专利名称：Light-介导的抗细胞增殖组合物及方法
技术领域：
本发明涉及LTbeta受体激动剂(例如,LIGHT, p30多肽), 以及治疗不良的或异4立的细月包增殖或高度增殖疾病(例如肿瘤、癌 症、瘤形成(neoplasia)和恶性肿瘤)的方法。本发明还涉及LIGHT (p3(:)多肽)的形成，该LIGHT (p30多肽)相对天然野生型LIGHT (p30 多肽)改变了亲和性，例如对LTbeta受体或HVEM具有增加的或更 大的亲和,性或亲和力，或对Decoy受体3 (DcR3)具有减少的或更小的结合亲和性或亲和力。
技术背景月中瘤坏死因子超家族成员LIGHT (TNFSF-14)是针对淋巴毒素 -P受体(LTpR)、疱疹病毒侵入介体(HVEM)和decoy受体-3 (DcR3)(在人体内由人癌症细胞表达的分子)的配体。膜结合形式的LIGHT还可调节HVEM激活抑制性受体BTLA ( B和T淋巴细胞 衰)咸子)的肯fe力(Cheung,等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 13218 (2005); Compaan,等人J Biol Chem 280:39553 (2005); Gonzalez, 等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 1116 (2005);以及Sedy，等人， Nat. Immunol. 6:90 (2005))。 LIGHT最-近—皮揭示为介导4元月中瘤应答的 细胞因子。LIGHT通过其结合LT卩R、 HVEM和DcR3的能力，成为一种 独特的免疫治疗分子。LT(3受体可调节多个能在发炎的组织和区域 帮J力纟且织、淋巴纟田月包的基因(Ware， CF, Annu Rev Immunol. 23:787 (2005))。例如，LTpR调节如CCL21等多种趋化因子的表达(Cyster, J. G. Annu Rev Immunol. 23: 127 (2005);和Dejardin,等人，Immunity 17:525 (2002))。CCL21和相关的趋化因子对于在造血、感染时将原态(naive)T 淋巴细胞运输进入淋巴组织，或许运输进入肿瘤环境 一 夂常重要。 LT卩R还可用作向T细胞呈现抗原的淋巴组织中树突细胞的重要的 生长调节剂(Kabashima，等人，Immunity 22:439 (2005))。 LIGHT与 HVEM在T细胞上的相互作用提供了 T细胞激活、扩增和分化成 为肿瘤特异性细胞毒性T细胞(CTL)的共刺激信号。DcR3可有效地 免争LIGHT与其信号转导受体LT卩R或HVEM的结合。最近的研 究才艮导了膜结合的LIGHT抑制HVEM和BTLA之间的结合 (Cheung,等人Proc Natl Acad Sci USA 102: 13218 (2005))。因此， LIGI IT的三重功能性使其成为独特的增强免疫性的分子。发明相无述本发明提供了具有依附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体 激动剂的细胞。在一个实施方式中，该LTbeta受体激动剂包括LIGHT (p30多肽)、LTalphal beta2 、 LTalpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受体杰t体。在另 一实施方式中，LTbeta受体激动剂包含了嵌合蛋白， 该嵌合蛋白的一部分包含与细胞膜(例如，膜上存在的分子)结合 的结合蛋白，例如配体、受体、抗体或抗体子序列。其膜可依附、结合或偶联LTbeta受体激动剂的细胞包括不良 的、异常的或异位的细胞，例如高度增殖细胞(例如，肿瘤细胞、 癌症细胞、恶性细胞、新生细月包和转移性细胞)和病原体感染的细 胞。其膜可依附、结合或偶联LTbeta受体激动剂的细胞包括真核细 月包(例如，哺乳动物，如人的纟田胞)，该细胞可以是死细胞或活细 胞。其膜可依附、结合或偶联LTbeta受体激动剂的细胞还包括表 达抗原的细胞。在特定的实施方式中，细胞表达选自如下的抗原 肿瘤细胞或癌细胞抗原，恶性细胞、新生细胞或转移性细胞抗原， 病毒4元原，细菌^t原，真菌4元原或寄生虫抗原。在特定的实施方式中，可依附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta 受体激动剂并非由细胞中编码该LTbeta受体激动剂的核酸表达得 到。在另一实施方式中，当LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式是 依附、结合或偶l笑至细胞膜的LTbeta受体激动剂时，该LIGHT (p3() 多肽)变体或多形态形式可从编石马该LIGHT (p30多肽)变体或多形 态形式的细胞核酸表达得到。在附加的实施方式中，LTbeta受体激动剂^农附、结合或偶耳关至 存在于细胞膜上的分子(例如，多肽，如抗体，或者石灰水化合物)。 LTbeta受体激动剂与细胞膜的依附、结合或偶联可由共价或非共价 键介导，例如，通过交耳关介导。LTbeta受体^L动剂通过如下方式^衣 附、纟吉合或偶联至细胞膜LTbeta受体激动剂与中间体分子共价或非共价结合，其中该中间体分子随后共价或非共1"介结合至细月包膜上 的分子。在特定的方面，中间体分子包含第一部分和第二部分，例 如，第一部分为生物素或生物素A'f生物，第二部分为亲和素、中性亲和素或链霉亲和素或其书1"生物或-氬基酸变体LTbeta受体漠丈动剂包才舌哺乳动物(例^。，人)形式。LTbeta 受体激动剂可以是全长天然序列，例如LIGHT (p30多肽)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受体抗体的全长序列，或 者其保留了至少部分LTbeta受体激动剂或结合活性的子序列。在特 定的实施方式中，子序列包含LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: l所示的LIGHT ),可溶形式的LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 2所示的LIGHT )或者包含LIGHTt66 (例如，SEQ ID NO: 2 所示的LIGHT t66 )的LIGHT (p30多肽)的胞外氨基酸序列。LTbeta受体激动剂包括变体和多形态形式，例如LIGHT (p30 多肽)、I」Todphal beta2 、 LTalpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受体抗体 的变体和多形态形式，或者其保留了至少部分LTbeta受体激动剂或 结合活性的变体或多形态形式的子序列。在特定的实施方式中， LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式相比天然的野生型LIGHT (p30 多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )对DcR3 (Decoy受体3)的亲和性或 亲和力减少或较低，LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式相比天然 的野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )对LT卩R或 HVEM的亲和性或亲和力更高或增加；且LIGHT (p30多肽)变体和 多形态形式相比天然的野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )对LT卩R或HVEM的亲和性或亲和力更高或增加并.对DcR3 (Decoy受体3)的亲和性或亲和力减少或4K氐。在更具体的实施方式 中，LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式包含了选自SEQIDNOs:3 至10任意 一 个的氨基酸序列。本发明还^是供了促进、刺激、诱导或增加针对高度增殖细胞、 月中瘤纟田胞、癌细胞或转移性细胞、或病原体感染细月包的免疫性的方 法。在一个实施方式中，该方法包括向对象施用一定量的具有依附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂的细胞，其中该LTbeta 受体激动剂可有效促进、刺激、诱导或增加该对象4十对高度增殖细 胞、肿瘤细胞、癌细胞、转移性细胞或病原体感染细胞的免疫性。本发明还提供了治疗对象的不良的或是异常的高度增殖细胞、 肿瘤细月包、癌细胞、新生细月包或转-移性细月包、或病原体感染的细 月包的方法。在一个实施方式中，该方法包4舌向对象一定量的具有^f衣 附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂的细胞，其中该 LTbeta受体激动剂可有效治疗对象的不良的或是异常的高度增殖 细月包、月中瘤纟田月包、癌细月包、新生细月包或寿争移性细月包、或病原体感 染的细月包。适用于该方法的细胞包括其中的受体激动剂为LIGHT (p30多 肽)、LIGHT (p30多肽)嵌合体、LIGHT (p30多肽)变体或多形态形 式、Ltalphalbeta2、 LTodpha2 betal 、 Ltbeta以及Ltbeta受体4元体或 抗体子序列的细胞。膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的 细胞包括LTbeta受体激动剂不由细月包内核酸表达得到的细月包。对于 1」GHT (p3()多肽)变体或多形态形式是依附、结合或偶联至细胞膜 的细胞，该LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式可^人编码该LIGHT (p3()多肽)变体或多形态形式的细胞核酸表达得到。细胞包括真核 细月包(例如，哺乳动物，例如人的细月包)，该细月包可以是死纟田月包或 活纟田月包。适用于该方法的I....Tbeta受体激动剂包括UGHT (p30多肽)、 LIGHT (p3()多肽)嵌合体、LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式、 Llalphalbeta2、 LTalpha2 betal 、 Ltbeta和Ltbeta受体抗体，保留至少部分LTbeta受体激动剂或结合活性的其全长和子序列、变体或 多形态形式(例如，全长天然LIGHT (p30多肽)，其变体和多形态 形式和子序列)。
适用于该方法的目标对象包括需要该种治疗的对象，例如具有 或容易具有能够影响或牵涉任意区域、器官、组织或生物系统(例 如造血细胞、脑、皮肤、鼻咽、头、颈、肺、曱状腺、肾、肝、胰、 胃、肠、结肠、直肠、膀胱、卵巢、子宫、乳腺、前列腺、骨、阴 道或阴茎)的不良或异常高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌细/l包、恶性 细胞、新生细胞或转移性细胞或病原体感染性细胞的对象。
该方法包4舌减少或降^氐该高度增殖细/泡、肿瘤细胞、癌细胞、 新生细胞、转移性细胞或病原体感染的细胞的转移、增殖或数量， 或者抑制或防止该高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌细胞、新生细胞、 转移性细胞或病原体感染的细胞的数量或转移的增加，或者稳定该 高度增殖细月包、肿瘤细胞、癌细胞、新生细胞、转移性细月包或病原 体感染的细/泡的数量。
本发明进一步提供了相对天然野生型LIGHT(30多肽)(例如， SEQ ID NO: 1所示的LIGHT(30多肽)),对LTbeta受体或HVEM 具有增加的或更大的亲和性或亲和力，或对Decoy受体3 (DcR3) 具有减少的或更'J、的结合亲和性或亲和力的分离和纯化的LIGHT (p3(:)多肽)-氮基酸序列或其子序列。在特定的实施方式中，LIGHT (p30多肽)氨基酸序列包含SEQ ID NOs:3至10中任意一个，或其 子序歹。。
本发明进一步4是供了编码相对天然野生型LIGHT(30多肽)(例 如,SEQ ID NO: 1所示的LIGHT(30多肽)),对LTbeta受体或HVEM
具有-增加的或更大的亲和性或亲和力，或对Decoy受体3 (DcR3)具有减少的或更小的结合亲和性或亲和力的LIGHT (p30多肽)氨基 酸序列或其子序列的分离和纯化的LIGHT (p30多肽)核酸。在特定 的实施方式中，4亥酉臾编石马选自SEQIDNOs:3至10中4壬意一个的序 列，或其子序列。
本发明进一步提供了与选自SEQ ID NOs:3至10中任意一个的 LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列杂交或互补，Y旦不与天然 野生型L1GHT(30多肽)序列(例如，SEQ ID NO: 1 )杂交或互补
的斗亥酉臾。。
本发明还进一步提供了包含表达LIGHT (p30多肽)氨基酸序 列，例i。变4本和多形态形式的宿主细月包(例如，丰^f匕细月包)的栽体 (例如，表达载体)。在特定的实施方式中，核酸编码选自SEQ ID N(:)s:3至U)中任意一个的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序 列，而转化细胞表达选自SEQ ID NOs:3至10中任意一个的LIGHT (p3()多肽)-氮基酸序列。
图1A-IB.通ii^w LIGHT抑制肿瘤生长。(A)向每个样本4或 5只C57B1/6(B6)小鼠的组以7.5 x 105细胞/小鼠的量皮下注射以空
载体转导的EL4(EL4-LIGHT)。在细胞注射16天后以卡4甘测量同系 基因B6小鼠中的EL4和EL4-L1GHT肿瘤的生长。EL4-注射的小 鼠快速形成了明显的肿瘤，而EL4-L1G1-1T注射组的肿瘤保持在很 小或不可测得的状态。(B)同时向对照和测试组皮下注射2.5 x
1()5纟田胞/小鼠的EL4-V纟田胞。向测试组的每只小鼠随后注射 EL4-LIGHT细胞(2.5 x 105)。采用(A)中的方法测量肿瘤生长。 F丄4-LIGHT细胞强烈抑制亲代EL4细胞的肿瘤生长。
EL4细胞和用编码人LIGHT的逆4争录病毒图2A-2B. LIGHT同工型对LIGHT-介导的抗肿瘤应答的作
用。(A)对每组皮下注射2.5 x 105细胞/小鼠EL4-LIGHTATM的或 E;L4-LIGHTt66。在17天后测量肿瘤生长。(B)向每只小鼠注射、混 合的EL4-LIGHT (1.25 x 105细胞)和EL4-LIGHTt66 (1.25 x 105细 月包)。向一个单独的组注射EL4-LIGHT (2.5 x 105细月包)作为对照。注 意到的EL4-LIGHT-t66存在强烈抑制表达膜LIGHT的细胞介导的 4元月中瘤应答。
图3A_3E.基于生物素的蛋白固定化系统。(A)天然LIGHT
(横跨膜双层)和可溶性LIGHT固定化的示意图。代表性的细胞 表面分子(蛋白)以灰色阴影显示。带有接头的生物素衍生物显示 为义人该分子延伸的单才艮灰线。Neutravidin (中性亲和素)四聚体显 示为圆柱体。可溶性人LIGHT (LIGHTt66)显示为三聚体。(B) LIGHT修饰细胞的组装的示意图。目标细胞的细胞表面采用生 物素衍生物进行修饰，并用PBS洗涤去除游离的生物素。用1%福 尔马林固定该细胞，以含于PBS的中性亲和素(Neutmvidin) (10 !ig/ml)孵育30分钟，随后洗涤去除游离的中性亲和素。然后将细胞 与生物素化的LIGHT (1昭/ml)孵育45分钟，并洗涤去除未结合的 LIGHT。 (C)对LIGHT-修饰的EL4细胞上的细胞表面LIGHT的染 色。将EL4-NA-LIGHT (蓝纟《)和EL4-NA (灰色阴影)纟田胞与人 抗hLfGHT重组体"Ornniclone"抗体(5 fig/ml)在结合缓沖液(PBS，带 有2% FCS)中孵育60分钟，洗涤并用PE结合的山羊抗人l:gG (Southern Bk)tech)染色，通过流式细/I包4义进行荧光^全测。以表达 El..4-LI(:]HT (绿线)的逆转录病毒转导的细胞和EL4-V细胞(灰色 阴影)被用作对照。(D)固定化效率。测定了(C)中的EL4-LIGHT 和EL4-NA-LIGHT之间表面LIGHT染色的比平均荧光强度(MF!)。 (E)小鼠HVEM与EL4-NA-LIGHT细胞的结合。将细胞与小鼠 HVEM-Fc (20吗/ml)在结合緩冲液(PBS,带有2% FCS)中孵育60分钟，洗涤并用PE结合的山羊抗人IgG (Southern Biotech)染色，并 通过流式细胞仪进行荧光检测(线)。亲代EL4-NA细胞被用作阴 性对照(灰色阴影)。
