抑制细胞增殖和手术粘连的方法和组合物的制作方法

专利名称：抑制细胞增殖和手术粘连的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及能抑制和/或防止手术过程中形成的细胞增殖和粘连的方法和组合物。
背景技术：
美国大约实施过180万的腹部外科手术，在接受过腹部外科手术的所有患者中， 67-93%的患者出现术后粘连现象。美国每年花费在去除腹部粘连上的费用超过了 20亿美金。全球所有手术治疗分布如下；腰部手术(800，000)，肌腱/神经手术(500，000)，腹部手术(2，000，000)，骨盆手术(2，600，000)，移植手术(2，000，000)，心脏手术(2，000，000)。 以上所有这些外科手术都会引发严重的粘连。虽然粘连现象在一些手术中是不可避免的， 但良好的手术操作技术可以尽可能减少粘连的情况下最大可能取得手术成功。器官或组织通过瘢痕组织相互粘连在一起，引发各种临床问题。而瘢痕组织的形成是正常愈合过程的一部分，也是伤口良好愈合所必须的过程，在一些情况下，瘢痕组织在愈伤区域过度生长从而引发粘连。这种粘连的形成限制了身体受累部位的正常移动和功能，从而称为外科手术并发症。粘连可以导致疼痛有时甚至是致命的，并会导致身体各器官的功能丧失。手术损失造成的创伤，会使器官或组织之间通过瘢痕组织形成有害的附着。这种外科手术粘连，又会引发患者的疼痛、功能缺陷、肠梗阻、女性不孕和长期复杂的再次手术。

发明内容
本发明涉及能抑制和/或防止手术过程中形成的细胞增殖和粘连的组合物和方法。所述组合物可以包括阴离子单体或聚合物和能防止血小板活化和/或血小板聚集的化合物(比如，抗血小板剂)。在本发明一个方面，所述抗血小板剂可以和所述阴离子单体或聚合物共价连接以形成缀合化合物。该缀合化合物能与半固态载体如GELF0AM相混合，从而形成用于植入手术部位的装置。在本发明另外一个方面，所述阴离子单体/聚合物和抗血小板剂可以在阴离子聚合物/单体和抗血小板剂之间无共价连接的情况下存在于制剂中。本发明还涉及利用所述组合物来抑制导致纤维化和伴随并发症(如瘢痕形成和手术粘连)的侵润和增殖的方法。本发明所述组合物包括与抗血小板剂组合的分子量为约500道尔顿到约500，000 道尔顿的聚合物(或单体)，所述聚合物(或单体)在性质上为阴离子的并具有抗血小板损伤的性能，所述抗血小板剂如人类血小板中糖蛋白(GP)Ilb/IIIa受体的抑制剂，本发明证明所述组合物能有效抑制瘢痕、特别是手术粘连的形成，还证明所述组合物能抑制细胞侵润和硬膜外纤维化。所述组合物可用于抑制成纤维细胞侵润，从而调节伤口愈合过程和防止纤维化。所述组合物能抑制细胞增殖，细胞侵润，单核细胞和中性粒细胞向手术位点的侵润。所述阴离子聚合物或单体可包括硫酸葡聚糖、戊聚糖多硫酸酯以及氨基葡聚糖， 比如硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、和藻酸盐。这些分子能抑制成纤维细胞增殖、侵润或迁移。在一个实施例中，用在组合物中的阴离子聚合物可包括硫酸葡聚糖。所述抗血小板剂可以是合成化合物、蛋白质、多肽、或抗体。该抗血小板剂可以包括人类血小板中糖蛋白(GP) Ilb/IIIa受体的抑制剂，以及抑制血小板聚集的抗凝血剂。在一个实施例中，所述抗血小板剂可以包括Tirofiban (AGGRASTAT，Merck)，该Tirofiban是一种糖蛋白(GP) Ilb/IIIa抑制剂。本发明进一步涉及使用抑制性阴离子缀合物的方法，所述抑制性阴离子缀合物优选与结合有Tirofiban的硫酸葡聚糖部分一同使用，来抑制成纤维细胞的侵润和纤维化， 并因保持血小板来促进伤口愈合。本发明因此提供了抑制成纤维细胞侵润、神经胶质细胞侵润、和促进伤口愈合的方法。在一个实施方式中，所述抗血小板剂可以附着于硫酸葡聚糖分子，来抑制瘢痕形成和促进伤口愈合。本发明还提供了包括抑制性阴离子化合缀合物和抗血小板剂的组合物，以及施用该组合物以通过抑制神经胶质细胞侵润从而抑制瘢痕形成的方法。本发明还提供了包含有效量的抑制性缀合化合物的组合物，比如，包含硫酸葡聚糖-Tirofiban缀合物，和有效量的粘连蛋白以及药学上可接受的载体。


