细胞介导的细胞毒作用证明细胞膜表面表达cd63的制作方法

专利名称：：细胞介导的细胞毒作用证明细胞膜表面表达cd63的制作方法
技术领域：
：本发明涉及肺瘤性疾病的诊断和治疗，特别是肿瘤细胞毒作用的介导，最主要是涉及肿瘤性疾病可修饰性抗体(cancerousdiseasemodifyingantibodies,CDMAB)的应用，可选择地，结合一种或多种化疗药物，作为诱发肿瘤细胞毒性反应的手段。本发明还涉及了利用当前已有的CDMAB进4亍的结合试验。
背景技术：
：CD63属于四次跨膜超家族中的三型膜蛋白，该家族目前共20个成员，特点是均具有四个跨膜结构。几个工作组通过将抗体分别加入预先活化的血小板、中性粒细胞和黑色素瘤细胞样品内的方法，各自独立地确定了细胞膜上CD63的表达。对这组同源糖蛋白抗原的cDNA进行克隆后证明这些不同细胞上的抗原为同一种分子。1996年，第六次国际白纟田胞分型研讨会(TheSixthInternationalWorkshoponLeukocyteTyping)将该抗体归类为CD63抗体。在此之前，CD63曾被称为黑色素瘤l抗原、眼黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、guanulophysin、黑色素相关抗原MLA1,这些命名往往和导致发现其部分特性以及抗原识别的抗体有关。因此，CD63也曾经被指定为ME491抗原(MAbME491)、神经腺(neuroglandular)抗原(MAbsLS59,LS62,LS76,LS113,LS140,LS152)、血小板gp40(MAbsH5C6，H4F8和H5D2)、人类骨髓基质细胞抗原(MAbl2F12)、骨原细胞特异性标志物(MAbHOP-26)和整合素相关蛋白(MAb6Hl)。目前发现其他能够与人体CD63产生交叉反应的抗体有8-1H,8-2A(与ME491产生交叉反应)、NKI/C-3和NKI/black-13(VannegoorandRumke，1986;Demetricketal.,1992;Wangetal.,1992)。研究人员用人体黑色素瘤细胞众多抗体的一种，即MAbME491，乂t人黑色素瘤细胞的互补DNA文库中最先克隆出了CD63。人体黑色素瘤活检研究表明MAbME491的活性似与黑色素瘤的进展呈负相关。在正常黑色素细胞中，MAbME491活性低，在黑色素瘤早期进展阶賴:(包括发育不良痣和》文射生长期(radialgrowthphase,RGP)肿瘤)抗体活性升高，黑色素瘤继续进展，例如垂直生长期(vertialgrowthphase,VGP)和转移性肿瘤，MAbME491活性则下降甚至丧失活性。研究人员应用MAb2.28(抗活化血小板抗体)，发现了人体血小板表面特征性CD63的表达，并进行了部分定性，检测到了该抗体依赖于血小板膜糖蛋白(53kDa)的活性作用。此血小板膜糖蛋白也与未活化血小板内部颗粒膜成分有关。同一研究中，MAb2.28也用于标记巨核细胞和内皮细胞的内部颗粒，在颗粒上同时集聚有组织蛋白酶D抗体，后者为公认的溶酶体抗体。接下来关于抗体簇聚集和克隆表达的研究，证明CD63与溶酶体膜相关蛋白LAMP1和LAMP2共同表达于溶酶体膜上。分子克隆鉴定该分子确为CD63，属于四次跨膜超家族。许多不同组织和细胞上都能够检测到CD63表达。在细胞水平，人们发现其与细胞膜有关，也和细胞内后期形成包涵体的嚢状结构有关。某些情况下，细胞活化导致细胞内储备的CD63向细胞膜表面移动。在生理上，CD63与B淋巴细胞的MHC-II类分子有关，主要是通过在内体、外体以及排泌小泡的表达参与MHC-II复合物转运到细胞表面的过程。人们还发现CD63与其他四次跨膜超家族分子之间存在相互作用，例如CD9、CD81、CD11(integrinchainlaM,L,x)、CD18(integrinchain|32)、CD49c(VLA-3或integrinchaina3)、CD49d(integrinchain04)、CD49f(VLA-6或integrinchain)和CD29(integrinchain&),B、T淋巴细胞，中性粒细胞，乳腺癌和黑色素瘤细胞等很多类型细胞中均可见到这种相互作用。CD63在肿瘤性疾病中的作用还不是很清楚。尽管最初由几个相互独立的工作组发现CD63参与血小板和中性粒细胞活化、MHC-II类抗原提呈、整合素依赖性细胞粘附和运动以及某些肿瘤的恶性进展，但其功能还有待进一步充分阐述。虽然目前有证据支持CD63在各种细胞生理事件中的作用，可是还不清楚的是在CD63参与的各种事件过程中，它所起的作用是互相独立的还是具有潜在的共同细胞学机制？几个工作组已经研究了CD63和某些类型肺瘤进展之间的关系，特别是与黑色素瘤进展之间的关系。除MabME491之外，还研发了多种抗CD63单克隆抗体(以下筒称单抗)应用于对不同进展阶段肿瘤患者的肿瘤标本进4亍免疫组4匕(immunohistochemical，IHC)染色。研究人员观察到着色浅通常提示CD63低表达，并与肿瘤进展和转移性有关。更近期一项研究也描述了包括CD63在内的几个四次跨膜超家族成员(mRNA定量)表达水平明显下调与几种乳腺癌衍生的细胞体外侵袭性的显著相关关系。另外一项研究通过差异显示法证实培养的乳腺癌细胞在雌激素减少情况下，癌细胞表达CD63。这说明CD63的表达受到激素水平的调节，并由此改变CD63量和/或功能而影响乳腺癌的进展。与之相比，MAbFC-5.01抗CD63单抗的研究揭示了其活性表位在不同正常组织上表达不同。尽管该抗体能识别CD63，但并不能区分早期和进展期黑色素瘤，包括转移性黑色素瘤(这点与MAbME491不同)，这表明CD63抗原曾经在这些进展程度较高的肿瘤细胞上表达，但是在肿瘤的不同进展阶段，在细胞内，其某些表位被掩盖了。可能原因是改变了CD63核心多肽的翻译后修饰，或是由于CD63和其他分子的相互作用，影响了抗体识别和特异性结合所需的特殊表位。这些研究结果支持1993年Si和Hersey所报告的观察结果，他们用MAbNKI-C3抗CD63单抗进行染色，结果在组织切片上不能区分不同进展阶段的黑色素瘤，例如早期，放射生长期和垂直生长期，以及转移性黑色素瘤。1998年Adachi和Huang等研究分析从乳腺癌和非小细胞性肺癌细胞中提取的mRNA,通过PCR定量，发现四次跨膜分子超家族中的两个成员，包括CD9和CD82，它们的表达水平与肿瘤进展和患者预后存在明显的相关关系，CD63在所有的样本中表达都是相似的，因此不存在这种相关关系。由于上述试验结果存在明显矛盾，因此并无有力和一致的数据资料能够明确证明CD63和肿瘤之间的关系。到目前为止，很少数体内研究试验试图建立一种CD63与该分子可能存在的对晚期胂瘤的抑制作用之间的联系。其中一项研究中，人CD63过度表达的H-RAS转化的NIH-3T3细胞经皮下和腹腔注射给无胸腺小鼠，与亲代CD63非过度表达小鼠细胞比较，结果显示前者肿瘤体积缩小，生存期延长，潜在的转移性下降，产生了肺瘤趋恶性/发生性均降低的小鼠表型。这表明经过转基因的细胞，CD63的表达能够抑制人体肿瘤细胞的恶性行为。更近期研究工作中，利用转基因小鼠模型表达人CD63，诱导小鼠对人CD63产生耐受，再给予注射人CD63-MHC-I类分子(H-2Kb)共转染鼠黑色素瘤细胞，肿瘤细胞的生长能够被抑制，小鼠生存期延长；基于此项研究，可以用痘病毒融合人CD63进行免疫接种。该研究作者指出由于肿瘤生长的抑制作用仅仅存在于CD63-MHC-I类分子共转染细胞，而不是CD63单独转染细胞，所以这种治疗作用是T淋巴细胞依赖性的，内源性抗CD63单抗似乎并未参与保护作用。预先经人CD63免疫的野生型动物，产生抗CD63抗体支持这种解释，因为免疫动物并没有产生对肿瘤细胞生长的保护性抑制作用。1995年，Radford等用人CD63转染KM3细胞(最初认为是人源，后来定性为鼠源)，表明当皮内注射肺瘤细胞至无胸腺小鼠时，与未转染的KM3亲代细胞比较，该种蛋白的表达减慢了肿瘤细胞生长和恶性化进程，尽管在体外试验中，各种转染和未转染细胞生长率并无显著性差异。这些观察说明CD63的潜在作用和其他已知的肿瘤抑制基因在体内和体外对肿瘤细胞的作用不相同。此外，1997年Radford等发现，在体外试-验中，抗CD63单抗ME491对同种细胞的作用是通过减少细胞随机运动，而不是影响细胞生长速度。这项研究还描述了如下观察在细胞外基质(ECM)衍生的趋化因子作用下，CD63能刺激细胞运动，这些趋化因子包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白、胶原和玻璃粘连蛋白。CD63的这种功能可能由&整合素介导，尽管整合素抗体并不能够阻断这种作用。然而，玻璃粘连蛋白介导的信号传导(已知为整合素cg35的配体)，似乎与CD63转染细胞上ECM成分包括层粘连蛋白、纤维连接蛋白合胶原所介导的信号传导作用之间存在相互拮抗作用。这提示在ECM同时存在的特殊条件下，CD63的表达能导致细胞迁移能力下降，这种迁移能力主要依赖于细胞粘附和运动之间的平衡。另一项研究中，抗CD63单抗(MAb710F)提高了经过PMA处理后HL-60细胞的粘附性和伸展性，抗CD63单抗(Mab2.28)能刺激产生类似作用，只是受刺激细胞所占比例小，而且需要加入的抗体量更多。这些结果说明尽管目前已经研发了多种抗CD63抗体，但是它们的功能可能存在很大区别。四次跨膜超家族可能也参与了细胞增殖。1990年，Oren等描述了鼠MAb5A6通过识别淋巴细胞CD81(TAPA-1)而产生抗增殖作用。另一个研究中，通过将抗体和人类T淋巴细胞CD37连接阻断了CD37诱导的细胞增殖。在更为近期的一项通过CD37基因敲除获得的CD37缺失小鼠动物模型研究中，比较缺失小鼠和野生鼠分别对刀豆蛋白A激活后产生的增殖反应，以及CD3受体参与的T淋巴细胞反应，显示基因敲除小鼠T淋巴细胞高度增殖。因此提出四次跨膜超家族可能具有参与细胞生长和增殖的共同特性。最近关于肝母细胞癌和肝细胞癌研究中显示，如果在上述癌细胞中加入抗CD81单抗能活化Erk/MAP激酶途径。已经证实此信号转导途径参与细胞生长和增殖过程。平行研究中也表明，经过转染过度表达人CD81的细胞和模拟转染对照组比较显示出增殖下降。因此相关证据已经指出，四次跨膜超家族分子，尤其是CD63在细胞生长和增殖、粘附和运动过程中起着重要的作用。这两类细胞事件是目前研究的重要靶点，因其在肿瘤进展和转移过程中起着中心作用。目前为止，还没有报导抗CD63抗体或者其它药物能够特异性针对CD63表达的细胞，同时影响人体肺瘤细胞体内和体外生长特性，或是影响肿瘤细胞生长动物模型的生存期。氨基酸序列测定和分析未能揭示四次跨膜超家族与其它蛋白质家族或任何以前已经定性的功能分子之间的同源性，也未能显示其具有目前任何已知酶活性。结果，人们很难研究该蛋白质家族分子在信号转导途径中的调节作用。不管怎样，有证据说明，应用四次跨膜超家族特异性药物能改变细胞生理过程，这一改变和信号转导途径存在密切的依赖关系，表明了四次跨膜超家族具有信号转导特性。CD63在生理和/或功能上均显示出与本身是酶并且参与次级信号转导，或者一系列与在生理和/或功能上有相似功能的酶有关分子之间的联系。中性粒细胞和内皮细胞之间的相互作用是炎症反应的起始步骤之一，研究其相互作用机制的试验表明，预先经过抗CD63单抗(AHN-16、AHN-16.1、AHN-16.2、AHN-16.3和AHN-16.5)处理，能刺激中性粒细胞对培养内皮细胞层的粘附。这种作用具有强钙离子依赖性，众所周知，钙离子是多种细胞间信号转导途径的调节因子，它作用于抗体刺激细胞后的特定阶段。经过与抗体较长时间的相互作用，中性粒细胞对内皮细胞的粘附作用开始对后来加入的4丐离子敏感，提示这是动态一过性的调节。此外，在生理上CD63和CD11/CD18复合物相互作用，特异性靶向作用于此复合物的药物也能介导信号转导。这项研究中还发现，在生理上，CD63和酪氨酸激酶Lck和Hck有关，或者其本身就是该酶的一部分。酪氨酸激酶是一类蛋白质的组成成员，这些激酶在细胞表面受体活化后，参与介导调节细胞间信号传导，因其特殊的细胞生理改变。