图4A-4C.以LIGHT修^饰的癌症细胞i^ft^先免疫对肿瘤生 长的抑制。(A)依赖型肿瘤疫苗4妾种的^:计示意图。将福尔马林固 定的中性亲和素修饰的EL4 (EL4-NA)细胞(4 xl()6)或人LIGHT-中性 亲和素^f奮饰的EL4 (EL4-:NA-UGHT)细胞皮下注射至B6小鼠(n=4 或5小鼠)。14天后，用活的EL4细胞(0.5 x 106/小鼠)攻击这些 小鼠。在17天后测量肿瘤生长。(B)将福尔马冲木固定的人 UGHT-中性亲和素修饰的EL4 (EL4-NA-LIGHT)细胞(4 xl()6)或中 性亲和素修饰的EL4 (EL4-NA)细胞(4 xlO"皮下(SC)注射至B6小鼠 (n-:5小鼠/l且)。14天后，Z人每《且的小鼠采集血清，并通过流式 细胞仪测定结合至未修饰EL4细胞的小鼠抗体活性。将未修饰的 EL4细胞与含于40 fil结合緩冲液的血清(1:5稀释)孵育60分钟， 洗涤，并以山羊抗-小鼠IgG-PE二级抗体染色，通过流式细胞仪检 测荧光。预先注射EL4-NA细胞的小鼠不生成可测的抗-EL4抗体活 性。然而，在4只用EL4-NA-LIGHT细月包预先免疫的小鼠中的3 只测得了抗-EL4抗体应答。(C)预先注射EL4-NA-L1GHT细胞对攻 击的EL4肿瘤生长的作用。
图5A-5B.以LIGHT 4务饰的癌症细胞抑制原4戈肿瘤生长。(A)
研究设计示意图。将活的EL4纟田胞(0.5 xl 06)皮下(SC)接种至B6 小鼠(n爿9)，然后使肿瘤生长至观察到明显增厚(通常为6天)。 在第6天将福尔马林固定的LIGHT修饰EL4细胞(0.5 xl0"注射至 肿瘤体上。该福尔马林固定的中性亲和素修饰的EL4细胞,皮用作对 照,，(B)用EL4-NA-LIGHT细胞进行疫苗接种对于形成的EL4肿 瘤的作用。图6A-6B.对LlGHT-介导的抗肺瘤应答的受体的需求。将
EL4-LIGHT细胞皮下注射至缺乏(A) /n^w、(B)/^r的小鼠(2.5 x 105 细月包/小鼠)。缺乏LT卩R的小鼠不能排斥EL4-LIGHT肿瘤。
图7A-7B.在肿瘤环境中用EL4-LIGHT细胞"i秀导CCL21。(A)
在肿瘤环境中进行CCL21分析的研究设计的示意图。将EL4-V 或EL4-LIGHT细胞皮下注射至B6小鼠》在10天后采集脾脏进行 趋化因子CCL21的RT-PCR分析。(B) 相比用EL4-V对照注射 的d、鼠，在用EL4-LIGHT注射的小鼠中肿瘤渗透/l年脏中的CCL21 表达提高了 2.5倍。
图8A-8D.对LIGHT-介导的抗肿瘤应答的配体的需求。将
EL4-LIGHT细胞(2.5 x 105细胞/小鼠)皮下注射至(A)///2^和攀 (B)/〃w、 (C)"/ 或(D)/to遗传缺陷型小鼠中。在16-39天后测量月中 瘤生长。LTP—A(C)缺陷小鼠不能排斥EL4-LIGHT肿瘤，显示LTp 参与LJGHT-介导的抗肿瘤应答。
图9A-9B.在T和B细胞中的LTp表ii^寸于LIGHT-介导的抗
肿瘤应答是必需的。将EL4-LIGHT纟田月包(2.5 x 10"皮下注射至在(A) T细胞(T-LTP——)或(B) B细胞(B-LTpl中条件性删除/0的小鼠。在 2i-22天后测量肿瘤生长。在T或B细胞区域缺失LT卩的小鼠不能 够排斥EL4-LIGHT肿瘤，显示LT(3在T或B细胞区域的表达是必 需的，但对于LlGHT-介导的抗肿瘤应答而言并不足够。
图10A-10E. LTpR-Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc对人LIGHT变
体形式的亲和性。(A)将稳定表达LIGHT (32S-214E)的主要形式的 t:L4细胞与舍于i00 pl结合緩冲液中的梯度数量的LT(3R-Fc (3 ng 至50 jLig/mi)孵育60分钟，洗涤并以PE结合的山羊抗-人IgG染色，
通过流失细胞系检测荧光。通过从实验组减去亲代EL4细胞(阴性对照)的背景荧光染色获得比平均荧光强度(MFI)。平衡结合常数
可通过以Prism GmphPad (v4; San Diego, USA)(左图)和双倒凄t 图(右图)进行非线性回归分析计算得到。LIGHT变体32S-214K (B) 和32L-214E与LTPR-Fc的结合可参照(A)中方法冲企-验。(D)参照 (A)中的方法采用流式细胞仪检验稳定表达LIGHT各种多形态形式
(32S-214E, 32S-214K和32L-214E)的EL4纟田月包只于LT卩R陽Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc的结合亲和力。(E) 参照(A)中的方法采用 流式细胞仪才佥验稳定表达LIGHT多形态形式的各种组合
(32S-214E/32S-214K、 32S-214E/32L-214E和32L-214E/32S-214K ) 的EL4纟田月包对LT(3R-Fc、 HVEM-Fc和DcR3-Fc的结合亲和力。
图11A-UB.在DcR3存在下LTpR-Fc与表达LIGHT的EL4
细胞的竟争性结合测定。(A)将梯度浓度的DcR3-Fc与表达各种 I,IGHT多形态形式(32S-214E, 32S-214K, 32L-214E/32S-214K)的
EL4细胞在恒定浓度的LTpR-Fc存在下进行將育。采用抗-LT'pR单 克隆抗体(BD-A8)检测与表达LIGHT的EL4细胞结合的特定 LTpR-Fc。 (B) 采用Prism GraphPad (v4; San Diego, USA)经非线 性回归分析计算值IC50。
图12A-12B.基于生物素的蛋白固定化系统。(A)天然LIGIIT 和可溶性L1GHTL固定化的示意图。天然LIGHT三聚体包含显示 在左侧的跨膜区。可溶性LIGHT的固定化显示在右侧。代表性的 细胞表面分子(蛋白)以灰色阴影显示。带有接头的生物素衍生物 显示为从该分子延伸的单冲艮灰线。NeutraviciinTM四聚体显示为圓柱 体 可溶性人LIGHT (LIGHTt66)显示为三聚体。(B) LIGHT修饰 细胞的组装的示意图。(B) LIGHT修饰细胞的组装的示意图。目 标细胞的细胞表面采用生物素衍生物进行修饰，并用PBS洗涤去除 游离的生物素。该细胞以1 %福尔马林固定。然后将细胞与 Neiitravidin (10 pg/ml)在PBS中孵育30分钟，并、;先涤细月包以去除游离NeutravidinTM。然后将细胞与生物素化的LIGHT (1 fig/ml)孵育 45分4f ，并洗涤细力包去除未结合的LIGHT。
发明详述
本发明至少部分基于经过LTbeta受体激动剂修饰的细胞。特 别地，具有依附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂的细胞。 该种细胞可用于治疗不良的或是异常的细胞增殖、高度增殖(例如， 高/复增殖'!"生疾病)、肿瘤、癌症、4争移'性和新生以及病原体感染细胞。
根据本发明，提供了以LTbeta受体激动剂修饰的细胞，包括 LTbeta受体激动剂被依附、结合或偶联至细胞膜的细胞。LTbeta 受体激动剂包括，例如，LIGHT (p30多肽)、LIGHT (p30多肽)变体 或多形态形式、LIGHT (p30多肽)嵌合体、Ltalphalbeta2、 LTdpha2 beta:l、 Ltbeta和Ltbeta受体抗体。经LTbeta受体激动剂修饰的细 胞包括不良细胞或高度增殖细胞、肿瘤纟田月包、癌症细胞、新生细胞、 转移性细胞和病原体感染细胞。以LTbeta受体激动剂《奮饰的细胞包 括真核细l包，例如哺乳动物(例如，灵长动物或人)纟田月包，该纟田月包 可以是活细胞、非活性细胞或死细胞。
本发明还部分基于护&显示改变了对受体的亲和性和/或亲和力 的LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式。该种LIGHT (p30多肽)变 体或多形态形式相对于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，如SEQ II) NO: 1所示)对受体(例如LTbeta受体、HVEM或DcR3 (Decoy
受体3))具有不同的亲和性和/或亲和力。
根据本发明，提供了据显示改变了对受体(例如LTbeta受体、 HVEM或DcR3 (Decoy受体3))的亲和性和/或亲和力的LIGHT (p3()多肽)变体。在一个实施方式中，LIGHT (p30多肽)变体与SEQ ID NO: 1所示的天然野生型LIGHT (p30多肽)相比显示出对DcR3 (Decoy 受体3)下降的或是更少的亲和性和/或亲和力。在另 一 实施方式中， LIGHT (p30多肽)变体与SEQ ID NO: 1所示的天然野生型LIGHT (p30多肽)相比显示出对LTbeta受体或HVEM增加的或是更高的亲 和性和/或亲和力。LIGHT (p30多肽)变体包括从天然环境中分离或 純化的，具有不同于SEQ ID NO: 1的序列的多形态形式。
在涉及LTbeta受体激动剂时，此处所用的术语"依附、结合或 偶联"至细胞膜及其语法变化表示该激动剂结合至或物理依附至细 胞膜或细胞膜上存在的分子(例如，多肽、碳水化合物等)。因此， 例如，由于LTbeta受体激动剂从细月包中编码LTbeta受体激动剂的 核酸的表达，依附或存在于细胞膜上的LTbeta受体激动剂并非在细 胞表面上。LTbeta受体激动剂可依附、结合或偶联至细胞(例如高 度增殖细胞、肿瘤细月包、癌症细胞、新生细胞、转移性细胞或病原 体感染细胞)的膜上存在的任意分子。LTbeta受体激动剂与细胞膜 上的分子的结合可通过共价(例如，交联)或非共价(例如，配体 -受体，抗体-抗原)键介导。结合LTbeta受体激动剂的细胞可以是 或表达选自如下的抗原月中瘤细胞或癌纟田月包抗原、新生细月包或转移 性细月包抗原、病毒抗原、纟田菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
LTbeta受体激动刑可通过非共价或共价键"依附、结合或偶联" 至细胞膜或细胞膜上存在的分子。非共价键包括氢键、离子相互作
用、范德华相互作用以及疏水相互作用。非共价键的非限制性范例 为受体—配体、抗体-抗原和酶—底物。共价键通常包括电子的共享， 还被称为化学键。共价键.的非限制性范例为酰胺鍵，非天然的和非 酰胺化学键，其它化学键或偶联方式包括，例如，碳链，例如羧酸， 多碳链(例如，二狻酸，如戊二酸，琥础酸.和己二酸)，戊二醛， N-羟基琥珀酰亚胺酯，双功能马来酰亚胺，N,N'-二环己基石炭二亚胺(DCC)或N，N'-二异丙基碳二亚胺(DCC)。替代酰胺键的基团包括， 例如，酮亚曱基(例如，《(=0)《1"12-或-(^(=0)-^^),氨基亚甲基 (CH2-NH)，亚乙基,烯烃(CFNCH)，醚(CH2-0)，石危醚(CH2-S),四 哇(CN4-)， 口塞唑，反酰胺(retroamide),石克酰胺，或酉旨(例如，参见 Spatola ('1983)于 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids ， Peptides and Proteins. Vol. 7， pp 267-357， "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY )。
结合或偶联至细胞膜或细胞膜上存在的分子.中间体分子可以是其 本身共价或非共价结合至细胞的膜或细胞膜上存在的分子。在一个 实施方式中，中间《本分子包含两个或多个成分，例如第一部分和第 二部分。在特定的方面，第一和第二部分纟皮此结合或物理相互作用， 例如，第--部分包含生物素或生物素布f生物，而第二部分包含亲和 素、中性亲和素或《连霉亲和素，或其彩f生物或氨基酸变体。LTbeta 受体激动剂结合至细胞膜或细胞膜上的分子，因此包括与可结合细 月包月菱上的分子的亲和素、中性亲和素或4连霉亲和素的，或其彩于生物 或氨基酸变体的结合。该LTbeta受体激动剂或该激动剂依附、结合 或偶if关的分子可分别通过共价或非共价结合至生物素或生物素衍 生物，或亲和素、中性亲和素或《连霉亲和素。
LTbeta受体激动剂包括哺乳动物形式，例如灵长动物和人 LTbeta受体激动剂。该种激动剂包括"氨基酸"、"蛋白"、"多肽"和 "肽"序列。术语"氨基酸"、"蛋白"、"多肽"和"肽"在此可互换使用， 并指通过酰胺4i共^介连4妻的两个或多个凄l基酸或"残.基"，或者同等 的氨基酸序列可通过非天然和非酰胺化学键(包括，例如，与戊二 醛，N-羟基琥珀酰亚胺酯，双功能马来酰亚胺或N,N'-二环己基碳 二亚胺《DCC)形成的键)连接。非酰胺键包括，例如，酮亚曱基-氨基亚甲基、烯烃、醚、硫醚等(例如，参见Spatola in Chemistry andBiochemi.stry of Amino Acids. Peptides and Proteins, Vol 7, pp 267-357 (1983), "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY')。
LTbeta受#^敫动剂、嵌合体和LIGHT (p30多肽)包才舌LTbeta 受体激动剂的全长天然野生型、变体和多形态形式，例如保留了至 少部分LTbeta受体激动剂或结合活性的LIGHT (p30多肽)、HVEM 和LIGHT (p30多肽)嵌合体。示范性的LTbeta受体激动剂变体和多 形态形式包括相对于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO:l )对DcR3 (Decoy受体3)具有降低的或减少的亲和性的LIGHT (p30多肽)，相对于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO:l )对LT卩R或HVEM具有增加的或更高的亲和性或亲和力的 LIGHT (p30多肽)，以及相对于天然野生型LIGHT (p30多肽)(例 如，SEQ ID NO: 1 )对LT卩R或HVEM具有增加的或更高的亲和性 或亲和力且对DcR3 (Decoy受体3)具有降低的或减少的亲和性的 LIGHT (p30多肽)。LIGHT (p30多肽)的特定非限制性变体或多形态 形式包括选自SEQ ID NOs 3至10任意一个的氨基酸序列。
K表性的LIGi1T(p30多肽)序列如下所示
全长人LIGHT (氨基酸序列)(SEOIDNO: 1》
MEESWRPSVFWDGG'TDIPFTRLGRSHRRQSCSV,
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LIGHT的可溶性形式(AKA: LIGHTt66,氨基酸序列)(SEQ ID NO:
lvsqqspcgratsssrvwwdssflggwhleageevwrvlderlvrlrdgtrsyfg afmv
人LIGHT E214K (氨基酸序列)(SEO ID NO : 3 )
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乂、 LIGHT S32L ( -姜、基商臾/f歹l1 ) (SEQ ID NO: 4 )
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人LIGHT S9A(在氨基酸位置9上由S突变为A,氨基酸序列)(SEQ ID NO:5)
MEESWRPIvFWDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGIjGIAI^LMGAGLAVQGWF IAQL服RLGEKVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPHW
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人LIGHT S27A (在氨基酸位置27上由S突变为A，氨基酸序列) (SEO II) NO:6)
