其异常表达引起疾病或 有助于疾病的发展。或者，在某些情况下其常表达也可能引起疾病或有助于疾病发展的 基因也是与疾病相关的基因。
如本文所用，术语"病毒基因"是指由病毒编码的基因，其异常表达杀死该病毒 或抑制该病毒的复制。
在本发明特别优选的实施方案中，所述耙基因是c-m少c基因，并且所述RNAi负调 节物是THEX1、 ADAR1、或其组合。
在本发明另一个特别优选的实施方案中，所述靶基因是编码乙型肝炎病毒聚合酶 的基因，并且所述RNAi负调节物是THEXl。
在本发明一些实施方案中，提供了一种组合物，其包括一种或多种能够下调一个 或多个靶基因表达的siRNA或其前体，以及一种或多种能够下调一个或多个RNAi负调 节物的表达的siRNA或其前体。
如本文所用，术语"组合物"是指一种混和物，其包括处于药物学可接受的载体 或稀释剂中的药物学有效剂量的希望的siRNA。所述组合物应当处于适于施用进入细胞 或对象，优选人的形式，例如适于全身施用的形式。合适的形式部分依赖于使用的进入 途径，例如经口 、透皮、或注射。这些形式不应阻碍所述组合物到达靶细胞(即所述siRNA 希望被送达的细胞)。例如，注射进血液的组合物应当是可溶性的。用于治疗用途的可 接受的载体是药物学领域所熟知的。其他因素也是本领域已知的，包括考虑例如毒性和 阻碍所述组合物发挥其效应的形式。
药物学有效剂量是指能够预防、抑制疾病状态的发生或治疗所述疾病状态(一定程 度上缓解症状，优选完全缓解症状)的剂量。所述药物学有效剂量依赖于疾病类型、所 使用的组合物、给予途径、治疗对象的类型、特定对象的物理状态、同时服用的药物、 以及其他本领域技术人员所了解的因素。
所述siRNA可以以包含常规非毒性药物学可接受载体和佐剂的剂量单位配制品的 方式口服给予、局部给予、非胃肠道给予、吸入给予或喷剂或直肠给予。术语"非胃肠 道"包括经皮、皮下、血管内(例如经脉内)、肌内、或鞘内注射或灌注技术等等。
siRNA可以在发挥功能之前在体内或体外由核苷酸序列表达。因此，在另一个实 施方案中，提供了一种组合物，其包括编码一种或多种能够下调一个或多个耙基因表达 的siRNA或其前体的一个或多个核苷酸序列，以及一种或多种能够下调一个或多个 RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体。
在本发明另一个实施方案中，提供了一种组合物，其包括一种或多种能够下调一 个或多个靶基因表达的siRNA或其前体，以及编码一种或多种能够下调一个或多个 RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体的一个或多个核苷酸序列。
在本发明另一个实施方案中，提供了一种组合物，其包括编码一种或多种能够下 调一个或多个靶基因表达的siRNA或其前体的一个或多个核苷酸序列，以及编码一种或 多种能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体的一个或多个核苷酸 序列。
在本发明优选的实施方案中，所述组合物中的能够下调靶基因表达的siRNA与能 够下调RNAi负调节物的表达的siRNA的比例处于大约5:1至大约20:l(w/w)的范围内。 在本发明更优选的实施方案中，所述组合物中的能够下调靶基因表达的siRNA与能够下 调RNAi负调节物的表达的siRNA的比例为10:1 (w/w)。
在本发明一些实施方案中，提供了在治疗疾病或病症的方法以及提高siRNA效力 的方法中确定能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调一个 或多个RNAi负调节物的表达的siRNA的最佳比例的方法，所述方法包括下述步骤
a) 使用任何siRNA分子诱导编码RNAi负调节物的基因的表达；
b) 确定能够诱导RNAi负调节物的高表达的siRNA分子的有效剂量；
c) 基于(b)中RNAi负调节物的高表达，确定将RNAi负调节物的表达下调至基 础表达水平的siRNA的剂量；以及
d) 基于(c)中的RNAi负调节物的下调，确定将一个或多个耙基因的表达下调至 最低水平的siRNA的剂量。
如本文所用，术语"高表达"是指所述RNAi负调节物表达水平为siRNA的抑制 率低于30%，优选低于20%，最优选低于10%。
如本文所用，术语"基础表达水平"是指所述RNAi负调节物表达水平为细胞中没 有siRNA分子时的水平。