另一项研究也表明，四次跨膜超家族(包括CD63)的配体和单抗结合后，能够增强MDA-MB-231乳腺癌细胞对月交原底物的石粦酸化和FAK(focaladhesionkinase)激酶活性。这指出了CD63以及其它四次跨膜超家族成员在整合素介导的酪氨酸激酶信号转导途径中的直接调节作用。其它在功能上与CD63结合抗CD63单抗MAb710F后能产生交叉作用的信号转导通路是PKC(proteinkinaseC,蛋白激酶C)调节的磷酸化途径，这也是另外一个人们已经很熟知的细胞内信号通路。在本文内，MAb710F作用于HL-60,骨髓细胞的粘附性增强以及形态学改变均依赖于对细胞所进行的PMA(phorbolmyristateacetate,豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯)预处理，但PKC的一过性参与作用并没有能够得到最终证实。尽管如此，后来一独立工作组的研究中证明了PMA诱导的HL-60分化是PKC活性依赖性的，其原因是Ro31-8220为PKC的抑制因子，阻断了PMA的作用。进一步的证据也支持CD63以及其它四次跨膜超家族和信号转导通路的关系，这些证据来源于CD63(和CD53)分子本身直接或是條:为超分子复合物的一部分与酪氨酸磷酸化激酶活性之间的生理关系研究工作。研究中，利用抗CD63抗体分离的免疫沉积复合物与酪氨酸磷酸酶活性有关，研究者无法识别CD63有关的磷酸酶，CD53则与酪氨酸磷酸酶CD45有关，在这点上两者存在不同。最近研究发现，几个四次^夸膜超家力矣的成员与II型PI4-K(phosphatidylinositol4-kinase(磷脂酰肌醇4激酶)，Berditchevskietal.,1997)有关。这种相互作用似乎很特别，因为仅仅在CD9、CD63、CD81、CD151和A15/TALLA中得到了证实，在CD37、CD52、CD82和NAG-2中并没有发现。另外，由于PI4-K复合物仅限于个别四次跨膜超家族成员，所以四次3争膜超家族成员和PI4-K之间的作用似乎是互相排斥的。特别的，CD63-PI4-K复合物，和其它四次跨膜超家族成员不同，该复合物几乎完全位于细胞内具有脂阀样结构域的小体上。这一观察说明CD63与PI4-K的相互作用可能参与了细胞内的特殊事件(Claas，C,etal.,2001)，这些事件与磷酸肌醇的生物合成途径有关或依赖于其合成，众所周知，磷酸肌醇除了是重要的次级信号传导分子外，还参与细胞膜转运(内吞和胞吐)以及细胞骨架的重组过程(Martin,T.,1998)。到目前为止发现的和CD63有直接相关关系的酶，以及酶在信号转导通路中的调节作用，提供了更进一步的证据来支持CD63在信号转导通路中的调节作用；CD63既可以调节酶活性也可以估文为酶的下游效应分子。由于很多观察结果的矛盾性，努力去详细阐述肿瘤进展的机制非常困难和复杂，因此很少有人能够把试验观察结果成功的转化成临床治疗方案。鉴于目前已知的关于CD63和肿瘤进展和转移以及信号转导机制之间的关系，人们有可能在肿瘤细胞内改变CD63的功能。研发一种抗原特异性肿瘤细胞毒药物具有极大的好处，因为该药物能够做为肿瘤性疾病的诊断工具和潜在治疗方法。这种药物能够通过本身或者是结合其它分子后识别并结合细胞上表达的抗原，产生细胞或体内的生理活性，从而抑制肿瘤细胞生长、进展和转移，同时对正常人体细胞则无明显的损伤作用。在先专利US05296348介绍了选择特异性识别肿瘤细胞表面内化抗原的单抗，以及识别在细胞代谢中具有对抗转录和/或复制的单抗的方法。其中举例为ME491抗体在W9、WM35和WM983黑色素瘤细胞以及SW948结直肠癌细胞能被内化。此外该抗体还能减慢SW948细胞转录和细胞增殖。专利申请US20030211498A1(以及相关申请包括WO0175177A3、WO0175177A2、AU0153140A5)确定了一种方法，通过抗体结合卵巢癌标志性多肽抑制肿瘤的生长和转移，这种多肽由一组包括CD63抗原基因的基因组编码。应用卵巢癌基因表达序列分析法对卵巢癌的标志基因进行检测结果发现CD63抗原基因包含于其中。专利申请WO02055551A1(以及相关申请CN1364803A)确定了一种新型多肽，即人CD63抗原56.87。专利申请CN1326962A确定了人CD63抗原15.07。专利CN1351054A确定了人CD63抗原11.11。这些专利和专利申请均确定了CD63抗原和抗体，但是未说明目前研究中分离出的单抗的用途。
发明内容目前已经获得授权的美国专利6,180,357号的发明人，把命名为"病人个体化特异性抗肿瘤抗体"直接应用于选择个体化常规抗肿瘤抗体，这种抗肿瘤抗体有助于治疗胂瘤性疾病。就本文来说，"抗体"和"单抗，，可以互相交换使用，都是指由杂交瘤细胞(例如人或鼠)产生的完整的免疫球蛋白，免疫结合物，更确切的说是由上述免疫球蛋白衍生的免疫球蛋白片段和重组蛋白，例如嵌合体和人源化免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2片段、抗体单链、重组免疫球蛋白可变区(Fv)s和融合蛋白等。从文献中已知，多肽中的某些氨基酸序列改变不引起蛋白质结构和功能显著变化。在抗体的分子重组过程中，免疫球蛋白骨架区核苷酸或氨基酸的修饰通常能够被耐受，修饰包括替代(首选保守替代)、缺失和插入，但并不局限于这三种方式。此外，使用目前研发的CDMAB结合标准化疗方法例如放射性核素法也属于此项发明范围，因此上述化疗方法的使用也是治疗关注的焦点。CDMAB还能结合毒素、半毒素、酶(例如生物素结合酶)和血细胞，形成抗体结合物。本专利申请应用专利'357中介绍的分离能够产生可修饰性肺瘤性疾病单抗的杂交瘤细胞的方法，用以生产病人特异性抗肿瘤抗体。这些抗体可以特异性应用于一种肿瘤或者可能成为肿瘤治疗的常规方法。在本专利申请中，抗肿瘤抗体的特性是具有杀死细胞的细胞毒性作用或者细胞生长抑制作用，两者都是指细胞毒作用。这些抗体可用于肿瘤分期和诊断，亦可治疗转移性肿瘤。这种个体化抗肿瘤治疗前景将会改变目前肿瘤患者的治疗模式。可能的临床状况是，在肿瘤患者初次就诊时即采取肿瘤标本并贮存于标本库中。利用该标本，应用系列预先储存的可修饰性抗体，能对该患者肿瘤进行分型。可以按经典方法对患者进行分期，但是应用抗体则能对其进一步分期。患者在就诊后可立即接受预成抗体和/或对肿瘤细胞敏感的系列抗体治疗。抗体获得方法包括这里列举的方法或者通过结合筛选法(screeningmethods)应用于噬菌体展示库的方法。有一种可能性，即经过治疗后的肿瘤表位可能会被具相同表位的其他肿瘤细胞所耐受，因此产生的全部抗体均应加入抗肿瘤细力包抗体库。通过这种方法产生的抗体对于任何能与抗体结合的任何肿瘤性疾病患者可能均有效。按照US6,180,357的方法步骤，如同在S.N.10/348,231中介绍的那样，应用乳腺癌患者的肿瘤组织活检所获得的肿瘤细胞免疫小鼠能够获得鼠7BD-33-llA单抗。7BD-33-llA抗原广泛表达在人体内不同来源组织细胞表面。体外试验中，在乳腺癌细胞MCF-7和前列腺癌细胞PC-3均对7BD-33-llA的细胞毒性作用存在易感性。7BD-33-11A对乳腺癌和前列腺癌培养细胞的细胞毒性作用进一步扩展应用于它在体内可能存在的抗肿瘤活性(如美国申请.10/348,231号和10/603,006号中介绍)。前期临床异种移植肿瘤模型明确提示治疗有效。如同在美国申请10/348,284和10/603,006号中介绍的那样，7BD-33-llA在体内人乳腺癌肿瘤模型中具有抑制胂瘤生长、减轻肿瘤负荷的作用。治疗后连续观察300天，7BD-33-llA没有加重肿瘤进展，在瘤细胞植入后9月治疗组存活率为87.5%。相反地，同种型对照组在试验第72天时(给药后第23天)死亡率为100%。因此认为7BD-33-11A能够延长乳腺癌肺瘤动物模型的生存期，并且能抑制肿瘤生长(延緩肿瘤进展)。美国申请10/348,284和10/603,006还列举并描述如下建立人乳腺癌体内试验模型，7BD-33-11A具有显著抑制肿瘤生长和延緩肿瘤进展的作用。在试验第80天(给药后第23天)，7BD-33-llA治疗组和i爰沖液对照组小鼠比4支，治疗组比对照组肿瘤体积小83%(p=0.001);用存活率判断疗效，给药第60天时，治疗组的死亡危险仅为对照组的16%。同种型对照组在给药后第50天死亡率为100%。与之相比，给药后第130天，7BD-33-llA治疗组小鼠存活率为60%。这些数据结果说明7BD-33-11A治疗组和对照组比较，前者显示对延长生存期和延缓胂瘤进展的有益作用。7BD-33-llA治疗是安全的，因为并没有导致任何包括体重下降和临床精神抑郁等毒性副作用；7BD-33-llA治疗也是有效的，因为在人乳腺癌体内动物试验模型中，和对照组比较，它能够减慢肿瘤生长和延长生存期。，过两个不同的乳腺癌异种移植模型试验来判定比较单独使用化疗药顺铂以及顺钼联合7BD-33-l1的治疗效果。MDA-MB-231(MB-231)模型中，结果显示，试验第69天(给药后第5天)，7BD-33-11A治疗组肿瘤生长比緩冲液对照组慢76%(p<0.001)。顺柏治疗组和顺柏联合7BD-33-11A治疗组与緩冲液对照组比较，前两组小鼠肿瘤体积分别缩小了79%和86%(p<0.001)。MDA-MB-468(MB-468)模型中，于试验第55天(给药后第5天)，顺铂治疗组和顺钿联合7BD-33-11A治疗组分别显示出最好的肿瘤缩小效果，两组分别为95。/。(p-0.024)和97。/。(p-0.17)。7BD-33-llA治疗组在试验第55天时与緩冲液对照组比较，显示肿瘤体积缩小了37%。MB-231和MB-468模型中，测量试验小鼠体重并进行比较，7BD-33-11A比顺铂治疗后显示出更好的生存状态。试验结果表明MB-231模型中，7BD-33-11A和顺柏比较，前者更容易被耐受，7BD-33-llA治疗几乎没有体重下降等副反应，显示出更好的疗效，而顺铂在两种乳腺癌模型中均引起明显体重下降。为了明确7BD-33-11A的最佳有效剂量，研究人员应用乳腺癌异种移植模型进行了药物剂量反应试验。在试验第55天(给药后第5天)，0.2mg/kg治疗组为同种型对照组肿瘤生长的85%。同一时间，2.0mg/kg和20mg/kg治疗组没有肿瘤生长。试验第125天(给药后第75天)呈现类似的结果，此时20mg/kg治疗组仍旧没有肿瘤生长，但2.0mg/kg治疗组可见早期肿瘤生长。7BD-33-llA治疗也证明其具有延长动物生存期的作用。同种型对照组小鼠在试验第104天(给药后第54天)全部死亡，然而0.2mg/kg治疗组全部存活直到第197天(给药后第147天)。2.0kg/kg和20mg/kg治疗组显示出对于生存期更好的作用，试验第2卯天(给药后第240天)2.0mg/kg治疗组只有50%小鼠死亡，20mg/kg治疗组则无一例死亡。因此不同剂量7BD-33-llA三个治疗组均表现出良好的减慢肿瘤生长和延长生存期的作用，20mg/kg治疗组具最佳疗效。7BD-33-l1A除了在乳腺癌肿瘤细胞体内试验模型中显示出有益作用外，在前列腺癌体内动物试验模型中(S.N.10/603,006),也显示了其对PC-3细胞的抗瘤活性。与同种型对照抗体组比较，7BD-33-11A在治疗开始后不久即表现出显著抑制肿瘤细胞生长的作用(p=0.001)。在治疗期末，7BD-33-11A治疗组小鼠肿瘤体积^l为同种型对照组的31%。对PC-3重症联合免疫缺陷异种移植动物模型而言，体重可用做疾病进展的替代指标。试验第52天，7BD-33-llA治疗组与同种型对照组比较显著预防其体重下降54%(p=0.002)。监测小鼠的生存期，治疗开始后11天，同型对照组和緩沖液对照组小鼠死亡率为100%。与之相反，7BD-33-llA治疗组在治疗开始后第38天死亡率才达100%,生存时间为对照组的三倍。因此7BD-33-11A治疗是有效的，因为在人前列腺癌试验模型中，和同种型对照组比较7BD-33-11A能同时减慢肿瘤生长，预防体重下降和延长存活期。除了在上述前列腺癌体内肿瘤模型中的预防作用外，人们在体内肿瘤才莫型试验中也证明了7BD-33-llA对PC-3细胞的抗瘤活性(S.N.10/603,006)。