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人LIGHT S9A & S27A (在氨基酸位置9和27上由S突变为A,氨 基g臾/，歹'j ) (SEO 1DNO:7)meeswrplvfvvdgqtdipftrlgrihrrqscsvarvglgii嵐lmgaglavqgwf l:lq:lhwrlgemvtrlpdgpagsweqliqerrshevnpaahltganssltgsggpi^w etqlglaflrglsyhdgalwtkagyyyiyskvqlggvgcplglastithgiiykrtp rypeelellvsqqspcgratsssrvwwdssfxggwhleageewvrvlderlvrlr
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人LIGHT S9A & S32L (在氨基酸位置9上由S突变为A并在位置 32上由S突变为L，氨基酸序列)(SEQ ID NO:8)
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人LIGHT S27A & S32L (在氨.基酸位置27上由S突变为A并在位 ,置32上由S突变为L,氨基酸序列)(SE0 1DNO:9)
dgtrsyfgafmv/D 9的位f 2/ #口 32丄的-歲羞^嫂差被》 S^示。
人LIGHT S9A & S27A & S32L (在氨基酸位置9和27上由S突变 为A并在位置32上由S突变为L，氨基酸序列)(SEO ID NO:IO)
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LTbeta受体激动剂还包括LTbeta受体激动剂的全长天然野生 型、变体和多形态形式、LIGHT (p30多肽)、HVEM和LIGHT (p30 多肽)嵌合体。示范性的LTbeta受体激动剂、嵌合体和LIGHT (p30 多肽)的长度包括LTbeta受体激动剂的全长天然野生型、变体和多 形态形式、LIGHT (p3()多肽)嵌合体、LIGHT (p3(.)多肽)和HVEM, 以及保留了至少部分LTbeta受体激动剂或结合活性的LTbeta受体 激动剂-LIGHT (p30多肽)嵌合体、LIGHT (p30多肽)和HVEM的 子序列。示范性的LTbeta受体激动剂子序列包括从约5至15， 20 至25， 25至50, 50至100, 100至150, 150至200或200至300 个氨基酸残基的长度。
在特定的实施方式中，LTbeta受体〖敫动剂、LIGHT (p30多肽) 嵌合体、LIGHT (p30多肽)和HVEM包含约1至10、 10至20、 15 至20、 20至30、 30至40、 40至50、 60至70、 70至80、 80至9(h 90至100或更多个残基的氨基酸序列或由其组成。特定的非限制性 范例包括结合并保留至少部分LTbeta受体活性的SEQ ID NOs: 1-10任意一个所示的LTbeta受体激动剂的可溶形式，例如，缺失跨膜结 构域(例如，LIGHT (p30多肽)的胞外氨基酸序列)的激动剂，或 者SEQ ID NO: 2 (UGHTt66)所示的LIGHT (p30多肽)的可溶形式。 其它的特定非限制性范例包4舌结合LTbeta受体或HVEM、显示 LTbeta受体J敫动剂活性或与SEQ ID NO: 1相比具有与DcR3的结合 减少或更低的如SEQ ID NOs:3-10任意一个所示的LIGHT (p30多 肽)变体或多形体的可;容形式。
因此，LTbeta受体激动剂，如LIGHT (p30多肽)、LIGHT (p30 多肽)嵌合体、LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式以及HVEM可
包含一个或多个(2、 3、 4、 5等)保守和非保守替换。"保守替换" 是一个氨基酸被生物、化学或结构类似的残基所替换。生物类似表 示该替换与生物活性(例如，激动剂活性)相容。结构类似表示该 氨基酸具有类似长度的侧链，如丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸，或者具 有类似的大小，或者保留了第一、第二或附加结构域的结构。化学 类似.表示该残基具有相同的电荷或均未亲水或疏水。特定的范例包 括《f 4灸用 一个疏水残基(例如异亮-氤酸、缬-氤酸、亮—氤酸或y蛋氨酸) 替换另 一个疏水残基，或者用 一个极性残基替换另 一个极性残基， 例如用精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，或者用谷氨酰胺 替换天冬酰胺，丝氨酸替苏氨酸等,，常规测定可用于确定变体或多 形态形式是否具有活性，例如，激动剂活性或结合活性。
特定的范例包括受体激动剂(如LIGHT (p30多肽)变体和多形 态形式)中一个或多个(例如，1-3、 3-5、 5-10、 10-20或更多)氨
基酸残基的替换或删除。变体或多形态序列通常与参考序列具有 85%、 90%、 95%, 96%、 97%、 98%或更多的一致性。
术语"一致性"和"同源性"及其语法变化指两个或多个所指的实 体相同。因此，当两个fl基酸序列为一致时，它们具有相同的氨基酸序列。"一致的范围、区域或结构域"表示两个或多个所指实体中 的部分相同。因此，当一个或多个序列区域的两个氨基酸序列一致 或同源时，它们在这些区域具有一致性。由于在结构和功能相关蛋 白之间序列保留数量的变化，保留功能或活性所需的序列 一致性的 数量依赖于该蛋白、区域和该区域的功能或活性。术语"互补性"在 指核酸序列时表示参考区i或具有1.00%互补性，即，显示了没有4昔 配的100°/"咸基配对。
两个序列之间的 一致性程度可通过本领域已知的计算机程序 和数学算法得以确定。该种计算序列一致性(同源性)百分比的算
法通常可说明比较区域的序列间隙和错配。例如，BLAST (例如， BLAST 2.0)检索算法(例如,参见Altschul等人，J. Mol. Biol. 2i5:403 (l990),可乂人NCBI上々>开获耳又)具有如下示范性;险索参#:: 4昔配2;间隙开口5;间隙延伸2。对于多肽序列比对，BLASTP算 法通常组合使用计分矩阵，例如PAMIOO、 PAM250、 BLOSUM 62 或BLOSUM 50。 FASTA(例如，FASTA2和FASTA3 )和SSEARCH 序列比对程序同样用于对一致性程度的定量(Pearson等人，Proc. Natl. Acad. Sd. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol Biol. 132: 185 (2000); and Smith等人，J. Mol. Biol.47: 195 (1981))。采用基 于Delaunay的拓朴映射的蛋白结构相似性定量程序已被开发 (:Bostick等人，Biochem Biophys Res Commun. 304:320 (:2003》。
LTbeta受体激动剂如LIGHT (p3()多肽)、LIGHT (p30多肽)嵌 合体、LGI..「r(p:30多肽)变体和多形态形式以及.i-.1VEM序列可完 全由天然氨基酸或者由合成的、非天然-氮基酸或fL基酸类似物或书亍 生形式所组成。非天然存在的氨基酸序列包括L-氨基酸序列、D-氨基S菱序列和具有I,氨基酸和D-氨基酸混合物的氨基酸序列。在 不同的实施方式中，LTbeta受体激动剂包括替换L-氨基酸、D-氨基酸和L-氨基酸混合物或完全由D-氨基酸残基组成的序列的一个或
多个D-氨基酸。
氨基酸序列可以是线性或环状结构，其依附、结合或偶耳关至不 同的部分(例如，中间体)，形成分子内或分子间二硫键，经修饰 以包含，例如，糖或碳水化合物残基、磷酸基团、脂肪酸、脂质， 还形成更高级的多聚体或具有相同或不同氨基酸序列的低聚体，例
如，不同的LTbeta受体激动剂，例如多聚体组合中的LIGHT (p30 多肽)的野生型和变体或多形体。
LTbeta受体激动剂的其它范例包括抗体和抗体片段。"抗体"指 任意单克隆或多克隆免疫J求蛋白分子，例如IgM、 IgG、 IgA、 IgE、 :gD及任意其小类。IgG的示范性小类为IgG,、 IgG2、 IgG3及IgG4。 LTbeta受体激动剂抗体的特定范例包括3C8和4H8(大鼠抗小鼠)， 山羊多克隆抗体和小鼠抗人BDA8抗体。LTbeta受体激动剂抗体的 其它特定范例包括全长人源抗体。
1....Tbeta受体激动剂包括嵌合蛋白，其中具有不同于LTbeta受 体激动剂的部分。换言之，嵌合LTbeta受体激动剂可包含不同于天 然野生型LTbeta受体的部分。特定的范例包括与细胞膜上存在的抗 体、受体、配体或抗原相结合的抗原、配体、受体或抗体。其它的 特定范例包括结合免疫3求蛋白的蛋白A结构域。
月大禾口类月大(peptidomimetics)可采用本4页i或已4口的方法生万l和 分离。肽可通过本.领域已知的化学方法完全或部分合成(例如，参 见Caruthers (1980) Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn (1980) 以、7iBanga, A.K.., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation. Processing and Delivery Systems (.1995) Technomic Publishing Co.， Lancaster, PA),,月太'^成可通过多种固相4支术实施(例如，参见Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3(1997))，而自动合成可通过如ABI 431A肽合成4义(Perkin Elmer)
根椐生产商说明得以实现。肽和肽才莫拟物还可采用组合方法合成。 合成的残基和多肽结合类似物可通过本领域已知的多种步骤和方 〉去-合成(侈寸"i口，.参少1 Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman， 等人(Eds) John Wiley & Sons, Inc., NY)。修饰的肽可通过化学修 饰方法生成(例如，参见Belousov，Nucleic Acids Res. 25:3440 (1997); Freiikel, Free Radic. Biol. Med. 19:373 (1995)以及Blommers, Biochemistry 33:7886 (1994)。
本发明进一步4是供了编码不同于天然存在LIGHT (p30多肽) (例如，SEQ ID NO: 1 )的LIGHT (p30多月太)变体和多形体及其子 序列的核酸。核酸还提供编码与天然存在的LIGHT (p30多肽)(例 如，SEQ ID NO: 1 )相比减少了或不显示可测的与DcR3的结合， 但保留了至少部分与一种或多种LTbeta受体或HVEM的结合的 LIGHT (p30多肽)变体、多形态形式和子序列。核酸进一步l是4共了 编.码与天然存在的LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 )相比 与LTbeta受体和HVEM的结合增加或更高的LIGHT (p30多肽)变 体、多形态形式和子序列.在部分实施方式中，核酸编码SEQ ID N(::)s:3-10任意一个，或其子序列。在进一步的实施方式中，核酸与 编码SEQ II) NOs:3-10 ^壬意一个或其子序列的核酸序列互补。
核酸，在此也可称为基因、多聚核苷酸、核苷酸序列、引物、 寡聚核苷酸或探针，表示天然或修饰的任意长度的汗嘌呤和嘧咬聚 合物，指多核糖核苷酸或多脱氧核糖核普酸或者混合的多核糖-多脱 氣核糖核香酸及其a-异构形式。两个或多个含噪呤和嘧啶聚合物通 常通过磷酸酯键或其类似物进行连接。这些术语可互换使用以表示 所有形式的核酸，包4舌脱氣核3f磨核酸(DNA:)和核糖核酸(:RNA)。核 酸可以是单链、双链或三链，呈线性或环状。核酸包括遗传DNA、以是剪4妄或未剪4妾的m.RNA、 rRNA、 tRNA或反义。核酸包括天然存在的、合成的以及核苷酸类似物和
作为遗传密码退化的结果，核酸包括针对编码本发明的LIGHT (p30多肽:)变体和多形态形式的序列退化的序列。因此，本发明提 供了编码不同于天然存在LIGHT (p30多肽)(例如，SEQ ID NO: 1 ) 的LIGHT (p30多月太)变体和多形体及其子序列的核酸。
核酸可通过多种已知的标准克隆和化学合成方法生成，并可通 过定点突变或本领域^支术人员已知的其它重组^支术-进行有意的修 饰。多聚核苷酸的纯度可通过测序、凝/]交电泳、UV光语测定进行检测。
本发明的核酸可^皮4翁入核酸构建体，其中该核s交的表达受到
"表达控制元件"(在此称为"表达盒")的影响或调节。术语"表达控 制元件"指调节或影响与之可操作连接的核酸序列表达的 一种或多 种核酸序列元件。表达控制元件可在蛋白编码基因前适当地包括启
动子、增强子、转录终止子、基因沉默、起始密码子(例如，ATG)
寺..o
可操作地连接至核酸序列的表达控制元件控制核酸序列转录， 并适当地翻译核酸序列。术语"可4喿作地连接"指 一 种并置 (j uxtaposition)，其中涉及的成分所处的关系允许它们以其预期的方 式作用。通常表达控制元件并置在基因的5'或3'端，但也可以是内插子。
表达控制元件包括可诱导(即，需要外部信号进行激活)或可 脱阻抑(即，需要信号关闭激活；当该信号不在存在时，转录被激活或"脱阻抑")的组成性激活转录的元件。本发明的表达盒中还包 含了足以赋予基因表达针对特定细胞类型或组织的可控性的控制 元件(即，组织特异性控制元件)。该种元件通常^立于编码序列的 上游或下游(即，5'和3')。启动子通常位于编石马序列的5'。通过
重组DNA或合成技术生成的启动子可用于提供本发明的多聚核苷 酸的转录。"启动子"表示足以引导转录的最小序列元件。
核酸可被插入质粒以增殖进入宿主细胞和进行所需的后续遗 传才喿作。质粒是能在宿主细胞中稳定增殖的核酸；质粒可以可选地 包含表达控制元4牛，以驱动该核酸的表达。ot匕处所用的载体与质粒 同义，并可包含针对在宿主细胞中表达的表达控制元件。质粒和载 体通常包含至少用以在细胞内增殖的复制起始区和启动子。因此质 粒和载体可用于，例如，月太和杏t体编石马核酸的遗传才喿作，生成肽和 抗体或反义，以及在宿主细月包或有才几体中表达该肽和抗体。
细菌系统启动子包4舌T7和可i秀导启动子，如p藍菌体X的pL、 plac、 ptrp、 ptac ( ptrp-lac杂交启动子)以及四环素应答启动子。昆
虫细月包系#充启f力子包才舌纟且成的或是可i秀导的启动子(例，虫兌4匕
素)。哺乳动物细力包组成型启动子包4舌SV40、 RSV、牛乳头瘤病 毒(BPV)和其它病-誊启动子，或者由哺乳动物细"包(例如，金属硫 蛋白HA启动子；热休克启动子)或哺乳动物病毒(例如，^l病毒 晚期启动子；可诱导的小鼠乳房肿瘤病毒长末端重复)的基因组获 得的可诱导启动子。替代性地，逆转录病毒基因组可被遗传修饰， 以导入适当的宿主细月包并引导蛋白或抗体的表达。
表达系统进一步包4舌经"i殳计在体内^吏用的载体。特定的非限制 性范例包括腺病毒载体(美国专利5,700,470和5,731,172 ),腺病 毒相关载体(美国专利5,604,090 )，单纯疱渗病毒载体(美国专利 5,501,979 )，逆4争录病一争载体(美国专利5,624,820, 5,693,508和5,674,703 ) , BPV栽体(美国专利5,719,054 )以及CMV载体(美 国专利5,561,063 )。