图1图示了匪2040抑制3T3细胞增殖；图2图示了匪2040抑制胶质瘤细胞增殖；图3图示了 NM2040抑制C3a和C5a形成；图4图示了 NM2040抑制C3a和C5a形成；图5图示了 NM2040抑制AP活化；图6图示了匪2040的抑制不影响血小板数量；图7图示了 NM2040抑制血小板损伤；图8图示了匪2040抑制中性粒细胞、单核细胞和血小板活化；图9图示了匪2040抑制大鼠椎板切除手术后的手术粘连；图10图示了 NM2040的合成和结构。图11图示了放置实验材料之前的大鼠椎板切除手术位点(L3)(左图)和匪2040 胶放置在L3椎板切除位点(右图)。图12图示了放置A.盐水、B.匪3014、或C.匪2040后两周的椎板切除位点，显示出盐水处理后出现厚且坚韧的硬膜外瘢痕，而匪3014或匪2040处理后出现硬膜上薄且易于去除的结缔组织。图13图示了匪2040处理在防止椎板切除后硬膜外瘢痕形成中与匪3014同样有效。数据显示每个处理实验组中3只动物的总评价分数的平均值士SEM。利用非参数数据的Mann-Whitney统计学测定处理组之间的差异。< 0. 05。图14图示了放置盐水和匪2040后两周椎板切除位点的矢状视图。盐水处理的动物出现瘢痕(箭头)。匪2040处理位点呈现没有韧性瘢痕的光滑区域。图15图示了放置盐水和匪2040后两周的椎板切除位点。盐水处理的动物脊髓附近出现瘢痕(来自两只动物的左边两个图)。而匪2040处理位点呈现没有韧性瘢痕的光滑区域。
具体实施例方式本发明涉及药物组合物，该药物组合物可以有效地抑制瘢痕形成，尤其有效抑制手术粘连。该组合物包括可以与防止血小板活化和/或血小板聚集的化合物(即抗血小板剂)混合或缀合的阴离子化合物，比如阴离子聚合物(或单体)。所述组合物可以防止特定位点上的纤维化和中性粒细胞和单核细胞侵润。该组合物可以有效抑制伴随有害愈合过程 (比如纤维化和瘢痕化)的细胞侵润。本发明的组合物还对抑制成纤维细胞侵润有效，从而调节愈合过程并防止纤维化。本发明所述的组合物还可以抑制神经胶质细胞的侵润，中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞的侵润。在一个实施例中，包含与抗血小板剂Tirofiban组合的阴离子聚合物的组合物可以抑制神经胶质细胞侵润、3T3细胞侵润、中性粒细胞和单核细胞侵润。因此，本发明教导了用于抑制瘢痕形成、纤维化、和手术粘连的多种材料。应用在本发明所述组合物中的阴离子化合物可以包括阴离子聚合物(和/或单体)，比如，硫酸葡聚糖(DX)和戊聚糖多硫酸酯(PS)、硫酸皮肤素(DS)、硫酸软骨素(CS)、 硫酸角质素(KS)、硫酸乙酰肝素(HS)、法安明(Fragmin)、和肝素(HN)。在合适的浓度下， 上述分子可以抑制成纤维细胞侵润或迁移。在一个实施方式中，本发明涉及使用DX和包含DX的分子和组合物的方法，以便抑制、防止或调节成纤维细胞的侵润和纤维化以及所有上述需要的治疗。根据本发明的硫酸葡聚糖的分子量可以大于约500道尔顿，硫含量可以大于大约2重量％。在一个实施例中， 硫酸葡聚糖的分子量可以为约500道尔顿到约500，000道尔顿，硫酸含量可以为大约12% 到约18重量％。在一个实施例中，所述抗血小板剂可以包括噻氯匹定和/或氯吡格雷。噻氯匹定 (美国罗氏公司以Ticlid进行销售)的假设作用机制为在活化的血小板中，选择性干扰对 GPIIb/IIIa复合物表达的ADP-诱导转化。噻氯匹定尤其应用在不能耐受阿司匹林的患者之中。它还可以抑制凝血酶、胶原蛋白、花生四烯酸、和血小板活化因子诱导的血小板凝集。 施用250mg剂量的噻氯匹定，一天两次，可以减少复合终点中风、心肌梗塞、或者血管性死亡的发生的大约30%。由于噻氯匹定使用会增加血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和中性粒细胞减少症的风险，噻氯匹定被更新药物氯吡格雷替代。氯吡格雷(以Plavix销售—— Bristol Myers)是另外一种ADP拮抗剂，可以抑制纤维蛋白原与其血小板受体糖蛋白IIb/ IIIa整合素的结合。但它并不直接修饰糖蛋白Ilb/IIIa复合物，说明氯吡格雷间接减少纤维蛋白原结合。在另外一个实例当中，所述抗血小板剂可以包括GPIIb/IIIa抑制因子。糖蛋白 Ilb/IIIa受体在激动剂的刺激后表达。所述受体与导致血小板聚集的多粘附配体分子结合，所述多粘附配体分子包括纤维蛋白原、vWF(在高剪切条件下，可能存在于狭窄动脉之中)、纤维链接粘连蛋白、玻连蛋白、和凝血酶致敏蛋白。血小板募集可以被抗GPIIb/ IIIa试剂抑制，所述抗GPIIb/IIIa剂比如单克隆抗体(c7E-Reoftx))、环肽序列(依非巴特 (Eptifibatide)-Integrilin)、和合成竞争性类似物(替罗非班(Tirofiban)-AGGRASTAT) Calvete, JJ.，血小板整合素GPIIb/IIIa 结构-功能相关。对其他整合素的更新参考。 Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine,1999. 222(1) p. 29 ；Gabriel, H. M.禾口 Ε· I. Oliveira, Role of abciximab in the treatment of coronary artery disease. Expert Opinion on Biological Therapy,2006. 6(9) :p. 935 ； Lai, H.