在治疗开始后立即测量肿瘤平均体积，7BD-33-llA治疗组与同种型对照组比较，治疗组胂瘤体积显著小于同型对照组(p<0.024)。治疗组与同种型对照组比4交显示前者肿瘤抑制达36%。7BD-33-llA在几个不同的肿瘤^f莫型中所表现除的抗瘤活性，4吏其成为一个颇具吸引力的抗肿瘤药物。正常人体组织表达的7BD-33-11A已经预先确定(S.N.10/603,006)，为了确定7BD-33-11A做为药物其作用靶点表位。通过将其与商业化抗CD63抗体(RFAC4和H5C6)进行比较使得该方面研究得以进展。组织染色结果表明7BD-33-11A限制性结合于不同细胞类型，其中包括浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。RFAC4和H5C6抗体比较，染色图像结果相类似。然而RFAC4和H5C6的染色图像和7BD-33-11A比较则完全不同。特别地，RFAC4和H5C6抗体均广泛结合于正常组织，在7BD-33-11A染色同时阳性的组织，它们的染色更强。RFAC4和H5C6不仅仅结合于浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞，也结合于大多数组织中的内皮细胞。对7BD-33-11A抗原进行定位，确定其在人群中的表达率，例如在乳腺癌患者中的表达率，这对评价7BD-33-11A的疗效以及设计更好的临床试验很重要。为了定位乳腺癌患者肿瘤细胞上7BD-33-11A抗原表达的部位，预先筛选了50例乳腺癌患者的肿瘤组织标本用于定位7BD-33-11A的表达部位(S.N.10/603,006)。目前的研究工作比较了7BD-33-11A与RFAC4和H5C6、抗Her2抗体(c-erbB-2)的染色特点。其结果与之前的研究相类似，显示有36%的肿瘤组织标本7BD-33-11A抗原染色阳性，H5C6和RFAC4则分别为94%和85%。由于7BD-33-11A染色局限于恶性细胞上因此考虑它是肿瘤细胞特异性的。此外，在乳腺癌患者的IO份正常组织标本染色中7BD-33-11A均为阴性，H5C6和RFAC4则分别有7份和8份标本染色阳性。乳腺癌细胞表达7BD-33-11A的部位位于恶性细胞的细胞膜上和胞浆内，因此使CD63成为肿瘤治疗中较具吸引力的靶点。人们在乳腺癌细胞雌激素和黄体酮受体表达水平的基础上进一步评估了7BD-33-11A的表达，这些激素受体的表达在乳腺癌的发展、治疗以及预后方面起着重要的作用。在上述激素受体和7BD-33-11A的表达之间存在轻微相关关系，有受体表达的组织7BD-33-11A表达有轻度升高。如果在肿瘤分期和进展程度方面进行分析，结果是肺瘤进展程度越高则7BD-33-llA表达越强。类似结果也见于RFAC4。H5C6虽然显示出和激素受体表达之间的轻微相关关系，但是和肿瘤进展阶段无明显相关。然而对于三种抗体来说，结果都受到样本量小的限制。与c-erbB-2比较，7BD-33-llA显示出完全不同的染色图像，7BD-33-11A阳性标本中有一半Her-2表达阴性，这提示乳腺癌患者靶向治疗需要未被完全满足。两者染色都阳性的肿瘤组织切染色强度上仍旧存在不同。在一份正常乳腺组织切片c-erbB-2染色也为阳性。在前列腺癌患者中定位7BD-33-11A的表达部位以及确定人群表达率也是很重要的，主要是用于评估7BD-33-11A对于前列腺癌患者的免疫治疗效果和设计有效的临床试验。预先筛选51例前列腺癌患者的肺瘤组织标本用以定位7BD-33-llA的表达部位。研究结果显示88%组织标本7BD-33-11A染色阳性。尽管7BD-33-llA在正常组织也有高表达，但是和正常组织比较，肿瘤组织标本上细胞膜染色强度较高。一例胚胎4黄紋fl肉瘤组织7BD-33-11A抗原染色阴性。似乎在肿瘤进展阶段和7BD-33-11A抗原表达之间并不存在直接相关关系。但是该结果仍受到样本量小的限制。为了进一步扩展了解7BD-33-11A的潜在治疗作用，人体不同肿瘤组织中该抗原出现频率和部位均经过预先确定(S.N.10/603,006)。除了乳腺癌和前列腺癌之外，其它部位的不同类型肿瘤也表达7BD-33-UA,染色阳性的人类肿瘤组织类型包括皮肤(l/2)，肺(3/4)，肝(2/3),胃(4/5)，曱状腺(2/2)，子宫(4/4)和肾脏(3/3)。某些肿瘤不表达抗原，其中包括卵巢(0/3),睾丸(0A)，脑(0/2)和淋巴结(0/2)。和人乳腺癌和前列腺癌肿瘤组织一样，7BD-33-11A同时表达在肿瘤细胞膜上和胞浆内。因此，7BD-33-l1A抗体除了在体外能够结合在肺瘤细胞上，也有证据说明抗原能够在人体多种类型的肿瘤细胞上表达。如下所列举，另有生物化学数据也支持7BD-33-11A识别的抗原是CD63。研究表明，两种抗CD63单抗(RFAC4和H5C6),通过免疫沉淀法确定了7BD-33-11A识别并结合的蛋白。另外，细菌表达研究进一步阐明了7BD-33-11A结合CD63细胞外loop2部位。7BD-33陽11A表位为构象依赖性。这些免疫组化染色和生物化学结果证实了7BD-33-11A结合于CD63抗原。因此有大量的证据表明7BD-33-11A介导的抗肺瘤作用是通过和CD63上独特的构想表位相连接有关。对于本文而言，表位指的是CD63抗原的一部分，其特点是能够和7BD-33-UA杂交瘤细胞产生的单抗结合，也可与抗原结合片段或者抗体结合物相结合。总的来说，上述数据结果证明了7BD-33-11A抗原是肿瘤相关抗原，在人体中表达，病理学上相应的是肿瘤治疗耙点。同时也证明7BD-33-11A抗体与人体肿瘤组织相结合，合理应用于检验能够辅助诊断、早期治疗和判断预后。此外，该抗原在细胞膜上的表达部位能提示瘤细胞状态，因为多数非恶性细胞均不表达此抗原。这种观察结果有助于应用此抗原，及其基因以及衍生物，蛋白质或者是变异成分，用于肿瘤性疾病的诊断，早期治疗和预后判断。本文介绍了7BD-33-11A的进展和应用，这是美国专利6,180,357所介绍内容的进一步发展，内容包括7BD-33-UA识别，作用了解以及细胞毒试验，已建立或未建立的肿瘤生长动物模型以及紳瘤性疾病生存期观察。该发明代表了肿瘤治疗领域的新进展，首次描述了一种能够特异性与表达在肿瘤细胞上的靶分子CD63表位相结合的药物，同时介绍了其在体外对恶性肿瘤细胞而不是正常细胞的细胞毒性特点，该药物在人肿瘤体内模型中能够直接抑制肿瘤生长，延长生存期。说这是一项发明进展是由于之前任何关于抗CD63抗体的描述均无类似特点。它第一次清楚的证明了CD63在某些类型肿瘤中参与其生长和进展过程。它还提出了肿瘤治疗的一个潜在发展，即在人类胂瘤患者中它也具有类似的抗肿瘤特性。更深一层意义，将此抗体加入抗肿瘤抗体库，将会增加一种可能性，这种可能性是指针对肿瘤细胞表达的不同抗原标志物，来确定不同肿瘤细胞的适合抗体，以便能发现最有效针对抑制肿瘤生长和进展的抗体。总的来说，本发明介绍了应用7BD-33-11A抗原做为药物治疗的靶抗原，使用后能够减轻哺乳动物肿瘤因表达该肺瘤抗原所引起的肿瘤负荷，延长接受治疗动物的生存期。本发明还介绍了CDMAB(7BD-33-llA)及其衍生物、抗原结合片段的使用，具有与7BD-33-11A相同的作用。此外，本发明还介绍了肿瘤细胞内7BD-33-11A的检测能够用于哺乳动物中表达此抗原的肿瘤性疾病的诊断、早期治疗和预后判断。如果患者在治疗后病情难以控制或者肿瘤进展，那么在肿瘤治疗过程中产生的肿瘤特异性抗体能够重复用于肿瘤再次治疗阶段。而且，可以将患者或者是适合的供者红细胞和抗肿瘤抗体相连接，再次注入肿瘤转移患者体内。转移性肿瘤几乎没有有效的治疗方案，一旦转移则通常预示最终死亡的不良结局。然而，转移性肿瘤通常具有良好的血液供应，利用红细胞运送抗肿瘤抗体能够使抗体集中作用于肿瘤部位。即使在没有转移情况下，多数肿瘤细胞存活也需要依赖于患者的血液供应，因此红细胞结合抗体对于原位肿瘤也是有效的。抗体也可以连接于其他血细胞上，例如淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞、自然杀伤细胞等。抗体分为五类，每种抗体由于其重链不同而具有不同的功能。通常认为，肺瘤细胞的杀伤是通过抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)或者是补体依赖的细胞毒作用(CDC)。例如，鼠lgM和IgG2a抗体和补体Cl结合能活化补体系统经典途径引起肿瘤细胞溶解。人类抗体中，IgM和IgGl具有较强的补体激活作用。鼠lgG2a和IgG3同种型能够招募携带Fc受体的细胞毒细胞，并由此介导单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和某些淋巴细胞的肿瘤细胞杀伤作用。人IgGl和IgG3同种型能够介导ADCC。另外一个抗体介导肿瘤细胞杀伤作用的可能机制为使用具有催化作用的抗体催化细胞膜上各种化学键以及相关糖蛋白和糖脂的水解，这种抗体称为催化抗体。另外两个广泛接受的抗体介导胂瘤细胞杀伤作用的可能机制为第一，利用抗体作为疫苗诱导机体产生针对肿瘤细胞上的可能存在抗原的免疫反应；第二，利用抗体攻击肿瘤生长相关受体，影响或下调其功能，甚至使其功能丧失。抗肿瘤药物的临床应用基础是药物对疾病有效且危险因素在患者能够接受的范围内。在肿瘤治疗中，不管抗肿瘤作用在延长寿命之外还具备多少公认的益处，延长生存期是最致力追求的目标。除了不影响生存期，其它的益处包括减轻症状，保护和防止不良事件的发生，延长肿瘤复发时间和无症状生存期，延緩肿瘤进展。人们通常接受上述标准，也体现了美国食品与药品管理局(FoodandDrugAdministration,F.D.A.)认可的药物所具备的有益作用(Hirschfeldetal.CriticalReviewsinOncology/Hematolgy42:137-1432002)。众戶斤周，除了这些标准之外，还有其他方面可以提示这些益处。部分的说，美国F.D.A对该药的迅速批准，认可了预示对患者有益的替代药物的存在。2003年底，已经有16种用该方法生产的药物，其中4种已经完全通过批准，后续的研究已经证实了预测的药物对患者的有益作用。对实体瘤的药物治疗效果的评定很重要的一个方面是测定肿瘤对治疗的反应，看肿瘤对患者的影响作用(Therasseetal.JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。肿瘤国际专家小组SolidTumorsWorkingGroup发布了一个临床肿瘤治疗反应评估标准，即RECIST标准。依据该标准对肿瘤患者药物治疗反应进行客观评估，证明了药物对肿瘤患者的有益作用。在临床前期可以直接进行评估和记录。进入临床期后，药物在临床前期模型中所表现的延长生存期作用显示出了最大的预期临床效果。与临床药物治疗效果相类似，在临床前期能够减轻肿瘤负担的药物能够对疾病产生显著直接的影响。尽管抗肿瘤药物治疗临床结果最致力寻求的是延长存活期，但还有其它临床价值，很明确的是能够减轻肿瘤负荷，这点和延迟疾病进展，延长生存期有关，由此产生对临床有益的直接影响(Eckhardtetal.DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASCOEducationalBook,39thAnnualMeeting,2003，pages209-219)。相应的，本发明的目的是介绍一种方法，该方法由某些特殊个体衍生的细胞合成肿瘤性疾病可修饰性抗体，此抗体对肿瘤细胞具有细胞毒性作用，同时对非肿瘤细胞相对没有毒性。分离杂交瘤细胞以及其编码产生的相应的单抗和抗原结合片段是这种方法的主要目的。本发明的另外一个目的是介绍CDMAB及其抗原结合片段。本发明更进一步的目的是合成通过ADCC和CDC介导的肿瘤细月包毒性的CDMAB。本发明的另外一个目的是合成CDMAB,其细胞毒作用在于它能够催化水解细胞化学键。本发明的另外一个目的是合成CDMAB，应用于结合试验，辅助肿瘤疾病的诊断、预后判断和病情监测。通过本文下述的说明和例证，和本发明的某些具体描述，其它相关目的和好处将更加明了。