酵母载体包含组成型和可诱导启动子(例如，参见Ausubel等 人,In: Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2， Ch. 13, ed.， Greene Publish. Assoc. & Wiley lnterscience ， 1988; Grant 等人 Methods in Enzymologv, 153:516 (1987)， eds. Wu & Grossman; Bitter Methods in Enzvmology. 152:673 (1987)， eds. Berger & Kimniel, Acad. Press, N. Y.以及Strathera等人,The Molecular Biology of the Yeast Saccha:romyces (1982—) eds. Cold Spring Harbor Press, Vols. I和II)。 可使用组成型酵母启动子如ADHesive或LEU2,或使用可诱导启 f力子嗦口 GAL ( R. Rothstein In: DNA Cloning, A Practical Approach, Vol.U, Ch. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash.， D.C., 1986 )。 通过同源性重组等方式促进外源核酸序列整合进入酵母染色体的 载体已为本领域所知。当插入的多聚核苦酸对于常身见载体而言过大 时(例如，大于约12 Kb),常可使用酵母人工染色体(YAC)。
(例如，beta-半乳糖苦酶)的选4奪性标记，从而允许细胞具有待选 择、生长和扩增的载体。替代性地，选择性标记可位于伴随含有本 发明多聚核苷酸的第 一 载体共转染进入宿主细胞的第二载体上。
i4冲奪系统包括^S不限于可分别应用于tk-, hgp:rt-或aprt-细胞的 单純疱疹病毒胸芬激酶(Wigler等人，Cell 11:223 (1977)),次黄噤 i呤-鸟'嘌口令石奔酉炱杉Z.术魯对i^多酵(Szybalska并口 Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sd USA 48:2026 (1962)),以及腺。票呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人.， Cell 22:817 1980)基因。此外，抗代谢产物耐受可作为对可陚予对氨 甲喋呤的耐受性的dhfr( O'Hare等人，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 78: 1 527 (1981));可赋予对霉酚酸耐受性的gpt基因(Mulligan等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981));可贝武予对氨基冲唐苦 G—418的耐受性的新霉素基因(Colberre-Garapin等人，J. Mol. Biol. 150:1(1981));噤^令霉素；以及可f!武予对潮霉素耐受〗生的潮霉素基 因(Santerre等人，Gene 30: 147 (1984)选4奪性的基础。其它的选择 性基因包括trpB,其允许细胞取代色氨酸利用。引咮；hisD,其允许 细胞耳又代组氨酸利用histinol;以及ODC (鸟氨酸脱羧酶)，其赋 予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂，2-(二氟甲基)-DL-乌氨酸，DFMO的耐 受性(McConlogue (.1.987) In: Current Communications in Molecular ■Biology, Cold Spring Harbor Laboratory)。
还提供了表达LIGHT (p30多肽)变体或多形态氨基酸序列的宿 主细;I包。该种导入了编码LIGHT (p30多肽)变体或多形态-氬基酸序 歹J的核酸的细胞被称为转化细胞。宿主和转化细胞包括不表达 LIGHT (p30多肽)变体或多形态氨基酸序列，但用于增殖包含了编 码LIGHT (p30多肽)变体或多形态氨基酸序列或其子序列的核酸的 核酸或载体的细胞。示范性的宿主和转化细胞表达选自SEQ ID NOs: 3至10任意一个的-氮基酸序列。在一个实施方式中，宿主或转化细 胞为原核细胞。在另一实施方式中，宿主或转化细胞为真核细月包。 在不同的方面，该真^f亥细月包为酵母或哺乳动物(例如，灵长动物， 人等)纟田月包。
宿主和转化细胞包括但不限于微生物(如细菌和酵母)，以及 植.物、昆虫和哺乳动物细/I包。例如，4^f共了以重组噬菌体核酸、质 粒核酸或粘粒核酸表达载体转化的细菌；以重组酵母表达载体转化 的酵母；以重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV:烟 草花叶病毒，TMV )或以重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化 的植物细胞系统；以重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的 昆虫细胞系统，以重组病毒表达系统(例如，逆转录病毒，月象病毒，牛痘病毒)感染的动物细/]包系统，或经过工禾呈改造可瞬时或稳、定增 殖或表达的转化动物细月包系统。
具有依附、结合或偶联至细胞膜或细胞膜上的分子的LTbeta 受体激动剂(例如，LIGHT (p30多肽)，LIGHT (p30多肽)嵌合体， LT(ilphal beta2, LTodpha2 betal, LTbeta或LTbeta受体抗体，LIGHT (P30多肽)变体和多形体及其子序列，以及编码LIGHT (p30多肽) 变体和多形体及其子序列的核酸)的细胞可包括分离或纯化形式。
完全或至少部分从天然存在的体内环境中分离。 一般而言，分离的 组合物基本不含一种或多种通常与之天然伴随的物质，例如， 一种 或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细月包膜。术语"分离的"不 排除该组合物的替代物理形式，例如多聚体/低聚体、变体、修饰或 衍生形式或由人工生成的宿主细胞中表达的形式。术语"分离的"还 不排除其组合中的任意一个由人工制备的形式(例如，药物制剂和 组'合物)。
当不含部分、大量、基本所有通常与之天然相伴的物质时，"分 离的"组合物也可以是"纯化的"。因此，基本纯的LIGHT (p30多肽) 变体或多形体不包含数百万种其它序列的多肽或多聚核苦酸，例如 在7圣白库中的蛋白或在基因组或cDNA库中的核酸。"纯化的"组合 物可结合一种或多种其它分子。
本发明提供了混合物或组合物,，在一个实施方式中，混合物包 含了两种或多种细胞，其中依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂， 每种细月包可选地具有不同的与之相连的LTbeta受体激动剂。在另一 实施方式中，混合物包含两种或多种LIGHT (p30多肽)序列，例如 变体或多形体以及野生型LIGHT (p30多肽)，或者第一LIGHT (p30 多肽)变体或多形体以及不同于该第一 LIGHT (p30多肽)变体或多形体的第二 LIGHT (p30多肽)变体或多形体。在进一步的实施方式 中，混合物包含了药物可接受的载体或赋形剂，即，药物组合物或
药物制剂。
例如以LTbeta受体激动剂和LIGHT (p30多肽)变体和多形态氨 基酸序列修饰的细胞等组合物可用于耙向不良的、异常的细月包，高 度增殖细/包，如肺瘤、癌症、新生和4争移'性细"包，以.及病原体感染 的细胞，使之溶解、死亡或凋亡。因此，可根据本发明治疗的基本 包括不良的、异常的细胞增殖和高度增殖细胞和疾病，例如，具有 或容易具有不良的、异常的高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌症细胞、 新生细胞、转移性细胞或病原体感染细胞的对象。
以LTbeta受体激动剂修饰的细月包可应用于各种方法，该细胞 包括表达一种或多种针对不良的、异常的细胞或高度增殖细胞、肿 瘤细胞、癌细胞、新生细胞、转移性细月包和病原体感染细月包的抗原 的细月包。因此，为了耙向不良的、异常细胞、高度增殖细胞、月中瘤、 癌症、新生和转移性细胞，这些细胞可经修饰具有依附、结合或偶 联至细胞膜的LTbeta受体激动剂，而该修饰后的细胞由此可用于靶 向不良的、异常的细胞、高度增殖细胞、肿瘤、癌症、新生、转移
修饰的细胞可用于fe向不良的、异常的细胞、高度增殖细胞、肿瘤、 癌症、新生和转移性细胞以及病原体感染细月包。
本发明还提供了促进、刺激、诱导或增加针对高度增殖细胞、
月中瘤纟田月包、癌细月包、新生细胞或转移性细月包、或病原体感染细胞的 免疫性的方法。在 一 个实施方式中，该方法包括向对象施用或接触 —定量的具有依附、结合或偶联至细月包膜的LTbeta受体激动剂的细 胞，其中该LTbeta受体激动剂足以促进、刺激、诱导或增加该对象
细月包4吏之〉容角年、死亡或凋亡。通过该方法，所针对高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌细胞、新生细胞、转移性细胞或 病原体感染细^^的免疫性。
本发明还提供了治疗对象的不良的或是异常的高度增殖细胞、 肿瘤细胞、癌细胞、新生细月包、转移性细月包、或病原体感染的细 月包的方法。在一个实施方式中，该方法包4舌向^"象施用或角f卩余一定
量的具有依.附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂的细胞， 其中该LTbeta受体激动剂可有效治疗X十象的不良的或是异常的高 度增殖细胞、肿瘤细胞、癌细月包、新生细月包、转移性细胞、或病
原体感染的细月包。
在不同的方面，该LTbeta受体激动剂包括LIGHT (p30多肽)、 LTalphal beta2、 LTodpha2 betal 、 LTbeta或LTbeta受体4元体。在对争 定方面，该LTbeta受体激动剂包括LIGHT (p30多肽)变体或多形态 序歹'j,例如，对LTbeta受体或HVEM具有增高的或更大的结合亲 和性的LIGHT (p30多肽)，或对DcR3具有减少的或更小的结合亲 和性或亲和力的LIGHT (p30多肽)，例如，SEQ ID NOs: 1， 2-10 中的任意一个或组合。在其它特定的方面，抗体为刺激或-提高 LTbeta受体活性的激动剂。
术语"高度增殖疾病"指任意不良的、异常的细胞存活(例如， 未进行程序性细胞死亡或凋亡)、生长和增殖。该种疾病包括增生、 非转移性肿瘤和转移性(新生)肺瘤和癌症。不良的、异常细胞增 殖和高度增殖疾病可影响对象中的4壬意细月包、组织、器官、区i或或 系统。肿瘤可源自多个组织和器官，包括^旦不限于，乳腺、肺、鼻 咽、甲状腺、头部和颈部、脑、淋巴、胃肠道(口腔、食道、胃、 小肠、结肠、直肠)、泌尿生殖道(子宫、卵巢、子宫颈、膀胱、 阴道—、睾丸、阴茎、前列腺)、肾、胰腺、肝脏、骨骼 肌肉、皮 映，其可转移或不转移至第二位点。不良或异常细力包增殖和高度增殖疾病可影响4壬意细l包或i!L织类型，例々口，癌、肉瘤、黑色素瘤、 神经和网状内皮或造血新生细胞和疾病(如，骨髓瘤、'淋巴瘤或白 血病)。不良的或异常的细胞增殖和高度增殖疾病可局部、区域或 系统;也存在于对象中。
术语"肺瘤"、"癌症"和"新生瘤"可互换使用，并表示生长、增 殖或存活大于普通的对应细胞的生长、增殖或存活的细月包或细月包群
体，例力口，细"包增殖或分4t疾病。一4S:而言，该种生长不受4空制。
术语"恶性"至对邻近组织的侵袭。术语"转移"指肿瘤、癌症或新生 物对该对象体内更远处的组织或位点的扩散和卡丈才番。
术i吾"病原体感染的细月包"指受到病毒感染、或者经-秀导(转化) 表达病毒、细菌或寄生虫(病原体)基因或当细月包依附、结合或偶
联了 LTbeta受体激动剂时刺激免疫性的基因的细胞，如自体人血细 胞。施用该种依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的病原体感染 细胞允许表达的病原体抗原诱导针对该抗原的免疫应答(例如，保
护'1生.免^/￡寸生)。
术语"接触"表示两个或多个实体之间(例如，介于LTbeta受体 和激动剂之间，已在膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的 细胞与对象之间，等等)直接或间接结合或相互作用。此处所用的 接-触包4舌在)容液中、固相中、体外、间4妄体内、细月包中以及4机内才妻 触。体内4妄触可一皮称为施用。
包含肿瘤的细胞可聚集在细胞团中或可分散。"实体肿瘤"指通 常具体在 一 起并形成团块的新生瘤或转移瘤。特定的非限制性范例 包括内脏胂瘤，例如，黑色素瘤，乳腺、胰腺、子宫和卯巢癌、睾 丸癌，包括精原细胞瘤，胃癌或结肠癌，肝癌，肾上腺、肾和膀胱 癌，肺、头和颈部癌症以及脑肿瘤/癌症表示上皮或内分泌组织的恶性胂瘤的癌包括呼吸系统癌，胃肠 系统癌，生殖泌v^系统癌，睾丸癌，乳月泉癌，前列腺癌，内分泌系 统癌和黑色素瘤。示范性的癌包^^由子宫、宫颈、肺、前列腺、乳 腺.头颈、结肠、胰腺、睾丸、肾上腺、肾、食管、胃、肝和卵巢 形成的癌。该术i吾还包4舌癌肉瘤，例如，包4舌由癌瘤性和肉瘤性组 织组成的恶性肿瘤的癌肉瘤。^^癌包4舌a泉组织的癌，或者肺瘤形成 腺状结构的癌。
肉瘤指间质细胞来源的恶性胂瘤。示范性的肉瘤包4舌，例如， 详本巴肉瘤、脂牙i肉瘤、骨肉瘤、岸欠骨肉瘤、平滑月几肉瘤、橫1丈月几肉
瘤和纤维肉瘤。
神经新生瘤包括脑胶质瘤、胶质母细胞瘤、脑膜瘤、神经母细 胞瘤、视网膜母细胞瘤、星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤。
"液态瘤"表示具有分-狀性质的新生瘤，因为它们通常不形成固 体团块。特定的范例包括网状内皮组织或造血系统的新生瘤，如淋 巴瘤、骨髓瘤和白血病。白血病的非限制性范例包括急性和l曼性成 淋巴细胞、成髓细胞白血病以及多发性骨髓瘤。通常而言，该种疾
病源自于分化4交差的急性白血病，例如，成红细月包白血病和急性成 巨核细胞白血病。特定的骨髓疾病包括，但不限于，急性早幼粒白 血病(APML),急性骨髓性白血病(AML)以； U隻性骨髓性白血病 (CML)。淋巴恶性肺瘤包括，但不限于，急性成淋巴细胞白血病 (ALL),其包括B系ALL和T系ALL，慢性淋巴细胞白血病(CLL)， 幼淋巴细胞白血病(PLL)，毛细胞白血病(HLL)以及特发性巨i求蛋白 血症(WM)。特定的恶性淋巴瘤包括，非1--iodgkin淋巴瘤及变体， 周边T细胞淋巴瘤，成年T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)，皮肤T细胞 淋巴瘤(CTCL),大颗粒淋巴细胞白血病(LGF)， Hodgkin疾病和 Reed-Sternberg疾病，，月中瘤、癌症、恶性肿瘤或新生瘤可处于4壬意阶4殳，例如，早期 或晚期，例如I、 II、 III、 IV或V阶段肺瘤。该肿瘤可经过预先处 理或被稳定化(非进展)或緩解。
膜上依.附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式以及本发明的方法包括抗增殖、抗肿 瘤、抗癌症、抗新生瘤治疗、方案以及疗法，其包括任意其它的抑 制、减少、阻滞、减緩、降低或防止高度增殖疾病(例如体外或体 内肿瘤、癌症、恶性或新生生长、进展、转移、增殖或存活、或者 恶化)的组合物、治疗或治疗方案。抗增殖性(例如，肺瘤或癌症) 治疗法特定的非限制性范例包括化学疗法、免疫疗法、放射疗法(电 离或化学)、局部热能(高温)疗法和手术切除。任意具有抗细胞 增殖活性或作用的组合物、治疗、计划、疗法或方案均可在本发明 的方法中与膜上依附了 LTbeta受体激动剂的细胞，LIGHT (p30多 肽)变体和多形态形式联用。
抗增殖或抗肿瘤组合物、疗法、计划、或治疗包括能够防止、 破坏、中断、抑制或延緩细胞周期进展或细胞增殖；刺激或增强凋 亡或细胞死亡，抑制核酸或蛋白合成或4汔谢，抑制细胞分化或减少、 降低或抑制细胞存活，或必要的细胞存活因子、生长因子或信号转 导途径(胞外或胞内)的生成和利用的组合物、疗法、计划或治疗。 具有抗细胞增殖和抗肿瘤活性的化学剂种类的非限制性范例包括 烷化剂、抗代谢物、植物提取物、植物生物碱、亚硝基脲、激素、 核芬酸和核芬酸类似物。具有抗细胞增殖和抗肿瘤活性的药物的特 定范例包括环磷酰胺，硫唑噪呤，环孢菌素A,泼尼松龙，美法兰， 笨丁酸氮芥，氮芥，白消安，氨曱蝶呤，6-巯基嘌呤，硫代鸟嘌呤， 5-氟尿嘧咬，阿糖胞苷，AZT, 5-氮胞苷(5-AZC)及5-氮胞苷相关的 化合物，如地西他滨(5-氮杂-2'脱氧胞苷)，阿糖胞苷，1-f3-D-阿 拉伯呋喃糖-5-氮胞嘧啶和二氢-5-氮杂胞苷，博莱霉素，放线菌素D,光神霉素，丝裂霉素C,卡莫司汀，洛莫司汀，司莫司汀，链唑霉 素，羟基脲，顺铂，米托坦，甲基千肼，达卡巴口秦，紫杉醇，长春 花石咸，长春新;咸，阿霉素和二溴甘露醇。