等人，Integrins :novel therapeutic targets for cardiovascular diseases. Cardiovascular & Hematological Agents in Medicinal Chemistry,2007.5 (2) p. 109 ；Menozzi, A. , P.A.Merlini, 禾口 D.Ardissino, Tirofiban in acute coronary syndromes. Expert Review of Cardiovascular Therapy,2005. 3(2) :p. 193 ；Ringleb, P. A. , Thrombolytics, anticoagulants, and antiplatelet agents. Stroke,2006. 37(2) p. 312).单克隆抗体c7E3(Centocor 生产的Abciximab或ReoPro)抑制GPIIb/IIIa受体，已经接受了大量临床试验并获得临床使用批准。已显示其可防止血管损伤后的血栓形成，并可有效减少冠状动脉介入程序后的早期再闭塞(Expert Opinion on Biological Therapy, 2006.6(9) :p. 935)。Abciximab是BUMC常用药并在年度药物支出中位于前列(The Baylor Drug Newsletter,June 1998 ； 10(Crit Rev Immunol,1981. 1(4) :p. 321—66))。Abciximab 在血浆中的血浆半衰期较短，但该抗体可在治疗终止后长时间结合GPIIb/IIIa受体。已经开发了模仿精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的电荷和几何结构特征的非肽类拮抗剂。这些试剂都具有口服给药潜力，因此可以对慢性抗血小板治疗有效。 Tirofiban (MERCK以AGGRASTAT销售)，1998年5月得到临床应用的新药许可。现已发现天然产生的GPIIb/IIIa-拮抗剂多肽Eptifikitideantegrilin—— Millennium Pharmaceuticals)，并在体内和体外进行了表征。Eptifibatide是带有赖氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列而非精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环状七肽。在本发明一个实施例中，所述组合物可以包含阴离子聚合物和抗血小板剂通过共价连接而缀合的缀合物。比如，该缀合物可以包含和Tirofiki缀合的硫酸葡聚糖。该缀合物可以以有效量在需要位点上对受试对象施用，以抑制瘢痕形成和手术粘连。在另外一个实施方式中，缀合物可以包含阴离子聚合物和抗血小板剂的混合物。 比如，所述缀合物可以包含硫酸葡聚糖和Tirofiban的混合物。可以将该混合物以有效量在需要位点上对受试对象施用，以抑制瘢痕形成和手术粘连。本发明进一步提供了药物组合物，所述药物组合物包含在药学上可接受的载体中的阴离子聚合物或单体和抗血小板剂，还提供了施用该组合物以抑制瘢痕形成和纤维化从而抑制胶质细胞、成纤维细胞的非所需侵润和神经突起过生长的方法。本发明所述组合物及方法适于治疗动物，优选哺乳动物，更优选人。可以以已公开的任何方法，将治疗有效量的包含本发明缀合化合物的组合物施用于动物的病变。防止纤维化和细胞侵润的组合物本发明提供了用于抑制成纤维细胞侵润、胶质细胞侵润、神经突起过生长、中性粒细胞侵润、中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞侵润的组合物。尤其是，所述组合物在防止纤维化和瘢痕形成如手术粘连中是有效的。所述组合物中所用的阴离子聚合物应该优选为大于约lmg/ml的浓度，更优选为20-200mg/ml的范围。在一个实施例中，所述阴离子聚合物是硫酸葡聚糖，抗血小板剂是Tirofiban。在一个具体实施例中，硫酸葡聚糖的硫含量为至少约10重量％。可以将包含阴离子聚合物和抗血小板剂的组合物与载体或赋形剂混合，比如盐水和明胶海绵，以形成粘性液体或凝胶。应当理解的是，该阴离子聚合物和抗血小板剂可以与固态或者半固态赋形剂或载体相组合，比如糊剂、凝胶、泡沫或者片。该阴离子聚合物和抗血小板剂可以与载体或赋形剂在胶体悬浮液或混配物中混合；作为另一种选择，所述载体或赋形剂可以浸渍有形成所述组合物的缀合化合物。优选半固态载体包括葡聚糖胶，比如 HYSK0N-70 (Pharmacia)、INTERCEED (Johnson & Johnson)、天然胶原胶、和变性胶原胶，比如 GELFOAM(Upjohn)。