本专利或申请文件包含了至少一页彩图。使用带有彩图的本专利申请需具备正式官方申请以及支付必要费用。图1:采用7BD-33-11A(图A)或同种型对照(图B)做为探针，对MDA-MB-231细胞溶解物(泳道1)或细胞膜(泳道2和3)进行免疫印迹试验。左侧为分子量标志。图2:采用7BD-33-llA做为探针，对MDA-MB-231细胞膜进行免疫印迹试验。泳道l:还原条件下。泳道2:非还原条件下。左侧为分子量标志。图3:去糖基化在7BD-33-11A与MDA-MB-231细胞膜结合中的作用。MDA-MB-231细月包膜分别经糖肽酶F(PNGaseF;泳道1)、O-glycanase(泳道2)、唾液酸酶(泳道3)、PNGaseF、O-glycanase和唾液酸酶(泳道4),PNGaseF、O-glycanase、唾液酸酶、半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(泳道5)以及緩沖液对照(泳道6)处理。左侧为分子量标志o图4:7BD-33-llA免疫沉淀MDA-MB-231膜蛋白SDS-PAGE(图A)和Westernblot(图B)。泳道A:同种型对照免疫沉淀蛋白，泳道B:7BD-33-llA免疫沉淀蛋白，泳道TM:MDA-MB-231膜蛋白。矩形框标示泳道B的SDS-PAGE和泳道TM的Westernblot。左侧为分子量标志。图5:Profound搜索结果。图6:MASCOT搜索结果。图7a:以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、IgG2a同种型对照(图C)和IgGl同种型对照(图D)为探针的蛋白质Westernblots。泳道A:MDA-MB-231总膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C:抗CD63(RFAC4)免疫沉淀蛋白；泳道D:IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白；泳道E:IgGl同种型对照免疫沉淀蛋白。左侧为分子量标志。图7b:以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(H5C6克隆，图B)、IgG2a同种型对照(图C)和IgGl同种型对照(图D)为探针的蛋白质免疫印迹试验。泳道A:MDA-MB-231膜蛋白；泳道B:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道C:抗CD63(H5C6)免疫沉淀蛋白；泳道D:IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白；泳道E:IgGl同种型对照免疫沉淀蛋白。左侧为分子量标志。图8:以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、抗CD63(H5C6克隆，图C)、IgG2a同种型对照(图D)和IgGl同种型对照(图E)为探针的蛋白质免疫印迹试验。泳道1-5:7BD-33-11A免疫沉淀蛋白；泳道6-10:IgG2a同种型对照免疫沉淀蛋白。泳道1和6:不含NaCl;泳道2和7:150mMNaCl;泳道3和8:500mMNaCl;泳道4和9:2000mMNaCl;泳道5和10:RIPA緩冲液。图9:以7BD-33-11A(图A)、抗CD63(RFAC4克隆，图B)、抗CD63(H5C6克隆，图C)、IgG2a同种型对照(图D)为探针的蛋白质免疫印迹试验以及考马斯胶蓝蛋白染色(图E)。左侧为分子量标志。泳道l:非诱导型vector;泳道2:非诱导型GST-EC1;泳道3:非诱导型GST-EC2;泳道4:诱导型vector;泳道5:诱导型GST-EC1;泳道6:诱导型GST-EC2。图10:7BD-33-llA，同种型对照和抗EGFR抗不同肿瘤细胞和非肿瘤细胞的典型流式细胞仪图谱。图11:7BD-33-llA(A),同种型阴性对照(B),抗CD63(RFAC4)抗体或抗CD63(H5C6)抗体(D)与正常人结肠组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-llA，RFAC4和H5C6在固有层中的巨噬细胞和淋巴细胞呈现强染色，RFAC4和H5C6在粘膜上皮也为强染色。放大倍数为200x。阅11.，DTV"11A/A、曰R日，WrBSrD、45r/D"CT八r14、UiJl厶./JJWJJ隱1丄A、^T"V乂，l一J'II'工l>M;"、、JJ乂,、1VA'^r"vi，y抗体(C)或抗CD63(H5C6)抗体(D)与人乳腺浸润性导管癌组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-11A与RFAC4或H5C6比较，前者在肺瘤细胞染色呈弱阳性。放大倍数为200x。图13:7BD-33-11A(A)或抗Her2(c-erbB-2)抗体(B)与人乳腺浸润性导管癌组织结合典型组织切片显微照片。7BD-33-llA在肿瘤细胞内染色为强阳性，抗Her2抗体染色为阴性。放大倍数为200x。图14:7BD-33-llA与前列腺癌(A)或正常前列腺组织(B)结合典型组织切片显微照片。7BD-33-llA在前列腺癌细胞膜上染色强阳性，在正常前列腺组织腺上皮细胞的胞膜和胞浆内均阳性。放大倍数为200x。图15:MDA-MB-231乳腺癌模型中，月中瘤生长对7BD-33-11A和同种型对照抗体的剂量反应。箭号线表示抗体给予时间，数据点代表+/-SEM均值。图16:MDA-MB-231异种移植模型研究，给予不同剂量7BD-33-llA和同种型对照抗体后的剂量反应。图17:MDA-MB-231乳腺癌才莫型中，7BD-33-llA，顺铂，7BD-33-11A+顺铂和緩沖液对照对肿瘤生长的影响。矩形框内表示抗体给予时间，数据点代表+ASEM均值。图18:MDA-MB-231乳腺癌模型中，7BD-33-llA，顺铂，7BD-33-llA+顺柏和緩冲液对照对体重的影响。图19:MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-11A,顺铂，7BD-33-11A+顺铂和緩冲液对照对肿瘤生长的影响。箭号线表示抗体给予时间，数据点代表+/-SEM均值。图20:MDA-MB-468乳腺癌模型中，7BD-33-llA，顺铂，7BD-33-11A+顺柏和緩冲液对照对体重的影响。具体实施方式实施例1免疫印迹试验法确认抗体结合蛋白为了能够确定7BD-33-11A抗体识别的抗原，细胞膜预先需经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转膜。然后利用7BD-33-11A抗体探针检测其所识别的抗原蛋白。l.细胞溶解，细胞膜碎片预处理。1.1.细胞溶解首先分离MDA-MB-231(MB-231)细胞，细胞经流式细胞仪检测证实为能与7BD-33-11A抗体结合的乳腺癌细胞。应用细胞溶解物和预处理后的细胞膜进行抗原识别和定性。获得MB-231细胞溶解物步骤如下MB-231细胞林(1.5g)置入2ml緩冲液中进行细胞悬浮，该緩沖液组成包括20mMTris，pH7.4,150mMNaCl，1%(v/v)TritonX-100,0.02%(w/v)叠氮化钠(sodiumazide)，2mM原钒酸钠(sodiumorthovanadate)，50mM氟化钠(sodiumfluoride)和鸡尾酒蛋白酶抑制剂(proteaseinhibitorcocktail)(RocheDiagnostics;Manheim，Germany)。然后用玻璃匀浆器进行均一化处理，4。C搅拌并孵育1小时，4"C离心(20,000g)15分钟，洗涤除去不能溶解的物质。采集上清，等分，-80。C保存。BCA(bicinchoninicacid)测定法检测细胞溶解物蛋白质浓度(Pierce;Rockford,IL.)。1.2.细胞膜碎片预处理细胞膜来源于融合培养的MB-231乳腺癌细胞。首先用PBS(phosphatebufferedsaline)洗涤细胞，除去细胞间介质。然后细胞解离加入解离緩冲液(Gibco-BRL;GrandIsland,NY)37。C平;f反振荡器上振荡20分钟。采集细胞，4。C离心(900g)10分钟。PBS再次洗涤细胞，重复4。C离心(900g)10分钟。-8(TC保存。备膜首先需溶解细胞，然后在均质緩沖液中(内含ltablet/50ml完整的鸡尾酒蛋白酶抑制剂(Roche;LavalQC))以3ml緩冲液/lg细胞的比例进行再悬浮，利用置于冰面上的多向振荡器使细胞悬液均一化以助细胞溶解。细胞匀浆置4。C离心(15,000g)10分钟去除细胞核微粒。采集上清，分装于不同试管，4。C离心(75，600g)90分钟。小心移除上清，膜沉淀物置入5ml均质緩冲液中再悬浮。全部试管采集的膜沉淀物混和并重新等分，4。C下离心(75,600g)90分钟。仔细采集并移除上清，测量沉淀物重量。含有l%TritonX-100的增溶溶解緩冲液按照3ml/lg沉淀物的比例加入緩冲液。置于冰面上平板振荡器300rpm振荡1小时，使膜沉淀物增溶。得到的混悬液再次离心(75,600g)，以沉淀不溶物质。仔细移除含有可溶膜蛋白成分的上清液，测定蛋白质浓度，-8(TC保存。2.1-维SDS-PAGE和免疫印迹试验MB-231细胞经上述步骤获得的膜蛋白，需经1-维SDS-PAGE(1DSDS-PAGE)进行分离，堆积胶和分离胶浓度分别为5%和10%。然后4。C过夜电转印至PVDF膜(Millipore;Billerica,MA)。转印的完全性主要取决于预先加入到膜上面分子标志物的分子量。接下来将膜放入含5%(w/v)脱脂奶的TBST液，室温下(RT)1小时。两个相同的样本用〗笨针才企测如下样斑一使用7BD-33-llA抗体(5/xg/ml，溶剂为含5%脱脂奶的TBST)探针，样斑二使用IgG2a同种型对照抗体(5/ig/ml，溶剂为含5%脱脂奶的TBST)探针。样斑均在TBST溶液中洗涤三次，每次10分钟，然后在辣根过氧化物酶结合的羊抗鼠IgG(Fc)溶液中孵育(Bio-RadLaboratories;Hercules,CA)，室温下1小时。TBST洗涤三次，每次10分钟。然后按照生产厂家的"i兌明书将样斑放入TBM过氧化酶底物试剂盒中培养(VectorLaboratories;Burlingame，CA)。用清水漂洗样斑，利用凝胶记录系统获得图像结果(图1和图2)(Bio-Rad;Hercules,CA)。样斑图像是在照相机聚焦，光圈和影像获得时间同样条件下留取的。在图1中，7BD-33-llA抗体结合的蛋白条带分子量范围是20-80kd，其蛋白活性在细胞溶解物和膜碎片中能够检测到。同种型对照中未发现抗体结合于MB-231细胞溶解物和膜碎片成分的任何蛋白，这表明了7BD-33-11A的结合是特异性的。图2证明了在Westernblot中，还原剂对7BD-33-llA结合的影响。该抗体的活性仅仅在无还原剂存在的条件下才能够被检测到(泳道2)。还原剂例如DTT和/3-巯基乙醇能使抗体和抗原不能完全结合(泳道1),提示了7BD-33-11A对天然蛋白抗原表位的识别和结合依赖于二硫键的存在。为确定在Westernblot中检测到的抗原分散特性是否由于异源性糖基化的作用，给予膜片段不同糖苷酶(糖肽酶F、o-glycanase、唾液酸酶、半乳糖普酶和氨基葡糖苷酶)处理，这些酶能够去除特殊的碳水化合物基团。处理后的样品进行IDSDS-PAGE和Westernblot。预期结果是如果某些酶移除了某些碳水化合物基团，这些基团又和7BD-33-11A抗体识别大量的抗原有关，那么在SDS-PAGE上就会出现差异。图3显示了糖苷酶处理后的来源于MB-231细胞的膜片段，结果提示抗体识别抗原量明显减少。这说明7BD-33-11A抗体识别抗原至少和一种糖苷酶有关。显著抗原活性仅仅出现在几种酶同时作用条件下的事实表明，至少有某些碳水化合物成分形成了N连接碳水化合物。