在一些优选的实施方案中，能够诱导RNAi负调节物的高表达的siRNA分子的有 效剂量是指在此剂量所述被施用的siRNA分子导致RNAi负调节物的表达水平升高至少 2倍。将RNAi负调节物的表达下调至基础表达水平的siRNA的剂量通过施用不同剂量 的siRNA确定。可以使用RT-PCR确定RNAi负调节物的表达水平。基于将RNAi负调 节物的表达下调至基础表达水平的siRNA的剂量可以确定将一个或多个靶基因的表达 下调至最低水平的siRNA的剂量。靶基因表达的最低水平是指更多的siRNA也不能显 著地导致所述耙基因的mRNA水平的进一步降低。
本发明的其他特点和优点通过下述实施例和权利要求的描述将会是很明显的。下 述实施例仅是为了说明而不是为了限制本发明。
实施例
除非特别说明，实施例中所用到的全部化学试剂均购自日本TakaRa公司。
方法学 siRNA的制备
在RNAi中使用的大量dsRNA和siRNA分子通过使用包括如下步骤的方法获得
(I) 构建表达具有茎环结构的dsRNA的质粒载体；
(II) 大肠杆菌转化；
(III) 大肠杆菌发酵；
(IV) 通过碱-SDS抽提提取总RNA和质粒DNA;
(V) 通过CF-11柱纯化dsRNA;
(VI) 通过大肠杆菌RNA酶III或动物或植物dicer酶将dsRNA分子加工成为具有 20-30bp长度的siRNA分子。
銜建表达淑斜楚舗&腦颜粒载沐
所述质粒载体的图谱示于图1。特别地，所述质粒载体pET-loop通过将得自酵母 或其他任何不是大肠杆菌的生物的大约300bp的DNA片段插入到pET-22b载体 (Novagen)的万aw/f/和五co/ /位点之间而构建。
为了获得从其中可以表达靶向小鼠c-w)，c基因的siRNA的前体dsRNA的质粒载体， 通过PCR从小鼠cDNA(Invitrogen， USA)中扩增出含有小鼠基因的编码区的DNA 片段，使用下列引物c-myc-sense: 5，陽GCGGGTACCCTGTTTGAAGGCTGGATTT-3，
(SEQ ID NO:l,弓l入的位点用下戈iJ线表示)禾卩c-myc-antisense: 5'-ATGCGAATTCTACAGGCTGGAGGTGGAGCA -3， (SEQ ID N0:2，引入的《/7"/位点用 下划线表示)。PCR程序为94 °C进行1 min， 52 °C进行0.5 min以及72 °C进行1 min， 共进行30个循环。获得的DNA片段首先利用引入的限制酶识别位点克隆进pBluescript II KS (Stratagene)并通过测序确定，然后再亚克隆进pET-loop的Ecoi /和《p"/位点之间， 以得到质粒pET-loop-2C-MYC (图2)。
为了获得从其中可以表达靶向编码乙型肝炎病毒聚合酶的基因的siRNA的前体 dsRNA的质粒载体，通过PCR从乙型肝炎病毒基因组中扩增出含有该基因编码区的 DNA片段，使用下列引物HBVP-sense: 5 ， -GG AATTCGTCTTGGGTATAC ATTTGACC-3 ， (SEQ ID NO:3，弓l入的￡co/ /位点用下划线表示)禾卩HBVP-antisense: 5，-GGGGTACCAGAGGACAACAGAGTTG-3, (SEQ ID NO:4，引入的X/w/位点用下划 线表示)。PCR程序同上。获得的DNA片段如上所述插入进pET-loop，以得到质粒 pET-loop-2HBVP (图3)。
为了获得从其中可以表达靶向小鼠基因的siRNA (esiMERI-l)的前体dsRNA 的质粒载体，通过PCR从小鼠cDNA中扩增出含有小鼠w/-/ (MERI-1) 7个外显子 (GenBank⑧编号NM—026067)中的外显子2和外显子3的DNA片段，使用下列引物 eri-l-sense 5，-CGGAATTCGCAGACTTGAT-3， (SEQ ID NO:5，引入的fcoi /位点用下划 线表示)和eri-l-antisense 5，-CCGGTACCTGGCCTCACATA-3， (SEQ ID NO:6，引入的 化"/位点用下划线表示)。PCR程序同上。获得的DNA片段首先利用引入的限制酶识 别位点克隆进pUCl 18 (Stratagene)并通过测序确定，然后再亚克隆进pET-loop的 和尺;w/位点之间，以得到质粒pET-loop-2MERI-l (图4)。
为了获得从其中可以表达靶向小鼠"c/"/"-/基因的siRNA (esiMADAR-l)的前体 dsRNA的质粒载体，通过PCR从小鼠cDNA中扩增出含有小鼠a^w-/ (MADAR-1) 15 个外显子(GenBank⑧编号AY488122)中的外显子5和外显子6的DNA片段，使用下列 引物adar-l-sense 5'- GCGAATTCGTTCCAGTACTGTGTAGCAGT-3' (SEO ID NO:7.引 入的 位点用下划线表示)和adr-l-antisense 5'-