一般适应症本发明所述组合物可以用做创伤、手术、感染(病毒或细菌)、代谢疾病、恶变、有毒试剂接触、以及其他增生性情况引起的细胞迁移或侵润的屏障物。用所述组合物包被器官或组织可以具有防止或预防作用。粘连抑制性组合物提供了优选的包被组合物。手术在一个实施方式中，通过对手术损伤施用本发明组合物可以抑制硬膜外 (或硬膜周)纤维化。所述组合物可以是溶液形式、与基底相结合、包被在载体蛋白或聚合物中。在一个实施方式中，该缀合化合物可以应用在载体或赋形剂中，比如糊剂、凝胶、或片。在另外一个实施方式中，本发明提供了抑制输卵管组织纤维化和瘢痕化的组合物和方法。尤其是，可以抑制手术后输卵管内部及周围损伤的纤维化和瘢痕化。感染或其他原因引起的输卵管纤维化，在25% -30%的情况下会导致不孕。盆腔侧壁粘连也会导致不孕。由于瘢痕组织在手术之后形成，因而单纯的手术切除粘连并非是足够的治疗方法。因此，本发明在治疗不孕症中有重要应用。其他手术适应症包括但不限于腹部手术、关节手术、肌腱手术、切除盆腔侧壁粘连手术、腹腔手术、胸部手术、血管手术、和心脏手术，特别是旁路手术、瓣膜置换手术、心血管手术、或其他心脏直视手术。在另外一个实施方式中，本发明所述的组合物可以用于抑制植入物周围的纤维化的方法，所述方法包括施用包含治疗有效量的阴离子聚合物和抗血小板剂的组合物。需要抑制瘢痕形成和纤维化的植入物的实例包括、但不仅限于，肾造瘘管、腹腔引流管、人工髋关节、人工心瓣膜、外周神经修复物和其他假体和静脉导管。植入物可以用本发明提供的组合物包被或浸润处理。对关节纤维化病变的治疗关节病变可通过手术过程矫正，该过程可引发粘连。所述过程的缺点在于在愈伤过程中会引发进一步纤维化。施用本发明包含阴离子聚合物和抗血小板剂的组合物可以抑制关节中的后续纤维化和粘连的形成，从而增加治疗成功的几率。施用模式利用本领域公知方法，可以将本发明所述组合物与胶原蛋白凝胶混合， 以制作可植入装置，用以防止手术后形成的粘连。本发明所述组合物会以任何适当的方式放置在所需靶位点及周围。这可以通过如以下方法、但不仅限于以下方法实现局部灌流或者手术应用、注射、气溶胶、经导管方法、或经植入物的方法，所述植入物作为有孔隙、无孔隙、或者胶状材料，包括膜，比如硅橡胶膜或纤维。在优选实施方式中，植入物用本发明的组合物包被或浸润。经组合物处理的聚合物植入物可以应用或者插入所需治疗位点。所述聚合物可以有多种组成、孔隙大小、和几何结构。可以使用的聚合物包括、但不仅限于由硝酸纤维素膜、聚酸酐、和丙烯酸聚合物制成的聚合物。本发明提供了通过手术过程的包含阴离子聚合物和抗血小板剂的组合物的应用。 该组合物可以应用于手术创伤。该组合物可以直接应用于组织损伤位点，以包被整个器官或封闭手术切口。在合适的情况下，该组合物可以于关节镜过程施用。实施例包括以下实施例来阐释本发明的优选实施方式。本领域技术人员应理解的是，实施例中所公开的技术以及本发明人发现的下述代表性技术在本发明的实施中起到良好作用，因此可以考虑构成用于其实施的优选模式。可是，本领域技术人员在本发明的启示下应当理解，对所公开的具体实施方式
可做出多种变化，且仍能获得相似或相同结果而不背离本发明的精神和范围。实施例-1NM2040 抑制 3T3 增殖约50，000个细胞接种在96孔ELISA板中。细胞在含10% FCS的DMEM培养基中生长5天，之后对细胞进行Cy Quant分析，并利用降低的荧光强度来测量对细胞增殖的抑制。为在细胞增殖分析中评价各个浓度的匪2040的效果，用1 μ g/ml到600 μ g/ml的浓度处理培养物。将总荧光强度对浓度作图。实施例-2NM2040抑制神经胶质瘤细胞增殖本实验用以证明匪2040是否能抑制细胞增殖。在6孔板中，放置直径为6mm的克隆环，制备60 μ 1等分试样的细胞悬液(含320，000个细胞/ml的C6细胞的储液)，并将其放置在克隆环中的6孔板每个孔的中央。4小时后，去除培养基并将细胞与含有或不含有所述化合物的Opti-MEM IX培养基一起温育。这些培养物在37°C和10%的CO2下温育 5天，之后拍照，如图2所示。该化合物效果表现为剂量依赖性，在3 μ g/ml时显示了最大效果。第1幅图为对照组(未处理)，第2幅图为3mg/ml，第3幅图为1. 5mg/ml，第4幅图为0. 75mg/ml，第5幅图为0. 36mg/ml。该化合物匪2040在所有剂量下均表现出抑制，在约 lmg/ml的浓度具有最大效果。实施例-3NM2040抑制C3a和Cfe的形成受伤部位产生趋化肽，趋化肽可以将炎症细胞吸引到受伤位点从而引发炎症。通过检测来确定该化合物NM2040是否可以抑制C3a和C5a的产生。该化合物在37°C与血液在旋转管圈中温育。将健康供体的全血采集到含有5单位肝素/毫升全血的聚丙烯管中。 该全血用血浆裂解物(Plasmalyte)I 1稀释，并等分为进行药物处理或不进行药物处理的2ml等分试样。在4mm直径的PVC管加入含2. Oml的肝素化的人血，用小段硅胶管封闭成圈。