也可采用适用于该组合物和方法的其它药剂。例如，结合肿瘤
细胞或癌基因产物的单克隆抗体，例如Rituxan⑧和Herceptin (曲妥 单抗)(抗-Her-2 neu抗体)，贝伐单抗(阿瓦斯汀)，泽瓦林，百克沙， Oncolym, 17-1A(依决可单抗)，3F8 (抗-成神经细胞瘤抗体)， MDX-CTLA4， Campath , Mylotarg, IMC-C225 (西妥昔单抗)， cBR96 禾口 cAC10 的 aurinstatin 纟吉合4勿 (Doronina等人 Nat Biotechnol. 21:778 (2003))由其可与才艮据本发明的》务饰细胞或 LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式耳关用。
此处4是供了治疗肿瘤、癌症、新生恶性肿瘤或病原体感染的细 月包的方法，由于患有或易患有肺瘤、癌症、新生瘤、恶性肿瘤或病 原体感染的细胞而有此需要的对象的治疗发放，4是高效力或改进抗 肿瘤、抗癌症、抗新生瘤、抗恶性肿瘤或抗病原体感染的细月包的疗 法的方法,.在各自的实施方式中，该方法包4舌向患有或易患有肿瘤、 癌症、新生瘤、恶性肺瘤或病原体感染的细胞的对象施用一定量的 在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，或者一 定量的LIGHT (p3()多肽)变体和多形态形式，所施用的数量足以治 疗该肿瘤、癌症、新生瘤、恶性肿瘤或病原体感染的细力包；向该对 象施用一定量的在细胞膜上依附、结合或偶l关了 LTbeta受体激动剂 的细月包或LIGHT (p3()多肽)变体和多形态形式，所施用的凄史量足以 治疗该对象；以及向正经历或已经经历肿瘤、癌症、新生瘤、恶性 肿瘤治疗或针对病原体感染细胞的治疗的对象施用 一定量的在细 胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞或LIGHT (p3() 多肽)变体和多形态形式，所施用的数量足以提高该抗肿瘤、抗癌症、 抗新生瘤、抗恶性肿瘤或4元病原体感染细月包的疗法的效力,，本发明的方法可在不良、异位或异常细胞增殖或高度增殖疾病 或病原体感染的细月包的i正据(例如， 一种或多种症状)出现之前(即， 预防)、同时或之后进纟亍施用。在不良、异^f立或异常细力包增殖、高 度增殖疾病或病原体感染细胞的症状形成之前、同时或之后紧^妄施
用在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，或者 LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式可减少该对象体内一种或多种 症状的发作、频率、严重性、进展或期限。此外，在一种或多种症 状形成之前、同时或之后紧接施用在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体;敫动剂的纟田月包，或者LIGHT (p30多月大)变体和多形态形 式可减少或防止高度增殖细月包(例如，肿瘤或癌症转移)或病原体 感染细胞向对象体内其它区域、组织或器官的扩fA。
在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞， LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式，以及本发明的方法(例如治 疗方法)可提供可检测的或可测量的对对象的治疗效果或改进。治 疗效果或改进是任意可测量或可检测的、客刘L的或主观的、瞬时的、 临时的、或者更长期的对对象的效果或对对象的组织、器官、细胞 或细胞群中任意程度的状况、紊乱或疾病、有害症状、后果或基本 病因的改进。治疗效果和改进包括，^旦不限于，减少或降j氐与紊乱、 疾病或病症相关的一种或多种症状或并发症的—发作、频率、严重性. 进展或期限，或者减少或降低紊乱、疾病或病症的发病原因或后续 作用。在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞， LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式，以及本发明的方法(例如治 疗方法)因此包括向对象提供治疗效果或改进。
需要的对象施用充分或有效量的在细i]包j]莫上依附、结合或偶联了 LTbeta受体;敫动剂的细月包，或LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式。
"充:^量"或"有效量"指以单独或多重剂量、单用或与 一种或多种其它组合物(治疗剂，例如化疗或免疫刺激药物)、治疗、计划或治 疗方案4关用时，可向对象提供任意时间长度(长期或短期)的可测 应答、任意可测量或可检测程度的或是任意时间长度(例如，持续 小时、天、月、年或治愈)的预期结果或效果的数量。用于治疗(例 如，提供治疗效果或改进)的剂量或"充分量"或"有效量"通常能够
以可测-量的斥呈度有效改善紊舌L、疾病或病症，或者该紊3L、疾病或
病症的一种、多种或所有的有害症状、后果或并发症，尽管减少或
术i吾"改善"表示对于对象病症的可4企测的主，见或.客"L改进。可
作、频率、严重性、进展或期限的主乂见或客劝L上的减少，对疾病、 疾病或病症的发病原因或后果的改进，或者紊舌L、疾病或病症的耳又消。
因此治疗可导致紊乱、疾病或病症，或者相关的症状或后果， 或者发病原因的4卬制、减少或防止；紊^L、疾病、病症、症4大或后 果的进/良或恶化，或者该紊乱的一种或多种其它症状、疾病状况或 症状的进一步恶化或发作的抑制、减少或防止。因此，成功的治 疗结果导致"治疗作用"或"效莱"或者抑制、减少或防止对对象体内 一种或多种症状的发作、频率、严重性、进/良或期限，或者病症、 紊^L、疾病或症^1犬的发病原因或后果。因此，可影响该病症、紊乱、 疾病或症状的一种或多种发病原因的治疗方法被认为是有益的。对 紊乱或病症的进展或恶化的稳定或抑制同样是成功的治疗结果。
因此治疗效果或改进不需-要完全消除与病症、紊乱或疾病相关 的任意一种、多数或所有症状、并发症、后果或发病原因。因此， 当对于对象的症状有了改进，或者在较短或较长的时间期限内(小 时、天、周、月等) 一种或多种相关有害症状或并发症或后果或发病原因的发作、频率、严重性、进展或期限有了部分减少，或者该 紊乱或疾病的 一种或多种生理、生4t或细月包表J见或特4正的恶4t或进 展有了4p分减少(例力口，稳、定该病症、紊话L或疾病的一种或多种症 状或并发症)时，便达到了令人满意的终点。
充分量或有效量不需要在单次施用中提供，并且可以(但非必 须)单用或与另一组合物(例如，化疗或免疫刺〗敫药剂)、治疗、 计划或治疗方案联用。例如，该数量可才艮据该对象、紊乱的状态、 所治疗的疾病或病症或者4寺治疗的副作用的需求相应增加。此外， 如果在没有第二组合物(例如，化疗或免疫刺激药剂)、治疗、计 划或治疗方案时以单剂量或多剂量给用时，充分量或有效量不需要
充分或有效，因为还可在该剂量之外采用附加的剂量、^:量或期限， 或者可包舍附加组合物(例如，化疗或免疫刺激药剂)、治疗、计 划或治疗方案以达到对给定对象的充分和有效。认为充分的数量还 包4舌导致另 一治疗、治疗方案或计划的使用减少的^:量。
充分量或有效量无需对每一个治疗《于象有予页防或治疗效果，或 对给定組或群内大部分治疗对象有效。在治疗方法中常见的是，部 分对象对给定的治疗、治疗方案或计划显示出更大或更小的应答。 充分量或有效量指对特定对象充分或有效，而非对组或一^:群充分 或有效。该种数量将部分依赖于待治疗的病症，例如不良的、异位 的或异常的细胞增殖或高度增殖紊乱(例如，癌症、肿瘤、新生瘤 或恶性肿瘤)或者病原体感染细/]包的类型和阶,殳，预期的治疗效果，
以及.个体对象(例如，该对象的生物利用度、对该对象的应答、性
別、年龄等)，，
对于不良的、异位的或异常的细胞增殖，如高度增殖疾病(例 如,癌症、肿瘤、新生瘤或恶性肿瘤)或病原体感染性病的治疗效 果或改进的特定非限制性范例包括对高度增殖细胞(例如，肺瘤细胞、癌症细胞、新生瘤细胞、恶性肿瘤细胞)或病原体感染细胞的 大小、质量或体积的减少，对大小、质量和体积以及数量或转移增 加的抑制或防止，对于恶化或进展的减緩或抑制，刺激细胞溶解或 凋亡，减少、降低或抑制高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌症细胞、新 生细胞、转移性细胞或病原体感染性病的增殖或数量，或者减少、 降低或抑制肿瘤或癌症转移，或者稳定高度增殖细胞(例如，肿瘤 纟田月包、癌症细胞、新生细胞、恶性肺瘤细月包)或病原体感染细月包的 数量，降低死亡率，以及延长对象的寿命。因此，尽管没有形成对 癌症、肺瘤、新生瘤、恶性肿瘤或病原体感染细胞的完全消除，但 抑制或减緩大小、质量、体积或转移的上升(稳定化)可增加寿命
(减少死亡率)，即^f吏只有^t天、^:周或数月。
对不良的、异位的或异常的细胞增殖，例如高度增殖疾病(例 如，癌症、肿瘤、新生瘤或恶性肿瘤)，或病原体感染的细胞的症 状的发作、频率、严重性、进展或期限的减少，例如，对主管感受 的改进(例如，精神、食名夂的改善，恶心的减少，活动能力或心理 健康的改善)均为治疗效果或改进。可以减少或降^氐的与高度增殖 疾病(例如，癌症、肿瘤、新生瘤或恶性肿瘤)相关的症状或并发 症包括，例如，疼痛、恶心、食欲不振、嗜睡和虚弱。
例如，如果充分或有效量的在月莫上依附、结合或偶耳关了 LTbeta 受体激动剂的细胞，或LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式的施用 可导致不良的、异位的或异常细胞增殖，例如高度增殖疾病(例如， 癌症、肿瘤、新生瘤或恶性肿瘤)或病原体感染的细月包的治疗所需 的化疗药物、方t射、免疫疗法或病原体疗法的施用减少，则其被.认 为具有治疗效果。
术i吾"对象，，指动物，通常为哺乳动物，例如人，非人灵长动物 (猿、长臂猿、黑猩猩、猩猩、猕猴)，驯养动物(狗和猫)，畜
53牧动物(马、牛、山羊、绵羊、猪)，实验动物(小鼠、大鼠、兔 子、豚鼠)。对象包括动物疾病模型，例如，用于分析或体内研究 的不良的、或异位的细/I包增殖，例如高度增殖疾病(例如，癌症、 肿瘤、新生瘤或恶性肿瘤)或病原体感染的细"包的动物4莫型。
适于治疗的对象包括具有或者易具有不良的、异位的或异常细 胞(例如肿瘤、癌症、新生瘤、恶性肿瘤或转移性细胞)或者病原 体感染细l包的对象，正经历或者曾经历抗肿瘤、抗癌症、抗新生瘤、 抗恶性肿瘤或抗转移性细胞或者抗病原体感染细胞疗法的对象，包 括緩解中的对象。因此本发明适于治疗，例如，由于在一^殳时间的 静止或减緩后的复发或再生长易患有不良的、异位的或异常细胞、 肿瘤、癌症、新生瘤、恶性肺瘤或转移性或者病原体感染细力包或者 相关并发症的》于象
"易患"对象通常具有与不良或异位免疫应答、免疫紊乱或免疫 疾病、增生的形成(例如，癌症或肿瘤)相关的风险因素，或者暴 露至病原体或与病原体4妄触。风险因素包括年步冷、生活习惯(々欠食， 吸烟)、职业(医疗和临床人员，农业和畜业工作者)、环境因素 (致癌物质暴露)、家族史(自身免疫疾病，糖尿病等)、遗传倾 向、暴露等。例如，易患黑色素瘤的对象的风险因素包括过量曰光 照射(紫外辐射)、白皮肤、痣数量过多(发育不良痣)、患者显 型、家方l史或之前的黑色素瘤史。因A匕，易患癌症的对象可通过生 物习惯、职业、环境因素、家族史以及肿瘤相关基因、基因删除或
基因突变的筛选得以鉴别。例如，易患乳腺癌的对象缺失Brc"/。
易患结肠癌的对象具有幼年或高频率的鼻息肉形成，或者删除或突
变的肿瘤抑制基因，例如腺瘤性结肠息肉病('APC)基因。易患对高 -IgM (H!M)的免疫缺陷的对象可在如染色体X的q26发现基因 TNFSF5的在失陷。易患免疫缺陷疾病常常与MHC遗传型相关。例 如，糸t.尿病与HLA-DR3和HLA-DR4相关。包含在细胞膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细 胞，或LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式的组合物可以单独或多 重剂量以有效或充分量施用，以提供目标作用。示范性的剂量可在 连续数天或者隔天或间歇地施用。单独或多重剂量可在相同天内或 连续数天、隔天或间歇地施用。
可通过全身、区域或局部施用等任何途径施用该组合物和实施 该方法。例如，依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，或 LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式可全身、区域或局部、静脉、 口月良(例如，摄取或吸入)、肌肉、腹膜、皮内、皮下、腔内、颅 内、透皮(局部)、肠胃外(例如经粘膜或经直肠)施用。本发明 的组合物和方法包括可通过(微)月交嚢化传递系统施用或装填进入 移植物进行施用的药物制剂。
本发明进一步提供了包含在药物组合物和制剂中的在细胞膜 上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，或LIGHT (p30 多肽)变体和多形态形式，以及LIGHT (p30多肽:)嵌合体。药物组合 物指"药学可接受的"和"生理可接受"的载体、稀释剂或赋形剂。此 处所用的术语"药学可接受的"和"生理可接受的"在涉及栽体、稀释 剂或赋形剂时包括与药物施用以及与该制剂中其它成分相容的溶 剂(水性或非水性)、清洁剂、溶液、乳液、分"R介质、涂层、等 张剂和吸收促进或延緩剂。该种制剂可包含在片剂(包衣或未包 衣)、胶嚢(硬或软)、微粒、乳剂、粉末、颗粒、晶体、悬浮齐'J、 糖.浆或酏剂。
药物组合物可制成与特定施用途径相容的剂型。用于肠胃外、 皮内或皮下施用的组合物可包含无菌稀释剂，例如水、盐水溶液、 固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶剂。该制剂可包 含--种或多种防腐剂以防止微生物生长(例如，苯甲醇或羟笨曱酸曱酯等抗菌剂；抗坏血酸或重亚石克酸钠等抗氧化剂；乙二4妄四醋酉臾 等螯合剂；醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐等緩冲液以及氯化钠或右旋 糖等调节张力的试剂)。
适于注射的药物组合物包4舌无菌水;容液(具有水;容性时)或分 散体以及用于临时制备无菌水溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉 施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM (BASF, Parsippany， NJ)或磷酸盐緩冲液(PBS)。该载体可以是一种;容剂或-> 散介质，其包含，例如，水、乙醇、多羟基化合物(例如，丙三醇、 丙二醇、以及聚乙二醇)及其适当的混合物。可通过，例如，采用 卵磷脂等涂层或使用表面活性剂来保持流动性。抗菌剂和抗真菌剂 包括，例如，对羟笨曱酸酯、氯丁醇、笨酚、抗坏血酸和石克柳汞。 包4舌延纟爰吸收的药剂，例如，单硬脂酸铝和明月交可延长可注射组合
对于透粘膜或透皮施用，可在制剂中采用针对待渗透屏障的适 当渗透剂。该种渗、透剂已为本领域所知，并包4舌，例如，用于透粘 膜施用的清洁剂、胆汁酸盐和夫西地酸衍生物；用于透皮施用的油
膏、软膏、凝胶或霜剂。
其它药物制剂和传递系统已为本领所知并适用于本发明的
:方、;去(如J^口， 参;L Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index (1996) 12th ed. , Merck Publishing Group ， Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa.， (1993)以及Poznansky ，等人，Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. (1980), pp. 253-315)。根据本发明提供了生成在细胞膜上(例如，与该细胞膜上存在