尽管经过糖普酶处理的细胞膜在重量上有改变，但并未减轻抗原结合强度。这说明抗体首先结合在抗原糖蛋白的多肽部分。实施例27BD-33-11A抗体结合抗原的识别1.MB-231细胞膜碎片抗原免疫沉淀细胞膜提取物(蛋白质总量为5mg)，加入适量lxlysis緩冲液(50mMTrispH7.4，150mMNaCl，1%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，0.02%NaN3，2mM原钒酸钠(sodiumorthovanadate),50mM氟化钠和鸡尾酒蛋白酶抑制剂(RocheDiagnostics,Manheim,Germany))稀释至蛋白质浓度1mg/ml。再加入适量2xRIPA緩冲液(50mM.三氨基甲烷盐酸緩冲液(Tris)pH7.4,150mMNaCl，1.0%胆酸钠(sodiumcholate),0.2%SDS，1%TritonX-100和0.02%NaN3),最终获得lxRIPA緩沖液浓度。向提取物中预先加入G-琼脂糖凝胶珠(G-Sepharosebeads)(AmershamBiosciences,Uppsala,Sweden),4°C预洁2小时。移出膜提取物，加入库存BSA(10mg/ml)稀释至浓度为0.5mg/ml。在预洁阶段，加入1mLBSA(0.5mg/ml),封闭抗体连接G-琼脂糖凝胶珠。封闭后，将抗体连接G-琼脂糖凝胶珠加入含有BSA的膜提取物中，置于端对端旋转器(end-over-endrotator)上4。C孵育3小时。4°C离心(20,000g)10秒钟，移出并弃去未结合碎片。lmlRIPA緩冲液洗涤去除G-琼脂糖凝胶珠，共洗涤3次，每次5分钟。再次用PBS洗涤一次去除G-琼脂糖凝胶珠。分别对7BD-33-11A抗体结合G-琼脂糖凝胶珠试验组和IgG2a结合G-琼脂糖凝胶珠对照组两组样品进行免疫沉淀(BDBiosciences,SanDiego,CA)。该实验步骤是为了评估蛋白对免疫结合物的非特异性结合。完全去除PBS，G-琼脂糖凝胶珠在40/xL非还原性緩沖液液样品中煮沸，部分样品进行1DSDS-PAGE，继以免疫印迹试验，剩余样品以考马斯胶蓝染色。40/xL样品中，8/iL用于SDS-PAGE和免疫印迹试验，32jtiL用考马斯胶蓝进行蛋白质染色，保留过夜。用于免疫印迹试验的样本于320mA，2小时转膜到PVDF膜上，然后以去离子水漂洗，含5%脱脂奶的TBST室温下封闭l小时，然后加入7BD-33-llA,4。C孵育过夜。TBST洗涤三次去除杂质，每次洗涤10分钟。然后加入HRP连接Fc特异性羊抗鼠IgG(1:5000),在含5%脱脂奶的TBST内，室温下孵育l小时。洗涤三次去除杂质，每次10分钟。然后依据HRP底物TMB的标准过程进行培养发育。如图4所见，用分子量标记作为参考，免疫印迹试验和考马斯胶蓝染色的凝胶为线形排列。考马斯胶蓝染色最强的条带和免疫印迹中与7BD-33-llA产生反应的条带相对应。这一部分在图4中显示尤为突出(矩形框内)。2.肽图和质谱法识别抗原通过上面的试验，切下考马斯胶蓝染色和免疫印迹试验中活性最强部分相平行的条带，然后使用胰蛋白酶商业试剂盒(Pierce,Rockford,IL)进行水解。完全水解部分在SELDI-TOF赛弗吉PBSIIc阅读器(CiphergenPBSIIcreader)(CiphergenBiosystemsInc.,Freemont，CA)上进行质谱分析。简单来说，就是将能够完全水解消化的部分人工放在H4芯片上(CiphergenBiosystemsInc.,Freemont,CA)。干燥,力口入CHCA基质(a-cyano4-hydroxycinnaminicacid;CiphergenBiosystemsInc.,Freemont,CA)，再次干燥。PBSIIc阅读器进行样品分析。从同种型对照组以及空白组和试验组相平行区域取类似大小的条带并与7BD-33-11A免疫沉淀凝胶进行衔接处理，以便能够检测出7BD-33-llA免疫沉淀抗原水解后产生的特殊肽段。大量的特殊肽段经PROFOUND搜索。PROFOUND是应用质语分析得到的信息，搜索蛋白质序列的数据库公共在线工具。样品经过7BD-33-11A免疫沉淀水解后产生的特殊肽段在QSTAR(AppliedBiosystems,FosterCity5CA)上进行MS/MS分析。QSTAR安装了一个接口，因此能对前面经过PBSIIc阅读器分析的相同样斑进行分析。MS/MS数据然后进行MASCOT分析，MASCOT也是一个公共在线工具，它利用来源于MS/MS波谱的信息来查找蛋白质数据库。图5是从Profound搜索的结果。唯一能够显示做为候选蛋白，而又具有显著可信程度的是CD63。图6是从MASCOT搜索的结果。经过识别唯一可能性最大的蛋白是CD63，支持以前用肽图法检测确证的结果。3.免疫沉淀法确定7BD-33-11A抗原通过检测已知抗人CD63单抗(RFAC4和H5C6)能否与经过7BD-33-llA免疫沉淀识别的抗原产生活性反应，以确定7BD-33-11A假定抗原的存在，反之亦然。更进一步确认方法是通过用谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合的人CD63细胞外结构域部分转染诱导型或非诱导型细菌，对细胞溶解所得到的产物进行免疫印迹试验。MB-231细胞膜事先分别给予7BD-33-11A抗体、RFAC4(CymbusBiotechnologyLTD,Hants,UK)、H5C6(BDBiosciences,SanDiego，CA)、IgG2a和IgGj(BDBiosciences,SanDiego，CA)同种型对照处理，免疫沉淀后行IDSDS-PAGE，接下来进行免疫印迹试验。等量免疫复合物样品置于相同凝胶上进行分析。电转印转膜至PVDF膜，用7BD-33-11A单抗、RFAC4、H5C6以及IgG2a和IgGi同种型对照探针检测。图7a显示交叉免疫电泳试-睑，抗体7BD-33-11A和RFAC4分别进行免疫沉淀，继以免疫印迹试验。图7b显示交叉免疫电泳试验，抗体7BD-33-llA和H5C6分别进行免疫沉淀，继以免疫印迹试-验。这三种抗体和7BD-33-11A免疫沉淀反应识别的相似抗原存在交叉反应。此外，7BD-33-llA在Westernblot中也与RFAC4和H5C6经过免疫沉淀识别的相似抗原存在交叉反应，抗原分子量为20-80kDa,但是不能够和同种型对照抗体形成的免疫复合物产生交叉反应。同种型对照抗体探针检测样斑结果为完全阴性。这些数据说明7BD-33-11A抗体识别的表位包含于CD63抗原内。为了确定交叉反应的存在是否是由于抗体识别的是同种分子，或者是否是由于具有相似分子量的分子的相互作用的存在，研究人员提高了緩冲液的限制性(50mMTris,pH7.4，1%TritonX-100,不同浓度NaCl:0，150，500和2000mM;RIPA緩冲液内含500mMNaCl)，用7BD-33-11A进行免疫沉淀。结果得到的免疫复合物分别加入7BD-33-11A,H5C6和RFAC4以及IgG2a和IgG!同种型对照进行免疫印迹试验。图8显示在改变了免疫沉淀条件的限制性之后没有对免疫复合物的产生引起任何可以;险测到的影响，这也说明了7BD-33-11A抗体识别的分子也同样;陂抗CD63单抗识别，反之亦然。为了进一步确定7BD-33-11A直接结合于人CD63抗原，通过免疫印迹试验，利用大肠杆菌表达人CD63细胞外结构域(loopsEClandEC2)的重组融合肽，对大肠杆菌溶解产物进行免疫印迹试验，进一步评估抗体活性。为完成此工作，通过亚克隆合适的cDNA片,更加入细菌表达载体PGEX-4T-2(AmershamBiosciences,Piscataway,NJ)上，获得CD63细胞外环状结构域(loop1和loop2-EC1和EC2)分别和GST的融合片段。多聚合酶链反应(PCR)获得cDNA片段编码的环状结构，利用足够长度的人cDNA做为模板(cloneMGC-8339,AmericanTypeCultureCollectionManassas,VA)。cDNA编石马的EClloop通过下面PCR引物获得5'引物(ECl—5'),5'GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTGS'3'3'引物(ECl—3'),5'GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3'。cDNA编码的EC2loop通过下面PCR引物获得5'引物(EC2—5'),55'GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3'和3'引物(EC2—3'),5'TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3'。PCR反应条件如下2gL的5'引物(25pmol/jtiL),2/xL的3'引物(25pmol//xL)，0.2/iL的DNA模板(pOTB-CD63,0.76mg/mL),45.8uL的PCRSuperMixHighFidelity(Invitrogen，Burlington,ON)。PCR步骤如下94。C加热5分钟，然后对如下过程^故30个循环94。C解链30秒钟，55°C退火30秒钟，72。C拉伸1分钟。在亚克隆之后，只含有PGEX-4T-2载体的阴性对照组(其中不含有cDNA片段)，其结构成分被转移至大肠杆菌(BL-21株)。每次转化过程中只有抗氨千西林菌落能够生长，对各自插入的cDNAs进行测序。在确定cDNA序列的正确性后，每一克隆被移植到液体培养基中，力口入lmMIPTG(isopropyl画/3-D曙thiogalactopyranoside)(Gibco-BRL;Rockville,MD)诱导GST融合体的表达。孵育2小时，细菌培养物在室温下离心(2，000g)5分钟。弃去上清，细菌沉淀物在非还原性的SDS-PAGE緩冲液样品中煮沸。然后如前所述进行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺堆积胶和分离胶浓度分别为5%和12%)以及免疫印迹试验。样斑进行7BD-33-llA、H5C6、RFAC4和IgG2a同种型对照4笨针枱r测。图9显示研究结果为7BD-33-11A特异性识别人CD63的loop2(108-202位氨基酸)(泳道6)，不识别loop1(34-52位氨基酸)。这种抗体特异性识别细菌溶解物的观察进一步证明了两个已经定性的抗人CD63抗体(RFAC4和H5C6)也能够识别相似蛋白质，该蛋白质条带仅仅位于诱导的大肠杆菌溶解物所表达的EC2融合多肽区。上述全部结果均证明7BD-33-llA能识别并直接结合人CD63,抗原特异性识别区域位于细胞外108-202位氨基酸。实施例3如S.N.10/348,231中所述，根据布达佩斯条约，杂交瘤细胞7BD-33-11A被存放于美国标准培养收集所(AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209onJuanuary8,2003)，保藏编号为PTA-4890。依据37CFR1.808，存放者确保公众使用存放物的所有限制权不被取締，使用权属于被授予专利者。抗体生产7BD-33-11A单抗由CL-1000细颈瓶(BDBiosciences,Oakville,ON)培养的杂交瘤细胞产生，每周采集并重新接种两次。抗体经过标准抗体纯化过程进行纯化，纯化采用ProteinGSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,Baied'Urfe,QC)。