样品和对照管圈在37°C水浴中垂直旋转2小时。温育过后，血样转移至硅化印pendorf 管中。该样品分成2个等分试样一个等分试样用以进行流式细胞术研究，另一个等分试样离心分离血浆以测量C3a和C5a。该血浆样品用样品稀释缓冲液稀释至5%，并用ELISA分析试剂盒(Quidel Corporation, San Diego CA)按厂商说明测定C3a和C5a的量。如图3 和图4所示，匪2040能够以剂量依赖的方式防止C3a和Cfe产生。C3a和Cfe是导致中性粒细胞和单核细胞的趋化的趋化肽。如图5所示，匪2040抑制替代途径的激活。在同样实验中，还评估了匪3015。该化合物是硫酸葡聚糖和Tirofiban的混合物。实施例-4NM2040抑制血小板损伤将经管圈的血液等分试样用荧光标记抗体染色，用以流式细胞术研究。血小板用 FITC标记的⑶61和PE标记的⑶62P染色。在典型方法中，将20 μ 1的各标记抗体加入到含50 μ 1全血的100 μ 1染色缓冲液中。20分钟之后，加入2. Oml的染色液并让红血细胞裂解20分钟。该溶液离心并将细胞沉淀用PBS清洗，并悬浮在0.5ml多聚甲醛溶液中。利用 CellQuest, BD-LSR I对该样品进行细胞流式术，数据用WinList 5.0分析。使用Ln Median 计算中性粒细胞和单核细胞的CDllb染色的变化。检测血小板总数。如图6(下图)和图 7所示，匪2040不影响血小板。FITC阳性血小板是未受损伤的血小板，落入正常的血小板区域。相反，匪3014这一分子量为40，000道尔顿、硫酸含量为18重量％ -20重量％的硫酸葡聚糖，引起总血小板中超过95%的损失(上图)。实施例-5匪2040抑制中性粒细胞、单粒细胞和血小板活化将经管圈的血液等分试样用荧光标记抗体染色，用以流式细胞术分析。例如中性粒细胞用FITC标记的⑶15和PE标记的⑶lib抗体标记，单核细胞用FITC标记的⑶14和 PE标记的⑶lib抗体染色，血小板用FITC标记的⑶61和PE标记的⑶62P染色。在典型方法中，将20 μ 1各标记抗体加入到含50 μ 1全血的100 μ 1染色缓冲液中。20分钟之后， 加入2. Oml染色液并让红血细胞裂解20分钟。该溶液离心并将细胞沉淀用PBS清洗，并悬浮在0. 5ml多聚甲醛溶液中。利用CellQuest，BD-LSR I对该样品进行细胞流式术，数据用 WinList 5.0分析。使用Ln Median计算中性粒细胞和单核细胞的⑶lib染色的变化。量化百分数门控双标记细胞的血小板群体。如图8所示，所有三种细胞类型均显示了对细胞活化的显著抑制。实施例-6匪2040抑制大鼠椎板切除的脊髓与周围组织的粘连(硬膜外纤维化)据信与脊髓相连的瘢痕组织会导致椎板切除术后的长期反复疼痛。硬膜外纤维化是指椎板切除术后形成的瘢痕组织。椎板切除是指椎板的背部手术。瘢痕组织在椎板切除位点内形成并将竖脊肌的下表面与硬脊膜的后部和侧部表面相连，以及与通过硬脊膜的神经根相连。在大鼠椎板切除手术后检查硬膜外纤维化。在本模型中，在第三腰椎(U)和第五腰椎(U)处进行椎板切除手术，继而将测试剂应用到椎板切除手术位点。然后，通过大体解剖观察来检测椎板切除手术位点的纤维化。在腰椎L3和L5处进行椎板切除手术，提供每个动物内的自身对照。制备明胶海绵-NM2040混合物，并将其用于大鼠的椎板切除手术位点。Lewis近交系大鼠用异氟烷麻醉。切开背部皮肤，将椎旁肌肉与腰椎L2到L6棘突分离，以暴露L3和L5。去除L3和L5 的棘突，并去除腰椎板以建立矩形椎板切除缺陷区。将测试材料放置到椎板切除手术位点。 通过缝合表面筋膜使上覆椎旁肌肉在位点处闭合，并将皮肤切口以伤口夹闭合。两周后，将动物进行整体评估。大鼠用异氟烷麻醉，手术位点通过切割皮肤重新打开并将椎旁肌肉分离。该位点和组织用0到2评分。0是“没有粘连”，1是松散粘连，2是韧性粘连。评估之后，大鼠用过量麻药处死。在所有动物中，皮肤切口和底层筋膜和椎旁肌肉愈合良好。在所有椎板切除位点，椎旁肌肉的分离暴露出瘢痕组织层。以测试材料处理的位点显示出很少有粘连或完全没有粘连，并且该组中绝大部分评分为0或者0. 5 (总分为2、。椎板切除手术位点本身尺寸没有可辨别的变化；位点边沿光滑。盐水处理的位点作为阴性对照。当瘢痕组织去除时，该位点和周围开始出血，并且由于粘连组织的形成，该位点尺寸变小。将 NM2040移入椎板切除位点使分数显著低于植入盐水对照组。这些结果表明NM2040是减少大鼠椎板切除模型中的硬膜外纤维化的有效试剂。匪2040制剂由盐水中10%明胶海绵粉末、20mg/ml匪2040组成。大鼠硬膜外纤维化模型清楚显示匪2040的存在通过抑制纤维化提供了实质治疗益处。如图9所示，匪2040抑制大鼠椎板切除模型的手术粘连。实施例-7NM2040 的合成硫酸葡聚糖已经被应用于防止手术粘连。该材料活化血小板。如图10所示，硫酸葡聚糖与Tirofiban缀合，所述Tirofiban具有血小板保持功能。