的分子，例如多肽或碳水化合物)依附、结合或偶联了 LTbeta受体 逸t动剂的细/I包的方法。在一个实施方式中，该方法包4舌在允许所述 细胞和所述LTbeta受体激动剂结合(例如，通过中间体分子结合) 的条件下将该细力包与该LTbeta受体〖敫动剂相4妻触，,人而生成具有依 附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂的细胞。在特定的方 面，该LTbeta受体;敫动剂并非由细/泡中编石马该LTbeta受体激动剂 的核酸表达得到，而是通过共价或非共价键依附、结合或偶联至该 膜。在另一实施方式中，该方法包括在允许所述细胞和所述LIGHT (p3()多肽)变体和多形态形式结合的条件下将该细胞与该LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式相接触，,人而生成具有依附、结合或 偶联至细胞膜的LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式的细胞。在该 实施方式的特定方面，该LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式可乂人 编码该LIGHT (p30多肽)变体或多形态形式的细胞核酸表达得到。
在特定的方面，该LTbeta受体;敫动剂包4舌其中包含了与细月包 膜上存在的分子相结合的结合部分(例如配体、受体或抗体或抗体 子序列)的一种或多种LIGHT (p30多肽)、LTcxlphal beta2、 LTodpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受体抗体，或嵌合蛋白 在其它特定的方 面，LIGHT (p30多肽)包括全长氨基酸序列、LIGHT (例如，SEQ ID NO: 1所示)的胞外氨基酸序列或可溶形式的L1GHT(例如，SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66)。除了特定的方面之外，LIGHT (p30多 肽)包含相对于天然野生型LIGHT (p30多肽)对DcR3 (Decoy受体 3)具有降低的亲和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列，相对于天然 野生型LIGHT (p30多肽'pt LT(3R或HVEM具有增加的亲和性的 1」GHT(p30多肽)氨基酸序列，或者相对于天然野生型LIGHT (p30 多肽)对LTPR或HVEM具有增加的亲和性且对DcR3 (Decoy受体3)具有降低的亲和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列，例如，选自 SEQ ID NOs 3至10任意一个的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
在进一步特定的方面，该细胞为高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌 症.细胞、新生细胞、转移性细J包或病原体感染细胞、或表达选自肿 瘤细胞或癌症细胞抗原、新生细胞或转移性细胞抗原、病毒抗原、 细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原的分子的细胞。细胞可以是死的 或者活的、真核的、哺乳动物(例如，人)细胞。
除了特定的方面以外，该细胞与第一部分(例如，生物素或生 物素衍生物)接触后于第二部分(例如，亲和素、中性亲和素或《连 霉亲和素，或其衍生物或氨基酸变体)接触，从而生成了包含于细 胞结合的第 一部分以及与该第 一部分结合的第二部分的分子，所述 部分包4舌中间体分子。
在另一特定的方面，该LTbeta受体激动剂通过结合细胞膜上 存在的抗体与该细月包膜结合，该LTbeta受体;敫动剂通过LTbeta受 体激动剂与细胞膜上存在的分子(例如，蛋白或石灰水化合物)的交
联与该细胞膜结合。
本发明提供了包含了装填在适当包装材料中的在细胞膜上依 附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞，LIGHT (p30多肽)变 体和多形态形式或其组合物和药物制剂的试剂盒。试剂盒可选^^性 包含带有成分描述或者对其中成分的体外、体内或间接体内的使用 的说明的标签或包装插页。示范性的说明包括对减少或抑制细胞增 殖，减少或抑制高度增殖细胞的增殖，减少或抑制新生、肿瘤或癌 症细力包、恶性肿瘤或转移性、或病原体感染细/泡的增殖，治疗具有 高度增殖疾病的对象，治疗具有转移性或非转移性新生瘤、肿瘤、 癌症或恶性胂瘤或病原体感染细胞的对象的说明。术语"包装材料"指包容该试剂盒的成分的物理结构。该包装材 料可维4争该成分无菌，并可用常用于该种目的的材料(例如，纸， 波紋纤维，玻璃，塑料，箔，安瓿，小瓶，管等)制作。
本发明的试剂盒可包含标签或插页。标签或插页包括"印刷 品"，例如，单独或粘帖至成分，试剂盒或包装材料(例如，箱子)， 或贴在包含试剂盒成分的安吾瓦，管子或小瓶的纸张或纸寺反。标签或 插页可进一步包括计算机可读介质，例如磁碟(例如，软盘，硬盘，
ZIP盘)，如CD-或DVD画ROM/RAM, DVD, MP3等光石茱，》兹带， 或RAM和ROM等电子存〗诸介质或其复合体，如》兹/光.存4诸介质， FLASH介质或记忆类型卡。
标签或插页还可包括其中 一种或多种成分的鉴别信息，剂量， 活性成分的临床药理学(包4舌作用冲几制，药^动力学和药效学)。 标签或插页可包括生产商信息，批次，生产商地址以及日期的识别信息。
标签和插页可包含有关试剂盒成分可能针对的病症、紊乱或疾 病或症状的信息。标签和插页可包含针对临床医师或对象在方法、 治疗计划或治疗方案中使用 一种或多种试剂盒成分的i兌明。说明可 包括剂量、频率或期限，以及实施此处所述的任意方法、治疗计划 或治疗方案的说明。示范性的说明包括对治疗不良的、异位的或异 常细胞、高度增殖细胞或病原体感染细胞的说明。因此本发明的试 剂盒可进一步包括针对实施本发明所述的任意方法(包括治疗、检 测、监测或诊断方法)的标签或说明。
标签或插页可包括试剂盒成分可能提供的任意效果(例如，预 防性或治疗性效果)的信息。标签或插页可包括有关潜在有害副作 用的信息，例如对临床医生或对象有关不适于使用特定组合物的情
59形的警示。不良副作用还可能在该对象曾经，将要或正在采用一种 或多种可能与该组合物不相容的其它药物时出现，或在该对象曾
经，将要或正在4姿受与该组合物不相容的其它治疗方案时出现，因 此，该说明可包括有关该种不相容性的信息。
本发明的试剂盒可进一步包含其它成分。该试剂盒的各个成分 可封入单独的容器中，且所有不同的容器包含在单个包装中。本发 明的试剂盒可冷冻保存。本发明的试剂盒可进一步设计为包含表达 本发明的肽或抗体或包含编码核酸的宿主细胞。该试剂盒中的该细 胞可保存在适当的贮存条件下，直至该细胞即将被使用。例如，含 有一种或多种细胞的试剂盒可包含适当的细胞贮存培养^^,从而<吏 该细月包可 一皮融解和生长。
除非另行说明，此处所用的技术和科学术语的含义等同于本发
明所属领:t或普通4支术人员的普遍理解。尽管其它与此处所述类似或 等同的方法和材料也可用于对本发明的实施或测试，此处描述了适 用的方法和材津+。
此处引用的所有应用，出版物，专利及其它参考文献，GenBank 引文以及ATCC引文均在此全文引用作为参考。在产生沖突的情况
下，将受本说明书包4舌定义所支配。
除非上下文另行明确指出，此处所用的单数形式的"一种"和 "该"包括复数含义。因此，例如，在提及"膜上依附、结合或偶联了 LTbeta受体激动剂的细胞"或"LIGHT (p30多肽)变体和多形态形式" 时包括了多个该种细胞、变体或多形态形式，等等。
除非上下文另行明确指出，此处所用的所有数值或数值范围包 括该范围内的整数以及该值或该范围内整数的分数。因此，例如，90-100%的范围包括91%, 92%， 93%， 94%, 95%, 95%, 97%等， 以及91.1 %, 91.2%, 91.3%， 91.4%， 91.5%等，92.1%, 92.2%， 92.3%, 92.4%, 92.5%等，并依次类4f至。
此处一4殳4皮露的本发明采用肯定性的语言描述多个实施方式。 本发明还特别包括了完全或部分排除特定对象(例如，物质或材料、 方法步骤和条件、计划、步骤、测定或分析)的实施方式。因此， 尽管本发明 一般不以本发明包括什么来进行表示，本发明未明确排 除的方面仍然在AW皮露。
本发明的一系列实施方式已得到描述。然而，应当理解可在 不脱离本发明的精神和范围的基础上进行各种改动。相应地，下列 实施例目的在于阐述，而非限值权利要求书中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1
本实施例包括了对各种村料和方法的描述。
LIGHT基于生物素在肺瘤细月包上的固定4匕:LIGHT》爹饰的癌 细胞的组装的示意图(图12)显示了包括三个连续步邻l的过程(:i) 癌细胞的生物素化，(ii)可溶性LIGHT的生物素化以及(iii)可溶性 LIGHT在该生物素化癌细胞上的固定化。在该整个过程中需要采用
无菌一支术。
癌细胞的生物素化: 癌细胞可从多种肺瘤切除后的恶性组 织中纯化得到(Greiner,等人，J Lab Clin Med 109:244 (1987)和 O'Brien，等人，Cytometry 28:81 (1997)。在该制备中，我们采用了EL4纟田月包。将50 x 106的EL4细月包以冰冻的pH8.0的Dulbecco磷酸 盐緩冲液(PBS)洗涤3次(Invi加gen Corporation, USA; Cat. # 14190-144)以从组织培养基中去除任意的污染〃蛋白。4夺该细胞等夕)、 至两个管子(25 x 106细胞/管)，并用1 ml PBS (pH 8.0)悬浮。采 用市售的生物素化试剂NHS-PE04-生物素(Pierce, IL， USA; Cat. # 21329)进行该标记反应。在即将使用前，将200 pi的超纯蒸馏水 (Invitrogen Corporation, cat. # 10977-01 5);忝力口至2 mg的NHS—PE04-生物素，并将50 pl的该NHS-PE04-生物素i容液添加至含25 x 106 EL4细胞的每个管中。将该样本在室温下孵育30分钟，每5分4中 进行间歇的混合。以ml冷的PBS (pH 8.0)洗涤该细月包3次以去除 未反应的生物素化试剂。所制备的EL4细月包采用1%福尔马才木 (ProtocolTM， USA; Cat. # 245-684)在水上固定30分4中，用1.2ml 的冰冻PBS (pH 7.4)洗涤4次，并贝±存在4。C下。
可溶性LIGIIT的生物素化:将纯化的可溶性人LIGHT (LIGHTt66,浓度=0.262 mg/ml，含于PBS, pH 8.0)用于该生物素标 记反应(Rooney,等人J. Biol. Chem. 275: 14307 (2000))。在即^4吏 用前将200〖il的超纯蒸馏水(Invitrogen)添加至2 mg的NHS-PE04-生物素，并将3.7 mi的该NHS-PE04-生物素溶液添加至1」GHTt66。 小午该才羊本在;水上孵育2小时。之后，添加42 pl的1 M Tris (pH 8,0) (Fisher Scientific, USA; Cat.弁BP1 54-1 )以终止该反应。将该才羊本 对1L的PBS透析，并—进4亍3次纟爰沖液杀#才奐。经过0.22 mm Millex-GV 过滤器(Mmipore， Ireland, Cat. # SLGV004SL)的过滤只寸生物素4匕的 LIGHTt66灭菌，将其分成小的等分，并贮存在-8(TC下。
可溶性LIGHT在生物素化的癌细胞上的固定化: 在本制备 中使用了生物素化并福尔马林固定的EL4细月包(30 x 106)。将该细月包 重悬浮于1 ml PBS (pH 7.4)中，然后与10 fig/ml的NeutravidinTM (Pierce; Cat. # 3 IOOO)孵育30分钟。用1 ml冰冻PBS (pH 7.4)洗涤该细胞4次以去除游离的Neutravidin 。然后将该细月包与生物素4匕 的LIGHTt66 (1 i!g/ml)孵育45分钟，并用1 ml的冰冻PBS (pH 7.4) 洗涤3次以去除未结合的LIGHT。将制备的细胞重悬浮于无菌PBS (40 x 106细月包/ml)中，并贮存在4°C下以供体内抗肿瘤石开究。
本实施例显示了 i正实肿瘤生长,皮肿瘤细月包表面上表达的 LIGHT所抑制的ft据。
为了分析LIGHT介导的肿瘤排斥的效力，采用了 EL4肺瘤细 胞模型。EL4是来自于C57/BL6 (B6)小鼠的小鼠胸腺瘤癌细胞系。 当EL4细胞被皮下注射至同系基因B6小鼠时，在5至7天内形成 实体肿瘤，并通常在15-20天中发展为致命的肿瘤。采用人LIGHT 怍为潜在的免疫治疗剂。采用重组逆转录病毒制备稳定表达LIGHT 的EL4细月包系,.，将表达人LIGHT的EL4细胞(EL4-LIGHT)皮下注 射进入同系基因B6小鼠，然后监测肿瘤的生长。对照(7.5cn )和测 试组在15-20天后得到的平均肿瘤大小明显不同(p〈0.05)(图l.A)。 在注射了用对照空载体诱导的EL4细胞(EL4-V)的小鼠中长出了巨 大的种瘤。相反i也，在注射EL4-LIGHT细月包的小鼠中，肺瘤并未 生长，因此被排斥了。该结果证实了人LIGHT在小鼠紳瘤细胞中 表达时诱导的抗肿瘤应答。
为了确定未修饰的EL4细月包是否会在表达LIGHT的EL4细月包 的存在下生长，将等量的EL4-V和EL4-LIGHT纟田月包分另'j注入相同 的小鼠。EL4-V细胞一皮用作对照(图1B)。在以EL4-V细胞注射 的小鼠中，该肿瘤迅速生长。对于共注射组，表达LIGHT的EL4
显示了肿瘤排斥的全身作用。该结果从两个方面来看非常重要。首
实施例2
端位置不表达LIGHT的EL4肿瘤的排斥，先，它显示了肿瘤排斥不是由于人蛋白的存在，因为不具有LIGHT 的EL4-V细胞同样被排斥了 。其次，该结果证实了表达LIGHT的 EL4细胞能够介导针对EL4肺瘤的全身应答。
实施例3
本实施例显示了 LIGHT同工型在刺激抗肺瘤应答中的作用。
在人和小鼠中，LIGHT存在至少三种主要的同工型(膜LIGHT、 可溶性LIGHT和LIGHTATM ) (Granger,等人，J Immunol 167:5122 (2001)。膜LIGHT代表了具有5争膜锚(transmembrane anchor)的 LIGHT的全长形式。膜LIGHT可脱落(在细胞外测蛋白酶解裂解) 成为可;容性形式，而LIGHT的第三种同工型可通过交^务剪4秦，导 致跨膜结构域的删除后形成(LIGHTATM)。 UGHTATM缺失跨膜结 构域并位于胞质溶胶中。
为了确定其它的LIGHT同工型是否能够诱导抗肿瘤应答，采 用重组逆转录病毒制备稳定表达可溶性LIGHT (EL4-UGHTt66)和 Ll(i〖ITATM (EL4-LIGHTATM)的EL4细胞系。将这些细胞系注射 进入两组小鼠并监测肿瘤的生长。结果(图2A)证实表达可溶性 UGHT或L1GHTATM的细月包均不能i秀导抗肿瘤应答。
为了确定可溶性LIGHT是否会损害EL4-L1GHT介导的肿瘤排 斥，将EL4-LIGHT和EL4-LIGHTt66的混合物注射—进入B6小鼠， 并监测肿瘤的生长(图2B)。注射了 EL4-LIGHT的小鼠显示出肿 瘤完全不生长。相反地，注射了 EL4-LIGHT和EL4-可溶性LIGHT 的小鼠中的肿瘤迅速生长。因此，可溶性LIGHT会削弱LIGHT-依赖性抗肿瘤应答。这些结果显示膜结合的LIGHT是LIGHT-介导 的4元肿瘤活性所必须的。实施例4
本实施例包含了对基于生物素的蛋白固定化系统的描述。
基于病毒和细菌的载体传递系统在人体内具有先天的安全问 题。为了规避这一基于载体的传递系统的固有问题，开发了不依赖
于载体的生物化学方法，用以将功能性LIGHT连接至肿瘤细胞的 表面。该方法是一种固定化系统，其通过化学(生物素)连接以稳、 定的方式将可溶性蛋白显示在基本任意细胞的表面上。该方法(如 图3A和B所述)采用了纯化的重组表达的可溶性LIGHT (LIGHTt66) (Rooney，等人，J. Biol. Chem. 275: 14307 (2000))牙口 EL4月中瘤纟田月包 以得到增强的免疫性。首先，将EL4细胞的细胞表面蛋白生物素化。 然后，将可溶性LIGHT (LIGHTT66)同样生物素化。通过添加四聚 体中性亲和素将生物素化的可溶性LIGHT固定化至生物素化的 EL4细胞膜蛋白上。由于生物素和中性亲和素之间的结合非常强， 这种生物素-中性亲和素-生物素复合物在体内才及为稳定。