如前美国专利10/348,231中所述，(表2)将7BD-33-llA与细胞毒试验阳性(抗Fas(EOS9.1,IgM，kappa,20ugs/mL,eBioscience，SanDiego，CA)、抗Her2/neu(IgGl，kappa，10ug/mL,InterMedico,Markham,ON)、抗EGFR(C225，IgGl,kappa，5ug/mL，Cedarlane，Hornby,ON)、环己酰亚胺(Cycloheximide)(100umol,Sigma,Oakville,ON)、NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))以及阴性对照相比较(107J(抗TNP，IgG!,kappa,20ug/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、G155-178(抗TNP，IgG2a,kappa,20ug/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、MPC画ll(抗原特异性未知，IgG2b，kappa,20ug/mL)、J606(抗果聚糖，IgG3，kappa，20ug/mL)和IgG緩冲液(2%))。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231),MDA-MB-468(MB-468)，MCF画7)、结肠癌(HT-29，SW1116,SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(OVCAR)、前列腺癌(PC-3)和非肿瘤细胞(CCD27sk,Hs888Lu)经过检测(全部来源于ATCC,Manassas,VA)。利用分子探针进行活体或者死亡细胞毒试验(Eugene,OR)。进行试验主要依据生产厂家指南，如有更改在此说明。试验之前按照预定密度铺细胞板。两天后，纯化抗体和对照均进行稀释，取100/iL加入细胞板，C02浓度5%孵育5天，翻转倒空细胞板，干燥样斑。取含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀释后的钙绿荧光素染色剂50gL,加入每一试-睑孔内，C02浓度5%,37。C孵育30分钟，翻转倒空细胞板，干燥样斑。室温下用多通道速挤瓶将含有MgC12和CaC12的DPBS加入到试验孔内，轻叩三次，翻转倒空平板，干燥样斑。荧光多孔板高效阅读器(Perkin-ElmerHTS7000fluorescenceplatereader)读取试验结果，获得的数据用MicrosoftExcel进行分析，结果见表1。数据代表了四组试验的均值，按照如下细胞毒性试验的界限三倍方法表示定量在细胞毒性程度方面，4/4试验(+++)，3/4试验(++)，2/4试验(+)。表l内未标志细胞代表结果矛盾或者细胞毒性小于界限值。试验证实了7BD-33-11A抗体对乳腺癌和前列腺癌细胞的选择性细胞毒性作用，而对于未转化的正常细胞无影响。试验证实了7BD-33-11A比抗Fas抗体阳性对照组对前列腺癌更强的杀伤活性。化学性细胞毒药物产生了预期的细胞毒作用，但是用于比较的许多诱导产生的其它抗体在提供限制条件的生物细胞试验中显示了预期的效果。总的来说，7BD-33-11A抗体似乎对许多肿瘤细胞类型均有细胞毒性。抗体在其活性方面的选择性在于不是所有的瘤细胞都有易感性。更进一步来说，抗体的功能特异性证据还在于它对非癌细胞产生不毒性作用，这在治疗中是很重要的因素。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>用流式细胞仪(flowcytometry,FACS)检测将7BD-33-11A结合于上述肿瘤组织细胞以及正常细胞或者其他另外的肿瘤细i包结肠(LOVO)、胰腺(BxPC-3)、卵巢(ES-2，OCC-I)和前列腺(DU-145)以及下述其他正常细力包(CCD-112)。细胞经过流式细胞仪前，首先要经过DPBS(不含€&++and]\^++)洗涤细胞单层。然后加入细胞解离緩冲液(INVITROGEN,Burlington,ON),37°C使细胞从培养板上脱离。离心并采集细l包，然后置入Dulbecco'sphosphatebufferedsaline，内含MgCl2,CaCl2再悬浮，2%和25%FBS(fetalbovineserum),4°C洗脱并计数，分散成细胞密度适合的细胞簇，接下来在染色剂(DPBS,内含MgCl2和CaCl2+/-2%FBS)中再悬浮，加入20jwg/mL7BD-33-llA或者对照抗体(同种型对照或抗EGFR)水面上放置30分钟。在加入AlexaFluor488-结合次级抗体之前，细胞用洗脱液进行洗涤。然后加入含有AlexaFluor488结合次级抗体的染色液保留20-30分钟。最后一次洗涤细胞，染色液中再悬浮，该染色液中含有1/xg/mL碘化丙啶(propidiumiodide)和1.5%多聚曱醛，(paraformaldehyde)。样品通过流式细胞^U企测获得的细J包流计凄t应用CellQuestsoftware(BDBiosciences)分析。细胞前向运动(FSC)和侧向分散(SSC)通过调整FSC和SSC探测器上的电压振幅决定。三个荧光通道的探测器(FL1、FL2和FL3)的调整是通过让经过纯化的同种型对照抗体染色的细胞和AlexaFluor488结合次级抗体先后流过，这些细胞具有相同的峰值和约l-5u的中位荧光强度。细胞流经FSC后即可获得所需的活性细胞和石典化丙咬排除物(propidiumiodideexclusion)(^皮采用时)。每一份样品，需要约10,000活性细胞进行分析，结果见表2。表2显示了在同种型对照基础上平均荧光强度倍增特点，定性表示为<5(-);5to50(+);50tol00(++);>100(+++)，括号内为细月包染色的百分比。图9为具有代表性的7BD-33-llA组织学图像。7BD-33-llA在如下肿瘤细胞结合特点相似乳腺癌(MB-231和MCF-7)、结肠癌(HT-29,SW1116和SW520)、肺癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌(PC-3);但在另一种乳腺癌(MB-468)、结肠癌(LOVO)和前列腺癌(DU-145)中结合特点不同。7BD-33-llA还能结合于非肺瘤细胞，但是这种结合不产生细胞毒性。这进一步证明了抗体与其抗原配体的结合并不一定是提示预后的因素，这是不明显的发现。这表明抗体在不同细胞上的不同配体是决定细胞毒性的因素，而不是抗体结合本身。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例4正常人体组织染色免疫组化染色法曾用于了解7BD-33-11A抗原在人体的分布(S.N.10/603,006)。目前研究比较了7BD-33-llA和另外两个抗CD63抗体(RFAC4和H5C6)的分布特点，在前面通过生物化学方法进行的研究中证实7BD-33-11A抗原是CD63。把抗体与来源于人体正常器官组织语(Clinomics,Watervliet,NY)的24例正常人组织结合。任意单位抗体(7BD-33-l1A;RFAC4(CymbusBiotechnologyLtd.,Hants,UK)和H5C6抗CD63(BDPharMingen,Oakville，ON);鼠IgGi阴性对照(Dako，Toronto,ON))置于抗体稀释缓冲液(Dako，Toronto,ON)中稀释至浓度5/ig/ml，此浓度为经过前述试验步骤后被认为是最佳浓度。阴性对照组抗体经过生产者验证对哺乳动物组织结合试验均为阴性。免疫组化染色步骤如下25例组织切片先经烤箱58。C去石蜡化1小时，然后将标本浸入二曱苯染色缸内5次脱蜡，每次4分钟。接下来依次通过系列浓度梯度乙醇(100%-75%)冲洗切片进行再次水化。将玻片浸入pH6的10mM柠檬酸緩沖液(Dako,Toronto,Ontario),然后以微波烘烤，高、中和低火条件下各5分钟，最后浸入冷PBS液中。取出玻片放入3%过氧化氢溶液内，6分钟后用PBS洗涤三次，每次5分钟，干燥，置常用封闭緩冲液(Dako,Toronto,Ontario)中孵育，室温下5分钟。7BD-33-llA、鼠抗CD63单抗(CymbusBiotechnologyLtd.,Hants,UKorDako,Toronto,Ontario)或者同种型对照抗体(针对黑曲霉素葡糖氧化酶，该酶在哺乳动物体内既不表达也不能通过诱导产生；Dako,Toronto,Ontario)在抗体稀释緩沖液中均稀释至5/ig/mL，室温下放置1小时后孵育过夜。然后用PBS液洗涤玻片三次，每次5分钟。接下来加入HRP结合的次级抗体(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario),室温下30分钟，以4企测或观察原始抗体的免疫活性。继续加入DAB(3，3'-diaminobenzidinetetrahydrachloride,Dako,Toronto,Ontario)显色底物进行免疫过氧化酶染色，室温下放置10分钟。Meyer's苏木精(SigmaDiagnostics,Oakville,ON)对比染色，继以梯度乙醇(75-100%)进行脱水处理，二曱苯洗涤。加封固剂后以盖玻片覆盖，置Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)显微镜下观察，获得数字影像，利用NorthernEclipseImagingSoftware(Mississauga,ON)进行存储。其结果由病理医生进4亍读取、评分和i兌明。表3是对7BD-33-llA、RFAC4和H5C6抗CD63抗体正常组织染色试验图谱结果的总结。7BD-33-UA的染色结果和前面所描述的相类似(S.N.10/603,006)。需要再次指出的是7BD-33-llA除了与浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞结合外，还限制性的结合于不同类型细胞。RFAC4和H5C6抗体的染色图像结果相似。但是两者的染色结果和7BD-33-11A完全不同。特别的，两者能够与更广泛的正常组织结合，在7BD-33-11A染色同样为阳性的区域，RFAC4和H5C6染色通常更强，且不仅与浸润巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞结合，还可与大部分组织上皮细胞结合(图11)。7BD-33-11A染色阳性的组织RFAC4和H5C6抗CD63抗体染色也为阳性(往往前者强度较后两者弱)。7BD-33-11A阴性的组织则RFAC4和H5C6抗CD63抗体染色则通常并非也为阴性。这些结果i正明7BD-33-11A识别的组织仅^f叉是RFAC4和H5C6识别组织中的一'J、部分，在这些组织中，7BD-33-llA染色的强度通常较弱。这些结果也表明了7BD-33-11A结合的抗原并不是广泛表达在正常组织上的，而是特异性的存在于人体部分组织中。这些结果同样支持关于7BD-33-11A直接结合于CD63表位的生物化学试-验证据，即-使其识别的表位与RFAC4和H5C6所识别的用于这些免疫组化染色的CD63表位完全不同。表3RFAC4和H5C6抗CD63抗体与7BD-33-11A在人体正常组织IHC结果比较<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>实施例5人体乳腺癌组织染色应用免疫组化染色以确定肿瘤和7BD-33-11A抗原的关系，以及是否7BD-33-11A抗体能够识别肺瘤(S.N.10/603,006)。目前对RFAC4和H5C6抗CD63抗体，c-erbB-2抗Her2抗体进行了比较。乳腺癌组织样品来源于50例乳腺癌患者，10例样品来源于乳腺癌患者非肿瘤乳腺组织(ImgenexCorporation,SanDiego，CA)。收集每个患者如下信息年龄、性别、AJCC(AmericanJointCommitteeonCancer)肿瘤分期、淋巴结、雌激素受体以及黄体酮受体数据资料。按照例4中介绍的步骤进行免疫组化染色。稀释任意单位抗体至5/xg/mL,抗Her2抗体稀释至1.5jiig/mL。