这种缀合化合物如下制备。在25mL双颈圆底玻璃烧瓶中，加入l.Og硫酸葡聚糖、2. OmL水和10 μ L冰乙酸。将该内容物室温过夜搅拌。最终混合物呈清澈溶液。在另一 IOmL单颈烧瓶中，加入13mg的 TirofibanUmL甲醇水(1 1)混合物、和IOyL的DMS0。将该内容物室温混合。最终混合物呈透明溶液。将步骤2的溶液加入到步骤1的溶液中，搅拌2. 5小时。将315mg氰基硼氢化钠经过15分钟分批加入，让反应进行48小时同时用HPLC监测。最终溶液呈透明溶液。通过膜滤器进行第一过滤，继而通过尺寸排阻柱，从而进行缀合物的纯化。在48小时结束时，将溶液混合物以500 μ L分批转移到过滤器(MWC0 3000, MICRON YM-3)上并以 4000rpm(1431g/RCF)离心以减少总体积至250 μ L。分子尺寸更小的分子如氰基硼氢化钠和多余Tirofiban通过过滤器，而硫酸葡聚糖-Tirofiban的缀合产物会保留未被滤过。加入250 μ L新鲜高纯水，重复离心程序以除去小分子量杂质。重复上述过程四次以上以确保杂质完全被清除。将250 μ L最终体积转移到印pendorf管中，-80°C冷冻，并冻干M小时，以得到白色固状材料。将样品称重并重新溶解在最少量的高纯水中，利用尺寸排阻柱色谱法进行进一步纯化。将水中Wkphadex G-IO浆液倒入玻璃柱O. 5x75cm)，装柱高度为 36cm。使用高纯水为移动相，流速为0.5mL/分钟。柱的空隙容积是约720mL。用自动流分收集器(Foxy 200)每10分钟收集5mL的流分。每个流分用UV-VIS分光光度计检测。基于Tirofiban的UV分布相似性储集流分4_9。然后将30mL储集量转移到塑料管中，_80°C 冷冻，并冻干得到白色粉末。利用UV-Vis分光光谱法获得缀合物的成分的摩尔比例。用纯Tirofiban作出标准曲线。各种浓度的Tirofiban水溶液在波长λ max275nm处以UV-Vis分光光度仪读数。下表显示吸光度读值。然后测量缀合物的吸光度。对于8.33;3mg/mL缀合物浓度的溶液，A275 为0. 34AU。这与硫酸葡聚糖-Tirofiban缀合物的1:1.2的摩尔比例一致。将Tirofiban 和硫酸葡聚糖-Tirofiban缀合物过反相C18 HPLC柱，以确定缀合物中的硫酸葡聚糖是否会导致Tirofiban峰位置的移动。在C18-HPLC中以280nm滤镜检测Tirofiban。因为硫酸葡聚糖本身不带有芳香基团，所以在^Onm下不表现过多吸收。将20 μ L等分试样的Tirofiban和缀合物注入到柱中。将甲醇水(1 1)混合物以0. 75mL/分钟的流速作为洗脱剂。硫酸葡聚糖-Tirofiban缀合物和非缀合的Tirofiban的曲线如图所示。由于其显著的高极性，缀合物比非缀合Tirofiban更早洗脱。将缀合物溶于的0. 5mL重水(D2O)中制备样品。在常温下用IN0VA-400MHZ仪器记录NMR。最终缀合物的分离产率>95%。根据其NMR数据，该缀合物具有以下结构。NMR显示了在对应糖质子的3. 5-5. 5ppm区域存在硫酸葡聚糖峰，而Tirofiban的芳香质子出现在 7. O和7. 2ppm。Tirofiban的烷基质子出现在1至2ppm。硫酸葡聚糖-Tirofiban缀合物的化学名称为硫酸葡聚糖和2- ( 丁烷-1-磺酰氨基)-3- [4- (4-哌啶-4-基-丁氧基)-苯基]-丙酸的缀合物。在这个结构中，Tirofiban的二级氨基连接于硫酸葡聚糖还原端的糖单体的C-I碳上。实施例8匪2040抑制椎板切除后的硬膜外纤维化成年Lewis大鼠椎板切除手术后检查硬膜外纤维化。在第3 (L3)和第5 (L5)腰椎处进行椎板切除。将测试剂凝胶应用在一个位点，将盐水(对照)应用在另外一个位点。 两周之后，如上所述通过大体解剖来检查椎板切除位点的纤维化。简单来说，将大鼠麻醉。 切开背部皮肤并将椎旁肌肉与腰椎L2到L6处棘突分离，以暴露L3和L5。去除L3和L5 棘突和椎板，形成一个约5mmX2mm的矩形椎板切除术缺陷区(图1IA)。将测试材料NM2040 或载质按照随机编码程序放置在椎板切除位点(图11B)。NM2040制剂由无菌盐水中10% 凝胶泡沫粉末、20mg/ml终浓度组成。混合物加入到高压灭菌过的注射器中，冷却至室温后放入椎板切除位点。将椎旁肌肉上面的筋膜采用5-0聚二氧杂环己酮PDS可吸收缝合线 (Ethicon)缝合，并且皮肤切口用7. 5mm的Michel伤口夹封闭。两周之后，将动物麻醉并进行整体评估。对于整体评估，通过切割皮肤并将椎旁肌肉分离，将伤口位点重新打开。硬膜外瘢痕形成为测试材料和硬脊膜之间的结缔组织。深层瘢痕的厚度和韧性用钝性分离评估，并在0-2之间打分。O为“没有粘连”且硬膜清晰可见，1为覆盖硬膜的可以轻易去除的薄且松散的结缔组织，2为厚且致密的韧性粘连，不撕裂硬膜很难、甚至不能去除。