ATGCfiQIA￡￡GGATCCTTGGGTTCGTGAGGAGGTCC-3' (SEQ ID NO:8，弓1入的争/ 位点用下划线表示)。PCR程序同上。获得的DNA片段首先利用引入的限制酶识别位点 克隆进pBluescript II KS (Stratagene)并通过测序确定，然后再亚克隆进pET-loop的￡coi / 和《p"/位点之间，以得到质粒pET-loop-2MADAR-l (图5)。
为了获得从其中可以表达靶向禽流感病毒NP基因的siRNA (esiNP)的前体dsRNA 的质粒载体，通过PCR从cDNA中扩增出编码禽流感病毒NP(核蛋白)的一部分的DNA 片段，使用下列引物叩-sense 5'-GCGAATTCTCTGCACTCATCCTGAGAGG-3' (SEQ ID NO:9， 引入的 ￡coi / 位点用下划线表示)和 叩-antisense 5'-CGGGTACCTACTCCTCTGCATTGTCTCC-3' (SEQ ID NO:10,引入的AT/ "/位点用下
划线表示)。PCR程序同上。获得的DNA片段首先利用引入的限制酶识别位点克隆进 pBluescript II KS (Stratagene)并通过测序确定，然后再亚克隆进pET-loop的五coR/和 位点之间，以得到质粒pET-lo叩-2NP。
大肠杆菌转化
如上获得的dsRNA表达载体如Qian et al., 2005所述转化进大肠杆菌菌株BL21(DE3) (Stratagene)。
大肠杆菌发酵
转化之后将含有所述dsRNA表达载体的BL21(DE3)菌株接种在补充了 100 pg/ml 氨苄青霉素的200ml LB (Luria-Bertani)培养基中，并在37 °C， 250 rev./min摇床过夜培 养。接下来将培养物接种进含有25L新鲜培养基的小发酵罐中持续生长8—9小时，然 后接种进含有300L新鲜培养基的大发酵罐(容积500L)中。将大肠杆菌进一步在大发酵 罐中在37。C发酵3小时，然后将6kg乳糖加入到培养基中诱导dsRNA的表达。然后 将大肠杆菌进一步发酵3小时，通过3800g离心(J-6B centrifiige， Beckman)15分钟收获 细胞。
遞过滅匿SXW激箱箱M iW力浙廣粒Z)M4
将100g大肠杆菌细胞重悬于1000ml悬浮缓冲液(50mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl和 10 mM EDTA pH8.0)。加入2L裂解缓冲液(0.2 M NaOH和2% SDS)，然后轻轻搅拌后 加入1500ml醋酸钾溶液。再次轻轻搅拌，然后将总溶液分入几个烧瓶中，冰冷10分钟。 在10000 g (SCR20BC centrifuge, HITACHI)离心10分钟，收集上清并与等体积的酚:氯仿 异戊醇(25:24:1)混和。将所述混和物充分混和后在10000 g (SCR20BC centrifuge, HITACHI)再次离心10分钟，收集上清备用。
遞过CF-7/控錄众
dsRNA的纯化和esiRNA(大肠杆菌表达的以及酶消化的siRNA)的制备根据 Mulkeen et al.， 2004描述的方法进行。简单而言，将上述获得的含有RNA的细胞裂解物 在乙醇中稀释至终浓度为20%，然后将所得溶液通过用含有lx STE (10 mM Tris/HCl， 100 mM NaCl和1 mM EDTA, pH 8.0)的20%乙醇平衡的Whatman⑧纤维素CF-11柱 (Whatman, USA)。该柱在4 。C储存，所述柱纯化在所述样品在冰上放置10分钟后在4 。C 进行。在用5L含有17%乙醇的lx STE洗涤后，将dsRNA用2L预热至55°C的lx STE 从柱上洗脱。图6示出了未纯化的和纯化的样品(分别在泳道1和3)的琼脂糖凝胶电泳 结果。相对于普通质粒(泳道2和4)，纯化的样品(泳道3)是长dsRNA。獰Ai A^分f》/7工成力w7WJ分7
为了制备siRNA，每4吗纯化的长dsRNA用0.1吗重组RNA酶III (Ambion)在包 含50 mM Tris/HCl (pH 7.5)， 50 mM NaCl, 10 mM MnCl2和1 mM DTT的反应混和物中在 37。C消化l小时。消化混和物在15%非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，结果示于图7A。 被消化的产物进一步在Superdex-75柱(Pharmacia/Amersham, USA)上纯化以获得纯的 21-23bpesiRNA，如图7B所示。