表4、表5、表6和表7列出了7BD-33-llA、RFAC4和H5C6抗CD63抗体乳腺癌组织染色的结果。总的来说，50例标本中7BD-33-11A染色阳性占36%,RFAC4和H5C6抗CD63抗体分别为85%和94%，在7BD-33-llA和RFAC4或H5C6染色均为阳性的组织，97%的样品对RFAC4和H5C6比7BD-33-11A染色强(图12)。在乳腺癌患者的正常乳腺组织染色中，7BD-33-11A(0/10)，RFAC4和H5C6抗CD63抗体(7/8,2份样品表现不典型)染色阳性。在雌激素和黄体酮受体表达与7BD-33-11A抗原表达之间存在轻孩i相关性；任何一种受体表达阳性的组织7BD-33-11A表达均轻度增高。根据肿瘤分期和进展程度进行分析，结果显示随肿瘤分期增高7BD-33-11A有染色增强的趋势。RFAC4存在类似的结果。H5C6也显示出和雌激素和黄体酮受体表达的很轻微的相关关系，但是和肿瘤分期之间没有明确相关。但是对于三种抗体来说，检测结果均受到样本量的限制。表4:人体乳腺癌7BD-33-11A免疫组化染色结果<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表5:人体乳腺癌RFAC4免疫组化染色结果结合分数<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表6:人体乳腺癌H5C6免疫组化染色结果<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>7BD-33-llA对肿瘤细胞特异性染色阳性，正常细月包染色阴性。细胞染色图像定位发现7BD-33-11A抗原位于细胞膜和胞浆内。抗CD63抗体RFAC4和H5C6在肿瘤组织细胞的染色也呈现相似的结果。另外，这两种抗体在正常乳^i且织标本染色也为阳性，但7BD-33-11A染色为阴性。与c-erbB-2比较，7BD-33-11A显示出完全不同的染色图像，18例7BD-33-llA染色阳性的标本中9例Her2表达阴性，这提示肿瘤患者靶向治疗的需要并没有得到完全满足(表8,图13)。即使7BD-33-11A和Her2染色均阳性的乳腺癌肺瘤组织切片，在染色强度方面两者也存在不同；一些乳腺癌组织切片7BD-33-llA显示强阳性，但Her2仅为弱阳性，这反过来说明7BD-33-11A能够特异性靶向治疗不同乳腺癌肿瘤患者。c-erbB-2抗体在一例正常乳腺组织切片染色也呈阳性。这些结果表明了7BD-33-llA抗原大约在2/3的乳腺癌患者表达，其中有一半患者Her2完全阴性。染色结果表明在患者样品中，抗体能与恶性细胞特异性结合，7BD-33-llA抗原在细胞膜上表达，因此成为具有吸引力的药物治疗靶点。尽管7BD-33-llA与RFAC4或H5C6抗-CD63抗体比较，7BD-33-11A染色具有更多局限性，但再次证明7BD-33-llA抗原表位是CD63上更局限的表位可能性。表7:人体乳腺癌和正常乳腺组织RFAC4和H5C6抗CD63与7BD-33-11A的免疫组化染色结果数据RFAC4H5C67BD-33-11A<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>注NR:样品不具有代表性；F:切片标本有折叠表8:人体乳腺肺瘤和正常乳腺组织中c-erbB-2抗Her2与7BD-33-11A免疫组化染色结果<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>实施例6人体前列腺组织染色为了确定7BD-33-11A是否表达于除乳腺癌之外的其它人体肿瘤，使用7BD-33-llA(S.N.10/603,006;Imgenex,SanDiego,CA)探针对多种人体肿瘤组织进行检测。在进一步研究中，7BD-33-llA在人体前列腺癌中的染色图^f象已经确定(ImgenexCorporation,SanDiego，CA)。染色步骤见例4。抗体浓度为5pg/mL。如表9所示，88%人体前列腺癌7BD-33-11A染色阳性。尽管7BD-33-llA在正常组织切片染色也呈强阳性，但是和正常组织相比，肿瘤组织标本中细另包膜染色更强。一例胚胎^t紋月几肉瘤7BD-33-11A染色为阴性。在肿瘤的分期与7BD-33-11A抗原表达之间未发现直接相关关系。但是这些结果同样受到样本量小的影响。7BD-33-llA在前45列腺癌组织样品中的着色部位仍旧为细胞膜上和细胞浆内。与乳腺癌组织样品比较，7BD-33-llA在前列腺癌组织细胞膜染色强度有所增加(图14)。对于正常前列腺组织标本来说，并没有观察到这种细胞膜染色强度的增加。表9:人体前列腺癌7BD-33-11A免疫组化染色结果<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>%因此，7BD-33-llA抗原不仅表达于乳腺癌细胞膜上，也同样表达于前列腺癌细胞膜上。这些结果说明了7BD-33-11A对于除乳腺癌之外其它肿瘤类型也可做为潜在的治疗药物。有大量证据说明7BD-33-11A介导的抗肿瘤作用是通过其和变化的CD63构象型表位相结合完成的。在例2中已经i兌明7BD-33-11A抗体能够用于从表达抗原的细胞如MDA-MB-231免疫沉淀其所连接的抗原。进一步，利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术，能够显示7BD-33-llA检测到的CD63上特异性结合于抗体的抗原部分。因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能够抑制利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术所显示的7BD-33-11A结合于该类细月包及组织的作用。所以与7BD-33-llA—样，其它抗CD63抗体也能够通过免疫沉淀技术分离CD63抗原的其它构型，应用同样的试验方法，抗原也能够用于抑制其它抗体与表达同种抗原的细胞或纟且织结合。实施例7体内MDA-MB-231肿瘤预防性抗体剂量反应试验参考图15和图16的结果，挑选6到8周的雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植500万MDA-MB-231人体乳腺癌细胞。肿瘤细胞放在100/iL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。所有小鼠随机分成4组，每组10只。肿瘤细胞种植后当天腹腔内分别注射0.2,2.0或20mg/kg7BD-33-11A,以及20mg/kglgG同种型对照抗体，抗体固体凝集物均经稀释液(2.7mMKC1,1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀释至300/xL。每周重复注射一次。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径直到有小鼠到达CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。在治疗终点(第55天)，0.2mg/kg治疗组小鼠肿瘤体积是同种型对照组的15%。经过配对t检-睑，其体积和对照组比4交体积减小85%，具有显著性差异(pO.OOOl)。2.0或20mg/kg治疗组小鼠在治疗终点时仍无肿瘤生长。这种趋势持续到超过治疗期后。使用7BD-33-11A抗体治疗，在不同的剂量组，和对照组相比均使小鼠生存期延长。对照组小鼠于试验第104天(给药后第54天)全部死亡。与之相反，0.2mg/kg治疗组则一直存活至第197天(给药后第147天)，2.0mg/kg治疗组中50%小鼠直到第290天仍旧存活(给药后第240天)，此时20mg/kg治疗组全部存活。因此三种不同剂量7BD-33-11A治疗后，均明显减少了肿瘤负荷，和同种型对照抗体组比较，延长了小鼠生存期。最高剂量治疗组显示出对肿瘤生长最大抑制效果(100%)和对生存期的最大延长(无死亡小鼠)。所以，7BD-33-llA是一种潜在的抗肿瘤抗体，其药理和药效学方面的好处表明该抗体可用于治疗包括人在内的哺乳动物肿瘤性疾病。实施例8体内MDA-MB-231肿瘤联合化疗试验参照图17和图18，挑选6到8周雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植500万MDA-MB-231人体乳腺癌细胞，肿瘤细胞放在100/iL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径。于第41天，大多数小鼠肿瘤体积达到100mm3(48-122mm3)，经过种植的8只小鼠被随机分成4个治疗组。7BD-33-llA抗体，顺铂(化疗药)，7BD-33-11A和顺铂，以及緩冲液对照，分别经小鼠腹腔注射入体内，其中7BD-33-l1A和顺铂浓度分别为10mg/kg和9mg/kg。抗体固体凝集物及顺柏均经过稀释液(2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀释至300/iL。7BD-33-11A或緩沖液每周注射三次，在种植后第64天总量为10剂，。分别于第1、3和9天注射顺铂。每七天使用测径器测量肿瘤直径直到种植后第125天或者是有小鼠达到CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。研究结束根据CCAC指南对所有小鼠实行安乐死。应用配对t检验，7BD-33-llA、顺铂以及两者联合治疗后肿瘤负荷均减少(图16)。试验第69天(给药后第5天)，三个组和緩沖液对照组比较均显示肿瘤体积缩小，三组分别为对照组的76%(p<0.001)、79%^<0.001)和86%(p<0.001)。体重用于评价小鼠生存状态。尽管顺柏和7BD-33-11A显示相似的肿瘤抑制作用，但是在体重下降程度方面，两者并不相同。7BD-33-llA和緩沖液对照组比较在各时间观测点上体重并无明显差别，事实上，两组在治疗阶段体重均有轻微增加。与之相反，顺铂治疗组小鼠出现体重下降，且在最后一次药物注射后更为明显。在种植后第55天，即最后一次注射顺铂后第4天，顺铂治疗组显示体重下降24-30%。由此，在一个公认的人体乳腺癌模型中7BD-33-11A和顺铂治疗组与緩沖液对照组比较前两者均能够减少肿瘤负荷。但7BD-33-11A治疗组和顺铂治疗组小鼠在体重比较后显示前者具有更好的生存状态。这些结果显示了7BD-33-11A抗体对于包括人在内的哺乳动物肿瘤治疗的药理学、药效学以及生活质量方面的好处。实施例9体内MDA-MB-468肺瘤联合化疗试验参照图19和图20，挑选6到8周雌性重症联合免疫缺陷小鼠，种植200万MDA-MB-468人体乳腺癌细胞。肿瘤细胞放在lOOjtiL盐水中于小鼠颈部经皮下注射入体内。使用测径器每七天测量一次肿瘤直径。当大多数小鼠肺瘤体积达到100mm3(11-119mm"时，种植后第27天将8只小鼠随冲几分成4组，分别将7BD-33-11A抗体、顺铂、7BD-33-11A和顺柏，以及緩冲液对照经小鼠腹腔注射入小鼠体内，7BD-33-11A与顺铂浓度分别为10mg/kg和6mg/kg。抗体固体凝集物和顺柏均经稀释液(2.7mMKC1,1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04)稀释为300jtiL。7BD-33-11A和緩沖液对照第一周注射四次，然后每周注射三次，在种植后第50天达到总量11剂。分别于第1、6、11和16天注射顺铂。每七天使用测径器测量肿瘤直径，直到种植后第66天或者是有小鼠达到CCAC终点。研究过程中记录小鼠体重。研究结束根据CCAC指南对所有小鼠实行安乐死。应用配对t检验，7BD-33-llA、顺铂以及两者联合治疗后肿瘤负荷均减少(图18)。试验第55天(给药后第5天)，三个组和緩冲液对照组比较均显示肿瘤体积缩小，三组分别为对照组的37%(p<0.3958)、950/。(pO.024)和97%(p<0.017)。