不需要具有处理任何椎板切除位置的知识即完成打分。图12显示，匪2040和匪3014同样均可有效防止硬膜外纤维化。简单来说，在所有动物中，皮肤切口和下面的筋膜以及椎旁肌肉均愈合良好。在所有椎板切除位点，椎旁肌肉的分离可暴露瘢痕组织层。盐水处理的位点作为阴性对照。盐水处理的位点具有致密坚韧的粘连。将该瘢痕组织去除之后，该位点开始流血，在去除瘢痕组织时硬膜撕裂。如之前观察的，本发明的阳性对照材料匪3014处理的位点在硬膜之上具有薄且可轻易去除的结缔组织，甚至没有粘连。如同NM3014处理位点，NM2040处理位点也显示了硬膜上的薄且可轻易去除的结缔组织，甚至没有粘连。图13显示了整体评估检测，确认了匪2040抑制大鼠椎板切除模型中的手术粘连。 盐水处理过的所有椎板切除位点均具有厚且坚韧的硬膜外瘢痕，评分为2。相反，匪3014或匪2040凝胶处理过的椎板切除位点得到的平均评分分别为约0. 75和0. 5。与载质处理相比，匪3014或匪2040处理可显著降低粘连评分。这些结果显示匪2040是减少大鼠椎板切除模型的硬膜外纤维化的试剂。大鼠硬膜外纤维化模型清楚证明，NM2040的存在通过抑制纤维化提供了显著治疗益处。
图14显示盐水和匪2040处理大鼠的MRI图像。如第二图所示，与盐水对照组相比箭头所在区域的组织较为光滑。图15显示L3水平脊柱的组织切片。如图所示，匪2040处理的切片与对照组相比呈现光滑填充(箭头)，而对照组则在脊髓上出现骨性组织。利用标准方法以Masson三色染色法进行组织学研究。本发明的初步数据表明与Tirofiban缀合的硫酸葡聚糖保持了硫酸葡聚糖的抗成纤维细胞增殖性和抗粘连性，从而防止椎板切除后的粘连。与NM3014相比，NM2040不会损害血小板。
权利要求
1.一种抑制哺乳动物的成纤维细胞和/或神经胶质瘤细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括对哺乳动物施用组合物，其中所述组合物包括有效抑制所述哺乳动物成纤维细胞和神经胶质瘤的细胞增殖的量的阴离子聚合物和抗血小板剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗血小板剂与所述阴离子聚合物共价连接。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述阴离子聚合物选自硫酸皮肤素、硫酸软骨素、 硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸盐、和透明质酸。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有大于约2%的硫酸含量。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有范围为约500道尔顿至约 500，000道尔顿的平均分子量。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述阴离子聚合物是线性聚合物或交联聚合物中的至少一种。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物在腹部手术、关节手术、肌腱手术、切除盆腔侧壁粘连手术、腹膜手术、胸部手术、血管手术、心脏手术、心脏旁路手术、心脏瓣膜置换手术、心内直视手术、椎板切除手术、输卵管手术、整形外科手术、关节炎&骨关节炎、或治疗颞下颂关节功能失调的手术的手术后程序后施用。
8.一种抑制哺乳动物的单核细胞或巨噬细胞侵润的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的需要抑制单核细胞或巨噬细胞侵润的手术部位施用有效抑制单核细胞或巨噬细胞侵润的量的阴离子聚合物、和有效防止需要抑制单核细胞或巨噬细胞侵润的部位处血小板活化的量的试剂。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述阴离子聚合物选自硫酸皮肤素、硫酸软骨素、 硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸盐、和透明质酸。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述抗血小板剂与所述阴离子聚合物共价连接。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有大于约2%的硫酸含量。
12.如权利要求8所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有范围为约500道尔顿至约 500，000道尔顿的平均分子量。