为了确定固定化的效力，以流式细胞仪检测LIGHTt66,并与 EL4-LIGHT细胞进行比较。在EL4细胞表面上固定化的可溶性 LIGHT可通过抗体染色或以HVEM-Fc进行检测(图3C, E)。根 据(Rooney,等人，Methods Enzymol 322:345 (2000))的描述制备 LIGHT/LT(3R-Fc和HVEM-Fc的替代受体。
LIGHT-修饰的EL4细胞(EL4-NA-LIGHTt66)的荧光强度为逆 转录病毒诱导的EL4细胞(EL4-I」GHT)表达水平的27% (图3D ), 显示该方法可向细J包力莫传递与逆转录病毒诱导相当的LIGHT。该结 果证实了该基于生物素的固定化系统是将纯化的LIGHT连接至细 胞(例如肿瘤细胞)表面的有效途径。因此，该基于生物素的固定 化系统可作为生物活性LTbeta受体激动剂(例如LIGHT)可依.附或偶联至肿瘤细胞表面的范例。该种基于生物素的细胞膜固定化系
统是一种可变的无载体—^代系统，其可用于以LTbeta受体激动剂 (例如LIGHT)修饰肿瘤细胞，从而在该细胞被施用至动物时增强
对月中瘤细力包的免疫应答。
实施例5
本实施例包含了证实肿瘤生长被在细胞膜上依附、偶联或结合 了 LIGHT的F丄4纟田月包戶斤4中制的凄t才居。
为了确定LIGHT修饰的细胞作为癌症疫苗的能力，设计了计 划以评估LIGHT结合的EL4细月包作为癌症疫苗的效力(图4A )。 以结合LIGHTt66 (EL4-NA-LIGHTt66)或结合中性亲和素(EL4-NA)
的福尔马林固定的EL4细胞注射两组小鼠。如同典型的疫苗策略， 在注射有活力的 EL4肿瘤细月包的 14天前向小鼠注射 F丄4-NA-UGHTt66或EL4-NA纟田月包，从而生成免疫应。为了才t验 LIGHT-修饰的EL4细胞对体液免疫性的诱导，从每个小鼠組采集 免疫前和免疫后的血清，并采用未》务饰的EL4细月包通过流式细胞4义 测试#元-EL4抗体活性(图4B)。以EL4-NA细月包接种的小鼠未生 成可测的抗-F丄4活性。相反地，在注射了 EL4-NA-LIGHT的5只 小鼠中的3只的血清中检测到了抗-EL4抗体活性，证实了以LIGHT-修饰的EL4细胞进行的免疫引发了对EL4抗原的抗体应答。
为了确定LIGHT〗奮饰的EL4细"包作为免疫增强疫苗的效力， 在每组中注射EL4细胞并监测肿瘤生长。以进行LIGHTt66-修饰的 EL4细胞免疫的小鼠显示了肿瘤生长速率的明显下降(图4C)。这 些数据证实了以LIGHTt66-修饰的EL4纟田胞进行免疫可针对EL4 肿瘤生成抑制肿瘤进展的免疫应答。实施例6
本实施例包含了证实原代肿瘤生长被在细胞膜上依附、偶联或
结合了 LIGHT的EL4细胞所抑制的数据。
为了评估LIGHT-修饰的EL4细胞抑制原代肿瘤生长的能力， 向小鼠皮下注射EL4细胞，并允许细胞增殖，从而形成预先建立的 肿瘤。然后，向肿瘤区域注射福尔马林固定的EL4-NA-L.1GHT细胞， 并对肿瘤生长监测16天(图5A)。将福尔马林固定的EL4-NA作
为对照。
注射了 EL4-NA-LIGHT纟田月包的小鼠中的肿瘤生长相对EL4-NA 对照有所下降。这些结果i正实了 LIGHT"奮饰的EL4细月包在抑制已 建立的肿瘤生长中的效力。因此，依附、偶联或结合了 LTbeta受体 激动剂如LIGHT的肿瘤细胞可用于已建立的肿瘤的治疗(图5B )。
本实施例包含了证实对LIGHT-介导的抗肿瘤应答的受体要求
的数据。
为了从分子角度认识LIGHT-介导的抗肿瘤应答，对LIGHT-介导的抗肿瘤活性的受体要求进行了评估。LIGHT可与2种信号转 导受体HVEM和LT[3R相互作用。为了确定LIGHT-介导的抗肿瘤 应答需要两种受体中的哪一种，对LT卩R和HVEM敲除(KO)小鼠
在HVEM KO小鼠中，EL4-LIGHT细胞被排斥(图6A )，提 示HVEM并非LlGHT-介导的抗肿瘤应答所必需。当随后以亲代 EL4细胞攻击这些小鼠时，没有肿瘤形成。相反地，在LT(3R KO
实施例7小鼠中，EL4肿瘤被排斥，提示通过LTpR的LIGHT信号转导参与 了 LIGHT-介导的抗肿瘤活性(图6B)。
实施例8
本实施例包含了证实LIGHT刺激肿瘤环境中CCL21生成的彰:
据<>
将EL4-LIGHT细胞通过静脉途径注射进入缺失T和B细胞的 重组酶激活基因-2 (RAG2-"小鼠，并在脾脏、肝脏和肺中被测得。 为了检验LIGHT在肿瘤环境中刺激趋化因子的能力，将 EL4-LIGHT纟田胞注入进入RAG2:小鼠，并采集脾脏以通过实时 RTPCR检测CCL21 (图7A )。注射EL4-LIGHT的小鼠的CCL21 表达相对于注射了作为对照的EL4细胞的小鼠冲是高了 2.5倍(图 7B )。该结果证实了 LIGHT在T和B细胞缺失时在胂瘤环境中提 高了 CCL21生成。
实施例9
本实施例包含了对显示了 LiGHT-介导的抗.肿瘤活性机制的数
据的讨论。
LT(3R与LIGHT、 LT(3和LTal(32相互作用。为了检验内源性 LIGHT 、 LT(3和LTa对LIGHT-介导的抗胂瘤活性的贡献，将 〖::L4-LIGHT细胞皮下注射至遗传缺陷LT卩R的一种或多种细胞配体 的小鼠(LIGHT—LTp—— 、 LIGHT々—、LT(3々—以及LToT )。
在同时缺失LIGHT"'-和LT(T'-的小鼠中，EL4-LIGHT肿瘤未被 排斥，，提示内源性LIGHT和/或LTp参与LIGHT-介导的抗肿瘤活 性(图8A)。然而，当EL4-LIGHT纟田月包被注射进入LIGHT"'—小鼠时，该胂瘤被排斥，显示该肿瘤控制不要求内源性LIGHT。当随后
以亲代EL4细胞攻击这些小鼠时，该肿瘤仍一皮排斥(图8B)。
为了确定淋巴毒素是否参与肿瘤排斥，将EL4-LIGHT细胞注 射入LT(T'—和LTof"-小鼠(图8C和D) 。 LT(3缺陷小鼠不能排斥 EL4-LIGHT胂瘤，显示LT卩参与LIGHT-介导的抗肿瘤控制。相反 地，该EL4-LIGHT肺瘤在LTor'-小鼠中排斥，尽管它需要更长的排 斥过程，提示LTa可提供帮助，但非LI:G.HT-介导的抗肿瘤控制所必需。
EL4-LIGHT细胞能够于LToT7—小鼠中没有的次级淋巴器官的缺 失下诱导抗肿瘤应答。此外，LToT 、鼠可用作其它缺失刺激淋巴器 官的突变小鼠如LTPR-7-(图6B )和LTP;(图8C )的表型对照。 排斥EL4-LIGHT肿瘤的缺失LIGHT々-和LTa,的小鼠在随后以未修 饰的EL4细胞进行攻击时，未显示肿瘤形成(图8B和D),且这 些小鼠在5个月以上仍保持无肿瘤，显示通过该处理诱导了对EL4
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月t溜的w 买1。'r乙，合。 实.施例10
本实施例包含了显示T和B淋巴细月包中LT(3的表达可导致 LI GHT-介导的抗肿瘤活性的数据。
为了进一步考察LIGHT-介导的肿瘤排斥对LT(3表达的细胞需 求，将T(T-LT(3—7—)纟田月包或B细胞(B-LTp勺的条件性敲除LT卩的小鼠 作为宿主，以检验EL4-LIGHT的免疫刺激作用。将EL4-LIGHT细 胞皮下注射进入T-LT(3—'-和B-LT(T-小鼠，并监测肿瘤生长22天。 在T或B细胞中缺失/《i的小鼠不能排斥EL4-LIGHT肿瘤。该数据显示LTf3在T和B细胞的表达均参与LIGHT-介导的肿瘤排斥(图9)。
实》包例11
本实施例包含了对可增强免疫疗法的LIGHT的变体形式的描
LIGHT在人的癌症免疫疗法中的效力受到人肿瘤所表达的 DcR3的潜在不利影响。人LIGHT的变体形式的特定组合改变了其 对人LT(3R和DcR3的结合亲和性。LIGHT亚基的组合(32L-214E
的高结合亲和性，4旦对人DcR3具有降低的亲和性(图10和表1 )。 此夕卜，对DcR3存在下该LIGHT 32L-214E/32S-214K的杂三聚体形 式和LT(3R之间的相互作用进行了评估。
竟争性结合测定证实了 DcR3-Fc对与LIGHT-E214K (在氨基 酸位置214由E突变为K )和LIGHT-S32L (在氨基酸位置32由S 突变为L)的组合的50"/。结合抑制浓度(IC50)约比LIGHT的主要形 式(图32S和214E，图1 , SEQ ID NO: 1 )高2.5 # 。具体i也，冲目 对LIGHT的主J^形式(SEQ ID NO: l)需要高2.5 4咅的DcR3-Fc浓度 来抑制LT(3R-Fc与LIGHT-E214K和LIGHT-S32L组合的结合。因 此，LIGHT-E214K和LIGHT-S32L可成为激活LTpR信号转导系统 的潜在药剂。
因此，LIGHT变体32L-214E/32S-214K分子可能是增强免疫应 答(特别但不限于对癌症细胞)的更有效的形式。增强的效力源于 对LT|3R的高结合亲和力和对DcR3的^^结合亲和力。据发现DcR3 可在多种癌细胞中高度表达，LIGHT变体32L-214E/32S-214K将使得DcR3对LIGHT及其受体HVEM和LT(3R之间的相互作用的抑 制作用最小化。此外，由于上文数据证实了 LT(3R可导致LIGHT-增强介导的抗肿瘤应答，LIGHT 32L-214E/32S-214K对LT卩R的高 结合亲和力也可增强LIGHT-介导的抗肿瘤活性。
权利要求
1.细胞，所述细胞具有依附、结合或偶联至细胞膜的LTbeta受体激动剂。
2. 如权利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂包括 LIGHT (p30多/汰)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受体抗体。
3. 如权利要求1所述的细月包，
4. 如权利要求1所述的细月包, 新生细力包或转移性细月包。
5. 如权利^:务求1所述的细月包,其中该细胞为高度增殖细胞。 其中该细月包为肿瘤细^>、癌细月包、其中该细月包为病原体感染的细月包。
6. 如权利要求1所述的细月包，其中该细月包表达选自如下的抗原 月中瘤细胞或癌细胞抗原、新生细月包或转移性细月包抗原、病毒抗 原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
7. 如斥又利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂不是由 编码该LTbeta受体激动剂的细胞内核酸表达的。
8. 如权利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂依附、 结合或偶if关至该细胞的膜上的分子。
9. 如权利-务求5所述.的细胞，其中该LTbeta受体激动剂经共价 或非共价键介导结合至细胞膜上的分子。
10. 如权利要求1所述的细胞，其中该分子包括多肽或碳水化合物。
11. 如一又利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂通过如 下方式依附、结合或偶联至细胞膜LTbeta受体激动剂与中 间体分子共价或非共价结合，所述中间体分子共1"介或非共价结 合至细胞膜上的分子。
12. 如权利要求11所述的细胞，其中该中间体分子包含第一部分 和第二部分。
13. 如片又利要求12所述的细胞，其中所述的第一部分包含生物素 或生物素布于生物。
14. 如权利要求12所述的细胞，其中所述的第二部分包含亲和素、中,[生亲和素或链霉亲和素，或其衍生物或氨基酸变体。
15.如权利要求1所述的细胞，其中LTbeta受体激动剂通过与亲和素、中性亲和素或链霉亲和素或其衍生物或氨基酸变体的结 合而结合至该细月包膜，其中所述的亲和素、中性亲和素、链霉 亲和素、其衍生物或氨基酸变体结合至细胞膜上的分子。
16,如权利要求1所述的细胞，其中通过将该LTbeta受体激动剂 与该细胞月莫上的分子交联，从而发生LTbeta受体激动剂与细月包月莫的结合。
17.如权利4^求1所述的细胞，其中LTbeta受体激动剂通过与细 胞膜上的抗体结合而结合至该细胞膜。
18.如权利要求1所述的细胞，其中通过将该LTbeta受体激动剂 与该细胞膜上的分子交联使得LTbeta受体激动剂结合至细胞膜。
19. 如权利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂包括嵌 合蛋白，该嵌合蛋白包含结合部分。
20. 如权利要求19所述的细胞，其中该Ltbeta受体激动剂嵌合蛋 白结合部分包含结合至细胞膜上的分子的配体、受体或抗体或抗体子序列。
21. 如权利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂为哺乳 动物的LTbeta受体;敫动剂。
22. 如权利要求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂为人的 LTbeta受体;敫动剂。
23. 如权利要求2所述的纟田胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含全长氨基酸序列。
24. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽:)包含 LIGHT的胞外氨基酸序列。
25. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: I所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
26. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p3()多肽)包含 LIGHT的可i容'性形式。
27. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可;容性形式。
28. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含 UGHTt66。
29. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
30. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含与天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比对DcR3 (Decoy受体3)的亲和 性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
31. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含与天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比乂于LT卩R或HVEM具有更高 亲和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
32. 如权利:齊求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含与天 然野生型LIGHT (p30多肽)相比对LTpR或HVEM具有更高 亲和性并对DcR3 (Decoy受体3)的亲和性下降的LIGHT (p30多肽)-氨基酸序列。
33. 如权利要求2所述的细胞，其中该LIGHT (p30多肽)包含选自 SEQ ID NO: 3至10任意一个的-氮基酸序列。
34. 如权寿i]要—求1所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂具有与 之连接-的生物素或生物素衍生物。
35. 如权寿'J要-求i所述的细胞，其中该LTbeta受体激动剂不是由 编码该LTbeta受体激.动剂的细胞内核酸表达的。
36. 如权利要求1所述的细/泡，其中该细月包为真核细胞。
37. 如权利要求l所述的细胞，其中该细胞为哺乳动物细胞。
38. 如权利要求1所述的细胞，其中该细胞为人细胞。
39. 如片又利要求1所述的细^0其中该细月包为死细月包。
40. 如权利要求1所述的细胞，其中该细胞为活细月包。
41. 包含权利要求1至40任意一项所述细胞的药物组合物D