体重用于评价小鼠的生存状态。尽管顺铂和7BD-33-11A在很大程度上显示了相似的肿瘤抑制作用，但是在体重下降程度方面，两者并不相同。7BD-33-llA和緩冲液对照组比较在各时间观测点上体重并无明显差别，事实上，两组在治疗阶段体重均有轻微增加。与之相反，顺铂治疗组出现体重下降，且在最后一次注射后更为明显。在种植后第48天，即最后一次注射顺铂后第4天，顺铂治疗组显示体重下降20%。由此，在另一个公认的人体乳腺癌模型中7BD-33-11A和顺柏治疗组和緩沖液对照组比较前两者均能够减少肿瘤负荷。但是7BD-33-11A治疗组和顺铂组动物在体重比较提示前者有更好的生存状态。总的来说，在多种人肿瘤模型的试验结果中7BD-33-11A具有显著有益作用(延长生存期，和对照组比较能减轻肿瘤负荷，和化疗药比较更好的耐受性)。这些结果显示了7BD-33-11A抗体对于包括人在内的哺乳动物肿瘤治疗的药理学、药效学以及生活治疗方面的好处。大量的证据表明7BD-33-11A通过结合CD63的细胞外loop2介导抗肿瘤作用。例2中表明7BD-33-11A能用于免疫沉淀MDA-MB-231细胞表达的结合抗原。进一步应用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术，能够显示7BD-33-11A所;险测的CD63上表达的特异性结合于抗体的抗原部分。因此，免疫沉淀7BD-33-11A抗原后能够抑制利用流式细胞仪、细胞酶联免疫吸附试验和免疫组化染色技术显示的7BD-33-11A结合于该类细月包或组织作用。所以和7BD-33-11A—样，其它抗CD63抗体也能够应用免疫沉淀技术分离CD63抗原的其它构型，应用同样的试验方法，抗原也能够用于抑制其它抗体结合于表达同种抗原的细胞或组织。本专利说明书中任何专利和专利申请都提示了该项发明所属的专业技术水平。在此所引用的全部专利和专利申请做为整体用于参考时和单个明确的专利相同。人们可以理解，当解释某一发明时，不受到这里描述和显示的特别形式和安排部分的限制。对于那些在这方面的专业人员来说，虽然有不同的变化但是均不会离开该发明的范围；本发明也不仅仅局限于在此专利说明范围内。一个专业人员很容易理解目前这项发明易于施行，并且获得上述好处和结果，这是其本身所固有的特点。任何在此提到的寡核苷酸、肽、多肽、生物相关复合物、方法、步骤和技术都是目前所推荐的最具代表性的，具有可重复性，不仅局限于本发明范之前他们需要理解本发明的主旨，这些改变均定义在附加声明内。尽管本文前面描述本发明被特别优先收录，但是人们应该能够理解，如权利要求中所讲，本发明并不过分局限于该特别收录。事实上对于专业人员来说，明显的对于前文所介绍的用于进行本发明研究的各种模型的多种调整都在下面权利要求范围内。权利要求1.抗肿瘤抗体或其片段在制备治疗患者肿瘤的药物中的用途，所述抗体或其片段的特点是具有对肿瘤细胞的细胞毒作用，本质上对非肿瘤细胞是良性的；其中所述抗体或其片段能够与其在药理上能接受的佐剂制成混和制剂；所述抗体做为分离的单抗或者是抗原结合片段能够结合在肿瘤组织表达的抗原部分上，该部分特点是能被具有明确特性的抗体识别，这种抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆所编码的。2.如权利要求l所述的用途，其中所述抗体或其片段为人源化或嵌合型。3.如权利要求l所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自毒素、酶、放射性化合物以及血细胞中的成员相结合，从而形成抗体结合物；以及；其中所述抗体或其片段结合物能够和药理上能接受的佐剂制成混和制剂。4.如权利要求3所述的用途，所述的抗体或其片段为人源化或嵌合型。5.如权利要求l所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性指抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用。6.如权利要求l所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性指的是补体依赖的细胞毒性作用。7.如权利要求1所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性是通过催化水解细胞化学键而介导。8.如权利要求l所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性是通过对肿瘤细胞上公认的抗原产生免疫反应而介导。9.如权利要求l所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性是通过干扰细胞膜表面的膜蛋白功能而介导。10.如权利要求l所述的用途，其中抗体或其片段的细胞毒性是通过产生细胞内蛋白构象改变启动细胞死亡信号而介导。11.抗肿瘤抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗患者肿瘤的药物中的用途，其中所述抗体或其片段的特性是具有对肿瘤细胞的细胞毒作用，对非肿瘤细胞具有良性作用；其中所述抗体是分离的由储存于ATCC的PTA-4890克隆所编码的单抗或其抗原结合片段，该抗体与药理上能够接受的佐剂制成混和制剂。12.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段为人源化或者嵌合型。13.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自毒素、酶、放射性化合物以及血细胞的成员形成抗体结合物；以及其中所述结合的抗体与药理上能够接受的佐剂制成混和制剂。14.如权利要求11所述的用途，/人所述亚类中选择的所述抗体或其片段为人源化或者嵌合型。15.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性指的是抗体依赖细胞介导的细胞毒性作用。16.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性指的是补体依赖的细胞毒性作用。17.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性是通过催化水解细胞化学键而介导。18.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性是通过对肿瘤细胞上公认的抗原产生免疫反应而介导。19.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性是通过干扰细胞膜表面的膜蛋白功能而介导。20.如权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段的细胞毒性是通过产生细胞内蛋白构象改变启动细胞死亡信号而介导。cd63抗原部分的人体肿瘤细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述抗体或其抗原结合片段是分离的单抗或其抗原结合片段，能够与所述的被表达的CD63抗原部分结合，所述抗原部分的特征是它被具有单抗识别特性并由ATCC保藏编号为PTA-4890的克隆编码的抗体所结合，从而细胞毒的发生是该结合的结果。21.<image>imageseeoriginaldocumentpage5</image>22.如权利要求21所述的用途，所述的分离的抗体或其抗原结合片段为人源化或者嵌合型。23.如权利要求21所述的用途，所述的分离的抗体或其抗原结合片段与细胞毒素、酶合放射性化合物以及血细胞结合，由此可形成抗体结合物。24.如权利要求21所述的用途，所述的分离的抗体或其抗原结合片段为人源化或嵌合型。25.如权利要求21所述的用途，所述的分离的抗体或其抗原结合片段为鼠源型。26.如权利要求21所述的用途，所述的人体肿瘤选自结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌。27.确定表达CD63抗原部分的细胞的存在的结合测定，所述CD63抗原部分与分离的单抗或其抗原结合片段结合，所述抗体由ATCC保藏编号为PTA-4890的克隆所编码，包括提供细胞样品；提供分离的单抗或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是与所述表达的CD63抗原部分相结合的分离的单抗或其抗原结合片段，该抗体具有单抗的识别特性并由ATCC保藏编号为PTA-4890的克隆所编码；将所述分离的单抗或其抗原结合片段与所述细胞样品相接触；以及确定所述分离的单抗或其抗原结合片断与所述细胞样品的结合；从而确定表达与所述分离的单抗或其抗原结合片段特异性结合的CD63抗原部分的细胞的存在。28.如权利要求27中所述的结合测定，所述的细胞样品是从患有结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的患者肿瘤组织中获得。29.分离的单抗或其抗原结合片段在制备用于确定细胞存在的结合测定的试剂中的用途，所述细胞为表达CD63抗原部分的细胞，所述CD63抗原部分与所述分离的单抗或其抗原结合片段结合，所述抗体由ATCC保藏编号为PTA-4890的克隆所编码。30.如权利要求29所述的结合测定，所述的细胞来自结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的肿瘤组织。31.从表达CD63抗原部分的样品中分离或者篩选能够特异性结合分离的单抗或者抗原结合片段的细胞的分离或者筛选方法，其中所述的抗原部分特性是能够被被抗体识别，而此抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的，该方法包括提供细胞样品；提供分离的单抗或者抗原结合片段，并且能够和上述表达的CD63抗原部分结合，该抗原部分的特性是能够被抗体识别，而此抗体是由储存在ATCC的PTA-4890克隆编码的；分离的单抗或者抗原结合片段和上述细胞样品相互作用；确定上述分离的单抗或者抗原结合片段和上述细胞样品相互作用；由此，CD63抗原部分能够特异性结合于储存在ATCC的PTA-4890克隆所编码的分离的单抗或者抗原结合片段，这样就能明确细胞样品中能够表达该CD63抗原部分的细胞。32.如权利要求31所述的方法，所述的细胞样品是从患有包括结肠癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌或者乳腺癌的肿瘤患者肿瘤组织中获得.33.单抗或其抗原结合片段在制备通过治疗哺乳动物体内人体肺瘤来延长生存期和/或延緩疾病进展的药物中的用途，其中所述肿瘤表达特异性结合于单抗或其抗原结合片段的抗原，所述抗体或其抗原结合片段具有储存在ATCC的PTA-4890克隆所编码的单抗的识别特性。34.如权利要求33所述的用途，所述的抗体与细胞毒性部分相结合。35.如权利要求33所述的用途，所述的细胞毒性部分是指放射性表位。36.如权利要求33所述的用途，所述的抗体能激活补体。37.如权利要求33所述的用途，所述的抗体能介导抗体依赖的细胞毒性作用。38.如权利要求33所述的用途，所述的抗体为鼠源型抗体。39.如权利要求33所述的用途，所述的抗体为人源化抗体。40.如权利要求33所述的用途，所述的抗体为嵌合型抗体。全文摘要本发明涉及应用肿瘤性疾病可修饰性抗体(CDMAB)7BD-33-11A治疗人体肿瘤，以及分离和确定表达CD63抗原部分的肿瘤细胞。能与该抗原部分结合的7BD-33-11A单抗(ATCC登录号PTA-4890)对表达CD63抗原部分的细胞具有细胞毒性作用。7BD-33-11A单抗能够有助于延缓人体肿瘤的进展。文档编号C07K16/28GK101214376SQ200710308360公开日2008年7月9日申请日期2005年3月23日优先权日2004年3月26日发明者大卫·S·F·杨,海伦·P·芬德利,苏姗·E·哈恩,路易斯·A·G·唐克鲁兹申请人:阿里乌斯研究公司