13.如权利要求8所述的方法，其中所述阴离子聚合物是线性聚合物或交联聚合物中的至少一种。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述组合物在腹部手术、关节手术、肌腱手术、切除盆腔侧壁粘连手术、腹膜手术、胸部手术、血管手术、心脏手术、心脏旁路手术、心脏瓣膜置换手术、心内直视手术、椎板切除手术、输卵管手术、整形外科手术、关节炎&骨关节炎、或治疗颞下颂关节功能失调的手术的手术后程序后施用。
15.一种抑制哺乳动物的中性粒细胞侵润的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的需要抑制中性粒细胞侵润的手术部位施用有效抑制中性粒细胞侵润的量的阴离子聚合物、和有效防止需要抑制中性粒细胞侵润的部位处血小板活化的量的试齐LU
16.如权利要求15所述的方法，其中所述阴离子聚合物选自硫酸皮肤素、硫酸软骨素、硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸盐、和透明质酸。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述抗血小板剂与所述阴离子聚合物共价连接。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有大于约2%的硫酸含量。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有范围为约500道尔顿至约 500，000道尔顿的平均分子量。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述阴离子聚合物是线性聚合物或交联聚合物中的至少一种。
21.如权利要求15所述的方法，其中所述组合物在腹部手术、关节手术、肌腱手术、切除盆腔侧壁粘连手术、腹膜手术、胸部手术、血管手术、心脏手术、心脏旁路手术、心脏瓣膜置换手术、心内直视手术、椎板切除手术、输卵管手术、整形外科手术、关节炎&骨关节炎、 或治疗颞下颂关节功能失调的手术的手术后程序后施用。
22.—种抑制哺乳动物的神经突过生长的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的需要抑制神经突过生长的部位施用有效抑制神经突过生长的量的阴离子聚合物、和有效防止所述部位处血小板活化的量的试剂。
23.如权利要求21所述的方法，其中所述阴离子聚合物选自硫酸皮肤素、硫酸软骨素、 硫酸角质素、硫酸乙酰肝素、肝素、硫酸葡聚糖、法安明、多聚硫酸戊聚糖、藻酸盐、和透明质酸。
24.如权利要求21所述的方法，其中所述抗血小板剂与所述阴离子聚合物共价连接。
25.如权利要求21所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有大于约2%的硫酸含量。
26.如权利要求21所述的方法，其中所述阴离子聚合物具有范围为约500道尔顿至约 500，000道尔顿的平均分子量。
27.如权利要求21所述的方法，其中所述阴离子聚合物是线性聚合物或交联聚合物中的至少一种。
28.如权利要求21所述的方法，其中所述组合物在腹部手术、关节手术、肌腱手术、切除盆腔侧壁粘连手术、腹膜手术、胸部手术、血管手术、心脏手术、心脏旁路手术、心脏瓣膜置换手术、心内直视手术、椎板切除手术、输卵管手术、整形外科手术、关节炎&骨关节炎、 或治疗颞下颂关节功能失调的手术的手术后程序后施用。
29.—种抑制哺乳动物的肿瘤细胞生长和侵润的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的需要抑制肿瘤细胞生长的部位施用有效抑制肿瘤细胞生长的量的阴离子聚合物和量的抗血小板剂。
30.如权利要求四所述的方法，其中所述肿瘤细胞的类型选自神经胶质瘤细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、食管癌、泌尿膀胱癌、黑色素瘤、白血病、 和淋巴瘤。
31.如权利要求四所述的方法，其中所述肿瘤是原发性肿瘤的转移瘤。
32.如权利要求四所述的方法，其中所述肿瘤来自实体瘤、非实体瘤、或者淋巴瘤。
33.如权利要求四所述的方法，其中所述肿瘤为恶性肿瘤或肉瘤。
34.如权利要求四所述的方法，其中需要抑制植入物周围的肿瘤细胞生长。
全文摘要
一种抑制哺乳动物的成纤维细胞和/或神经胶质瘤细胞的细胞增殖的方法，所述方法包括对哺乳动物施用组合物，其中所述组合物包括有效抑制所述哺乳动物成纤维细胞和神经胶质瘤的细胞增殖的量的阴离子聚合物和抗血小板剂。
文档编号A61K31/737GK102405050SQ201080010061
公开日2012年4月4日 申请日期2010年2月17日 优先权日2009年2月17日
发明者R·班萨尔 申请人:诺沃姆德治疗公司