报道质粒t)CMV-iHBS的构建
报道质粒pCMV-iHBS如Xu et al.， 2005所述构建，其含有位于小鼠IgK链前导序列 下游的HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原)编码序列，所述小鼠IgK链前导序列使得被表达 的蛋白质被分泌至胞外。在细胞培养物测试和动物测试中都使用所述分泌型质粒。
细胞培养和转染
CHO(中华仓鼠卵巢)细胞(ATCC)在37。C、 5% C02环境中生长于补充了 10%胎牛 血清(Biological Industries, Kibutz Beit Haemek， Israel)、链霉素(100 ng/ml)和青霉素 (100 units/ml)的Dulbecco's修改的Eagle's培养基中。为了建立组成型表达HBsAg的细 胞系，根据厂商指导将600 ng/ml pCMV-iHBS质粒DNA在24孔板(70%铺满)上使用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染进CHO细胞。转染后72小时测量培养基中HBsAg 的水平，并将G418加入到细胞中至终浓度800 pg/ml。接下来将G418抗性的细胞系列 稀释以建立组成型表达克隆的HBsAg的细胞株，命名为CHO-iHBS细胞株。
将siRNA施用给小鼠
将含有siRNA的溶液(在总体积1000ml的水溶液中的esiRNA 5 -30吗,NaCl 8.6g， KC1 0.3 g,以及CaCl2 0.13g)通过腹膜内注射或尾静脉液压法施用给雄性ICR小鼠(6—8 周龄，18—20g;上海实验动物中心)，剂量为l-30pg/kg体重。对照小鼠用相同但不含 siRNA的溶液注射。注射步骤符合上海实验动物中心的要求，被证明对于动物是安全的。
RT(逆转录)-PCR分析
使用QiagenRNA分离试剂盒(Qiagen, Germany)从新鲜收获的注射了 pCMV-iHBS 质粒DNA和siRNA的小鼠肝脏分离总RNA。从总RNA中使用无RNA酶的MMLV逆 转录酶(Takara,日本)进行RT。为了消除扩增过程中不同管之间的扩增效率不同的影响， 用|3-肌动蛋白mRNA作为内部标准以对RT—PCR进行半定量分析。(3-肌动蛋白的引物 是5'-TGATGGACTCCGGTGACGG-3' (SEQ IDNO:l 1,正向)禾口
5'-TGTCACGCACGATTTCCCGC-3'(SEQIDNO:12，反向)。用p-肌动蛋白扩增子(179bp) 标准化之后，相同量的cDNA被用作模板以扩增^^-/和^^/"-/基因，使用下列引物//^乂-/-有义引物5'-CGGAATTCGCAGACTTGAT-3' (SEQ ID NO:13)和Aex-7-反义引物 5'-CCGGTACCTGGCCTCACATA-3' (SEQ ID NO:14); 0^/"-/-有义引物 5'-GCTCTAGAGTTCCAGTACTGTGTAGCAGT-3' (SEQ ID NO:15)和。^卜/-反义引物 5'-ATGCGAATTCGGATCCTTGGGTTCGTGAGGAGGTCC-3' (SEQ ID NO: 16). PCR程
序设置如下94 °C变性1分钟，52 °C退火0.5分钟以及72 °C延伸1分钟。对于Aex-/ 和fldw-7基因扩增30个循环，对于(3-肌动蛋白扩增25个循环。然后对每一种RT—PCR 进行15， 20， 25， 30, 35， 37和40个循环以确认在所描述的条件下针对每个片段的所述 PCR扩增仍旧处于线性范围之内。用溴乙啶染色的2%琼脂糖凝胶分析样品，条带的密 度通过Molecular Imager FX Pro Fluorescent Imager (Bio-Rad)定量。
实施例1.髙剂量的siRNA在CHO-iHBS细胞中在一段时间抑制之后诱导HBsAg表达 的更强的反弹
对于siRNA剂量一应答实验，得自六孔板的CHO-iHBS细胞(70%铺满，大约5xl06 细胞)用4~10吗esiHBVP通过Gene Pulser XcellTM系统(Bio-Rad)根据厂商指导进行转
染。将细胞立即接种在新的具有新鲜培养基的六孔板上。每24小时移走培养基用于分 析，对细胞补充新鲜培养基。使用ELISA分析培养基中的分泌性HBsAg。