42. 促进、刺激、诱导或增加针对高度增殖细胞、肺瘤细胞、癌细 月包或转移性细力包、或病原体感染的细力包的免疫性的方法，其包 括向对象施用 一 定量的具有依附、结合或偶l关至细力包膜的 LTbeta受体激动剂的细胞，其中该LTbeta受体激动剂可有效 促进、刺激、诱导或增加该对象针对高度增殖细胞、肿瘤细胞、 癌细胞、转移性细月包或病原体感染细^>的免疫性。
43. 如权利要求42所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂包括n， (p30多肽)、LTalphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受体抗体。
44. 如权利要求42所述的方法，其中该对象具有不良的或是异常 的高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌纟田l包、新生细月包或转移性细胞、或病原体感染的细月包。
45. 如权利要求43所述的方法，其中该高度增殖细胞、肿瘤细月包、 癌细胞、新生细胞或转移性细胞、或病原体感染的细胞包括造j&纟田月包。
46. 如权利要求43所述的方法，其中该高度增殖细月包、肺瘤细胞、癌细胞、新生细胞或转移性细胞是选自如下组织或器官的细胞脑、皮肤、鼻咽、头、颈、肺、曱状腺、肾、肝、胰、胃、 肠、结肠、直肠、膀胱、卵巢、子宫、乳腺、前列腺、骨、阴 道或阴茎。
47. 治疗对象的不良的或是异常的高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌细 胞、新生细胞或转移性细J包、或病原体感染的细胞的方法，其 包括像.该对象施用 一定量的具有依.附、结合或偶联至细胞膜的 LTbeta受体激动剂的细胞，其中该LTbeta受体激动剂可有效 治疗该对象的不良的或是异常的高度增殖细胞、肿瘤细胞、癌 细胞、转移性细胞或病原体感染细胞。
48. 如4又利要求47所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂包括 LIGHT (p30多肽)、LTcdphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta或LTbeta受体抗体。
49. 如4又利要求47所述的方法，其中该治疗减少或降j氐该高度增 殖细胞、肿瘤细胞、癌纟田胞、新生细胞、转移性细胞或病原体 感染的细胞的转移、增殖或数量，或者抑制或防止该高度增殖 细月包、肿瘤细胞、癌纟w胞、新生细月包、转移性细胞或病原体感染的细胞的数量或转移的增力o,或者稳定该高度增殖细胞，肿 瘤纟田月包、癌纟田月包、新生细胞、转移性细胞或病原体感染的细胞的数量。
50.如权利要求47所述的方法，其中该高度增殖细胞、肿瘤细胞、 癌细胞、新生细胞、转移性细月包或病原体感染的细月包包括造血 纟田月包。
51. 如权利要求47所述的方法，其中该高度增殖细胞、肿瘤细胞、 癌细月包、新生细胞或转移性细胞包括脑、皮月夫、鼻咽、头、颈、 月巿、曱状腺、肾、肝、胰、胃、肠、结肠、直肠、膀胱、卵巢、 子宫、乳腺、前列腺、骨、阴道或阴茎的细胞。
52. 如权利要求47所述的方法，其中该肿瘤或癌症包括肉瘤、癌、 黑色素瘤、林巴瘤、白血病或骨髓瘤。
53. 权利要求42至52任意一项所述的方法，其中该对象为哺乳动物。
54. 权利要求42至52任意一项所述的方法，其中该对象为人。
55. 如斥又利要求47所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂为哺乳 动物的LTbeta受体i敫动剂。
56. 如权利要求47所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂为人的 LTbeta受体激动剂》
57. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含全长氨.基酸序列。
58. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的胞外氨基酸序列。
59. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 1所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
60. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的可i容性形式。
61. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可::容性形式。
62. 如外又利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含 LIGHTt66。
63. 如4又利要求48所述的方法，其中该UGHT(p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
64. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比对DcR3 (Decoy受体3)的亲 和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
65. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比乂于LT(3R或HVEM具有更 高亲和性的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
66. 如权利要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然里于生型LIGHT (p30多肽)相比对LT(3R或HVEM具有更 高亲和性并对DcR3 (Decoy受体3)的亲和性下降的LIGHT (p30多肽)—氮基酸序列。
67. 如权利-务求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包4、选 自SEQ ID NO: 3至10任意一个的氨基酸序列。
68. 如权利-要求48所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)具有与 之连接的生物素或生物素衍生物。
69. 如权利要求47所述的方法，其中该细/]包表达选自如下的抗原 肿瘤细胞或癌细胞抗原、新生细胞或转移性细胞抗原、病毒抗 原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
70. 如权利要求47所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂不是由 编码该LTbeta受体激动剂的细胞内核酸表达的。
71. 如权利-务求47所述的方法，其中该细胞为真核细胞。
72. 如^l利要求47所述的方法，其中该细"包为哺乳动物细J!包。
73. 如权利-务求47所述的方法，其中该细力包为人细胞。
74. 如4又利要求47所ii的方法，其中该细月包为死细月包。
75. 如4又利凌-求47所述的方法，其中该细月包为活细月包。
76. 具有依附、结合或偶耳关至细/]包力莫的LTbeta受体激动剂的细月包 的生成方法，其包4舌a) 在允许细胞与中间体分子结合的条件下将所述细胞与所述中 间#&-—f^目对姿角虫；一ob) 在允许所述中间体分子和LTbeta受体激动剂结合的条件下将 该细胞与所述LTbeta受体激动剂相4妻触，从而生成具有依附、 结合或偶l关至细胞膜的I.Tbeta受体激动剂的细胞。
77. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂包括 LK;HT (p3()多肽)、LTodphal beta2、 LTalpha2 betal、 LTbeta 或LTbeta受体抗体。
78. 如权利要求76所述的方法，其中该细胞表达选自如下的抗原 肺瘤细胞或癌细胞抗原、新生细胞或转移性细胞抗原、病毒抗 原、细菌抗原、真菌抗原或寄生虫抗原。
79. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂不是由 编码该LTbeta受体激动剂的细胞内核酸表达的。
80. 如权利-务求76所述的方法，其中该细月包为高度增殖细胞、肿 瘤纟田胞、癌细月包、新生细胞、转移性细月包或病原体感染的细月包。
81. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂依附、 结合或偶联至该细胞的膜上的分子。
82. 如权利要求81所述的方法，其中该分子包括多肽或碳水化合物。
83 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂通过共 价或非共价键依附、结合或偶联至该细胞膜。
84. 如权利要求76所述的方法，其中步骤a)包括将该细/l包与第一 部分丰l触，然后与第二部分对妄触，从而生成包含了结合该细月包 的第 一部分和结合该第 一部分的第二部分的分子。
85. 如权利-齊求84所述的方法，其中所述的第一部分包含生物素或生4勿素形亍生4勿。
86. 如权利要求84所述的方法，其中所述的第二部分包含亲和素、 中性亲和素或链霉亲和素，或其衍生物或氨基酸变体。
87. 如权利要求76所述的方法，其中该细胞表达选自如下的抗原 月中瘤细月包或癌细月包抗原、#斤生细月包或转移寸生细月包4元原、病毒抗 原、细菌4元原、真菌4元原或寄生虫才元原。
88. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂不是由 编码该LTbeta受体激动剂的细胞内核酸表达的。
89. 如4又利-要求76所述的方法，其中LTbeta受体激动剂通过与亲 和素、中性亲和素或链霉亲和素或其衍生物或氨基酸变体的结 合而结合至该细胞膜，其中所述的亲和素、中性亲和素、链霉 亲和素、其衍生物或氨基酸变体结合至细胞膜上的分子蛋白。
90. 如4又利要求76所述的方法，其中通过将该LTbeta受体激动剂 与该细胞膜上的分子交联，从而发生LTbeta受体激动剂与细胞膜的结合。
91. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂通过与 细胞膜上的抗体结合而结合至该细胞膜。
92. 如一又利要求76所述的方法，其中通过+务该LTbeta受体纟敫动剂 与该细胞膜上的分子交Jf关〗吏得LTbeta受体激动剂结合至细胞膜。
93. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂包括嵌 合蛋白，该嵌合蛋白包含结合部分。
94. 如权利-务求76所述的方法，其中该Ltbeta受体激动剂嵌合蛋 白结合部分包含结合至细胞膜上的分子的配体、受体或抗体或抗体子序列。
95. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂为哺乳 动物的LTbeta受体激动剂。
96. 如4又利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂为人的 LTbeta受体;敫动剂。
97. 如4又利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多月太)包含全长-氤基酸序列。
98. 如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包舍 LIGHT的胞外氨基酸序列。
99. 如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ 1DNO: 1所示的LIGHT的胞外氨基酸序列。
100.如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含 LIGHT的可溶性形式。
101.如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHT的可;容性形式。
102.如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含 LlGHTt66。
103.如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含SEQ ID NO: 2所示的LIGHTt66。
104.如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然野生型LIGHT (p3()多肽)相比对DcR3 (Decoy受体3)的亲 和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
105. 如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比只于LT卩R或HVEM具有更 高亲和性的LIGHT (p30多肽)氨基卧乏序列。
106. 如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含与 天然野生型LIGHT (p30多肽)相比对LT(3R或HVEM具有更 高亲和性并对DcR3 (Decoy受体3)的亲和性下降的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列。
107. 如权利要求77所述的方法，其中该LIGHT (p30多肽)包含选 自SEQ ID NO: 3至10 ^壬意一个的氨基酸序列。
108. 如权利要求76所述的方法，其中该LTbeta受体激动剂具有与 之连4妾的生物素或生物素书于生物。
109.如4又利凌-求76所i€的方法，其中该细月包为真核细月包。
110.如权利要求76所述的方法，其中该细胞为哺乳动物细胞。
111.如4又利要求76所ii的方法，其中该细月包为人细月包。
112.如权利要求76所述的方法，其中该细胞为死细胞。
113.如权利要求76所述的方法，其中该细胞为活细胞。
114.选自SEQIDNOs: 3至10中任意一个的分离或纯化的LIGHT (p3(0多肽)氨基酸序列或其子序列。
115.如权利要求1 14所述的分离或纯化的LIGHT (p30多肽)氨基酸 序列，其中该LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列对 LTbeta受体或HVEM具有增加的或更大的亲和性或亲和力，或对Decoy受体3 (DcR3)具有减少的或更小的结合亲和性或 亲和力。
116.编码选自SEQ ID NOs: 3至10中4壬意一个的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列或其子序列的核酸。
117.可与编码选自SEQ ID NOs: 3至10中Y壬意一个的LIGHT (p30 多肽》氤基酸序列或其子序列的核酸杂交或互补， <旦不与？予生 型天然LIGHT序列杂交或互补的核酸。
118.如权利要求.17所述的核酸，其中该野生型天然LIGHT序列 包含SEQ ID NO: 1 。
119. 包含选自SEQ ID NOs: 3至10中任意一个的LIGHT (p30多肽)凑、基酸序列或其子序列的编码核酸的载体。
120. 如权利要求119所述的载体，其包含表达载体。
121. 表达选自SE:Q ID NOs: 3至10中任意一个的LIGHT (p30多肽)氨基酸序列的转化纟田月包。
全文摘要
肿瘤坏死因子超家族成员LIGHT(p30；TNFSF-14)是诱导针对肿瘤的免疫应答的细胞因子。新型的生物化学方法被用于以LIGHT修饰肿瘤细胞的表面。LIGHT修饰的细胞可被用于疫苗接种，并诱导针对表达neo或病原体相关抗原的细胞的有效、持续的免疫。LIGHT的变体被描述为可以增强与细胞受体(例如，LT beta受体)的结合并减少被抑制剂(例如，Decoy受体3)的调节，提高刺激免疫的能力。
文档编号A61K39/00GK101616686SQ200780048119
公开日2009年12月30日 申请日期2007年10月25日 优先权日2006年10月25日
发明者卡尔·F·韦尔, 泰勒莎·A·班克斯, 蒂莫西·C·张 申请人:拉·约拉过敏反应及免疫医学研究所