本领域抑制基因表达的下调是序列特异性的以及剂量依赖性的，并且RNAi效应是 短期的，通常持续3 — 4天(Xuaneta1.，2005)。已经提示同源基因的表达在siRNA抑制 之后3—4天反弹，并且所述反弹效应在施用了较高剂量的siRNA的细胞或动物中比在 施用了较低剂量的siRNA的细胞或动物中更加强烈。
为了研究HBVP的siRNA的抑制效应，将CHO-iHBS细胞用溶解于PBS中的4吗 或10esiHBVP转染。大约使用5xl()S细胞/孔进行转染，相同体积的不含有任何DNA 的PBS用作阴性对照。测定转染后不同时间点时培养基中分泌的HBsAg浓度，并相对 于阴性对照将分泌性HBsAg的表达标准化。结果显示在用4吗esiHBVP转染的细胞中， HBsAg表达的抑制在24—72小时之间持续增加，直至转染后96小时观察到轻微反弹， 而在用10吗esiHBVP转染的细胞中，HBsAg表达的抑制在早期阶段更强，但是在转染 后72小时开始反弹(图8)。看上去似乎RNAi的抑制效应在晚一点的时间会开始丧失， 并且细胞中基因的整体表达水平开始上升。令人感兴趣的是给予了更高剂量的siRNA 的细胞在转染后96小时显示强的多的反弹。为了解释这一现象，可能是在细胞中当大 量siRNA被导入时触发了某一类反抗机制，以保护细胞对抗RNA病毒感染。
实施例2.高剂量的siRNA在小鼠中在一段时间抑制之后诱导HBsAg表达的更强的反 弹
所述更高剂量的siRNA诱导的更强的HBsAg表达的反弹在动物中也可以观察到。
靶向编码乙型肝炎病毒聚合酶的基因的大肠杆菌表达的siRNA (esiHBVP) (lng或 IO吗)以及IO吗pCMV-iHBS通过尾静脉液压法注射到小鼠体内。只将10吗pCMV-iHBS 注射到对照小鼠体内。在注射后24小时的不同时间点用ELISA测量血清中乙型肝炎病毒 表面抗原(HbsAg)。
如图9所示，在对照组中，血清中HbsAg浓度在注射后24小时达到最高水平，并在7 天内保持稳定。注射esiHBVP在注射后的第一天就开始抑制HbsAg表达，并且所述抑制 显示剂量依赖性模式(lHg和l(Vg esiHBVP分别抑制60。/。和70Q/())。在第4天，l吗esiHBVP 的抑制率达到88%，然而，10吗esiHBVP的抑制率下降至42Q/。。在第7天，l吗esiHBVP 的抑制率仍维持在70%，然而10吗esiHBVP的抑制率已经下降至30。/。。
实施例3.小鼠中mW基因(幼ex:-A的表达水平的RT-PCR分析
在细胞系和动物中的更高剂量siRNA诱导的HbsAg表达的更强反弹被解释为高剂 量的esiHBVP (IO吗)分子可能上调RNAi负调节物例如THEX1和ADAR1的表达。接 下来研究了是否肝脏中Aex7或^for-7的表达水平当siRNA被导入体内时会有变化。将 各种量的esiHBVP或非相关对照esiNP通过尾静脉液压注射方法注射进小鼠体内。在施 用后4天，从肝脏中抽提总RNA，并利用Aex-7和fl^^-7基因特异性引物进行RT-PCR。 所有反应用(3-肌动蛋白标准化。如图10所示，Aex-/和a必r/基因的mRNA水平由于 导入外源siRNA而显著升高。注射10吗esiHBVP的组显示比未注射的组Aex-/基因的 mRNA水平升高了几乎3倍，a^^/基因的mRNA水平升高了超过4倍。所述升高在 注射l吗esiHBVP加上9pg非特异性esiNP的组中也可以观察至lj。然而，当1吗es正RI-l 与10吗esiHBVP —起注射进小鼠体内后，/tex-/和adw-/基因的mRNA水平都降低。 特别地，A"-/ mRNA显示接近于仅注射了 1昭esiHBVP的小鼠中的水平。因此似乎施 用高剂量的外源siRNA,无论是10將esiHBVP或1 (xg esiHBVP加上9吗esiNP，都会 诱导r/ ex-/和aifor-/基因的表达，并且加入1蹄esiMERI-l在一定程度上抵消了 /tec-/ mRNA的增加。
实施例4. 类似物基因的静默可能使在小鼠肝脏中的RNAi更加有效
在一个与实施例3相似的实施方案中，l吗靶向小鼠Aex/基因的siRNA (esiMERI-l) 与l吗和IO路esiHBVP共给予，图11显示在注射后第4天和第7天，10吗esiHBVP 的抑制仍维持在高水平，并且esiHBVP的抑制显示剂量依赖性模式。同时，lpg esiHBVP 的抑制也提高了。所有这些结果证明基因的下调导致RNAi的显著提高。
实施例5.在小鼠中通过靶向c-zi^c基因的siRNA和耙向幼ex:J基因和<wter-7基因的 siRNA抑制黑素瘤B16细胞生长靶向小鼠c-m_yc基因的siRNA (esiC-MYC)被如前所述腹膜内注射到携带黑素瘤的 小鼠体内。SiRNA的剂量示于图12。在20天内每天进行一次注射并且记录肿瘤体积， 如图12所示。相对于对照组，注射5昭esiC-MYC和10吗esiC-MYC siRNA以剂量依 赖性模式抑制小鼠黑素瘤生长(分别抑制80°/。和88%)。然而，注射20ngesiC-MYC和30 吗esiC-MYC siRNA抑制黑素瘤生长的效力较低(分别抑制80%和60%)。猜想高剂量的 siRNA分子可能上调Aex/基因和fl必r-7基因的表达，并且部分siRNA分子可能被 THEX1降解。
当10ng靶向小鼠Aex/基因的siRNA (esiMERI-l)和IO吗耙向小鼠fl^r-/基因的 siRNA(esiMADAR-l)与30吗esiC-MYC共给予时，肿瘤生长被更显著地抑制，如图12 所示。
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序列表
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3权利要求
1.一种提高siRNA效力的方法，包括对于一个生物学系统施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。
2. —种组合物，其包括一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA或 其前体或编码其或其前体的一个或多个核苷酸序列，以及一种或多种能够下 调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体或编码其或其前体的 一个或多个核苷酸序列。
3. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中能够下调靶基因表达的siRNA 与能够下调RNAi负调节物的表达的siRNA的比例为10:1 (w/w)。
4. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是与疾病相关的 基因，其下调使所述疾病好转。
5. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是eye基因。
6. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述耙基因是病毒基因。
7. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是编码乙型肝炎 病毒聚合酶的基因。
8. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述RNAi负调节物选自由 核酸外切酶和腺苷脱氨酶组成的一组。
9. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述RNAi负调节物是 THEXK ADAR1、或其类似物。
10. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述耙基因是c-w^基因， 并且所述RNAi负调节物是THEXl、 ADAR1、或其组合。
11. 权利要求1的方法或权利要求2的组合物，其中所述靶基因是编码乙型肝炎 病毒聚合酶的基因，并且所述RNAi负调节物是THEXl。
12.权利要求2-11任一项的组合物在制备用于治疗与基因表达相关的疾病的药物 中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于治疗疾病或病症的方法和一种提高RNAi效力的方法。本发明还提供了用于治疗疾病或病症以及用以提高siRNA效力的组合物。本发明一些实施方案提供了治疗疾病例如黑素瘤和乙型肝炎的方法，包括对于一个对象施用一种或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA以及一种或多种能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA。本发明还提供了包括一或多种能够下调一个或多个靶基因表达的siRNA或其前体以及能够下调一个或多个RNAi负调节物的表达的siRNA或其前体的组合物。
文档编号A61P35/00GK101099869SQ20061010623
公开日2008年1月9日 申请日期2006年7月6日 优先权日2006年7月6日
发明者浩 洪, 钱志康, 黄伟达 申请人:上海恒达科技发展股份有限公司