一种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂及其合成方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明公开了一种能够诱导细胞凋亡的新型小分子抗癌药物，具体地说，是一种 凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据世界卫生组织的数据，癌症是人类死亡的主要原因之一，2012年820万人死于 癌症。据估计，二十年之后癌症的发病率将从每年1400万例上升至2200万例。癌症治疗对人 类来说一直是巨大的挑战，目前癌症治疗方法包括手术切除、化疗、放射性治疗、临终关怀 等，但无论是哪种方式都很难彻底治愈。在过去的几十年间，随着医药技术的进步，癌症治 疗手段也在不断进步和发展。但是，现有的抗癌药物有着各种各样的局限性，这也是癌症治 疗中需要逾越的巨大障碍。
[0003] 当今应用在癌症临床治疗的大部分细胞毒疗法(包括化疗和放射治疗)都是基于 诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。细 胞凋亡与细胞坏死不同，它并不是病理条件下自体损伤，而是为更好地适应生存环境而主 动争取的一种死亡过程。凋亡通路功能紊乱是癌症重要的病理学特征，而癌细胞对各种细 胞毒刺激产生耐受，从而使得细胞凋亡机制失效，是当今许多癌症治疗临床应用失败的原 因。过去二十年的研究表明，凋亡抑制蛋白（IAPs)是细胞凋亡的关键调节子，以凋亡抑制蛋 白为靶点，开发能够诱导细胞凋亡的新型小分子抗癌药物成为癌症研究的热点。
【发明内容】
[0004] 针对上述问题，本发明的目的是提供一种具有较好抗癌效果的凋亡抑制蛋白类肽 拮抗剂本发明还提供该拮抗剂的制备方法。
[0005] 针对上述问题，本发明提供的第一个技术方案是这样的：
[0006] -种凋亡抑制蛋白的类肽拮抗剂，其结构式如式1所示：
[0007]
[0008] 其中：?选自下述取代基的其中之一：
[0009]
[0010] R2选自下述取代基的其中之一：
[0011]
[0012] 上述X选自？、(：1、8广]^、016的其中之一；
[0013] Y选自 S或0;
[0014] 式1〇
[0015] 本发明的第二个技术方案是提供该凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，该方法 依次包括下述步骤：
[0016] 1)-1 〇~15 °C下，将甲磺酰氯、DMAP、有机碱加入至中间体A的氯代烃溶液中，搅拌2 ~60分钟，反应液用氯代烃稀释，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，无 需进一步纯化，得到中间体B。在-10~15°C下，将NaH加入至Boc-Cys-ΟΗ的溶液中，悬浮液搅 拌1~60分钟的反应液，再将中间体B的溶液加入至反应液中，混合室温搅拌0.5~10小时， 浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃取后， 合并有机相后，再经水洗涤，干燥，减压浓缩，所得粗产品过柱纯化，得到淡黄色油状中间体 C；
[0017] 其中，所述的甲磺酰氯、DMAP、中间体A、NaH、Boc-Cys-〇H的摩尔比为:0.9~5:0.05 ~3:1:1.6~10:0.8~5;
[0018] 2)将金属催化剂加入至中间体C的极性溶液中，悬浮液在H2中搅拌过夜，反应完毕 后，过滤，滤液减压浓缩，得到淡黄色油状中间体D;_10~15°C下，将缩合剂加入至中间体D 的氯代烃溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌4~72小时，反应完毕后，将反应液浓缩至 一半体积，依次经过弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干燥，浓缩，纯化，得到无色油状物中 间体E;
[0019 ]其中：所述的缩合剂、中间体D的摩尔比为:0.8~20:1;
[0020] 3)-10~15 °C下，将TIPS加入至中间体E的氯代烃溶液中，再加入TFA，混合液搅拌 0.5~10小时，蒸干溶剂，收集水相层，残留物用水稀释，再用乙醚洗涤两次，再与收集到的 水相层合并，干燥，得到中间体F。将其溶于MeCN/H 20中，加入Boc2〇、有机碱，混合液室温搅拌 过夜，浓缩，分别收集有机相和残留液，残留液用水稀释，调节pH值至酸性，采用有机溶剂萃 取后，合并有机相后用水洗涤，洗剂、干燥，得到中间体G;
[0021] 其中：所述的TIPS、中间体E、B〇C2〇摩尔比为:0.1~10:1:0.9~3;
[0022] 4)-10~15°C下，将中间体G溶于有机溶剂中，加入芳香胺、缩合剂和添加剂，然后 加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，然后反应液依次弱酸洗、弱碱洗、饱和食盐水洗涤，干 燥，浓缩所得粗产品过柱纯化，得到无色油状物中间体Η。
[0023] 其中，所述的中间体G、芳香胺、缩合剂、添加剂的摩尔比为1:0.9~10:0.9~20: 0.1~20;
[0024] 5) -10~15 °C下，将TFA加入至中间体Η的氯代烃溶液中，混合液搅拌0.1~5小时， 浓缩得到中间体I;
[0025] 6)-10~15°C下，将叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂和添加剂加入至中间体I的 溶液中，再加入有机碱，混合液室温搅拌过夜，依次用弱酸溶液、弱碱溶液、饱和食盐水洗 涤，干燥，浓缩得到粗产品J; -1 〇~15 °C下将此粗产品溶于氯代烃溶液中，加入TFA，混合液 搅拌0.1~5小时，浓缩，再纯化，冷冻干燥，得到白色固体成品K。
[0026] 其中，所述的中间体I、叔丁氧羰基保护的氨基酸、缩合剂、添加剂的摩尔比为：1: 0.95~5:0.95~20:0.2~20。
[0027]优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的有机碱为三乙胺或 吡啶、或DBU、或DIEA、或N-甲基吗啉。
[0028]优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的有机金属催化为雷 尼镍水悬浮液、或钯催化剂。
[0029] 优选的，上述的缩合剂为Β0Ρ、或DCC、或EDCI、或DIC、或PyBOP、或TBTU、或HBTU、或 HATU、或TATU。
[0030] 优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的添加剂为HOBt、或 HOOBt、或HOSu。
[0031] 优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的芳香胺为二苯基甲 胺、或苯甲胺、或5，6，7,8-四氢-1-萘胺、或(R)_2,3-二氢-1H-讳-1-胺、或(S)-萘-2-基(苯 基）甲胺、或2-苯基乙胺、或2-(三氟乙基)苯甲胺、或4-苯基_1，2,3，_噻二唑-5-胺、或3-甲 基-1-苯基-1H-吡唑-5-胺、或(4-氟代)苯甲胺、或(4-氯代)苯甲胺、或(4-溴代)苯甲胺、或 (4-甲基)苯甲胺、或(4-甲氧基)苯甲胺、或2-呋喃甲胺、或2-噻吩甲胺。
[0032] 优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的叔丁氧羰基保护的 氨基酸为N-叔丁氧羰基-L-丙氨酸、或(S)-2_(叔丁氧羰基)氨基丁酸、或(S)-2_((叔丁氧羰 基）甲基氨基)丙酸、或(S)-2-((叔丁氧羰基）甲基氨基)丁酸。
[0033] 优选的，上述的凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂的制备方法，所述的中间体A的结构式 为
L)l I 〇
[0034] 本发明的最后一个技术方案是凋亡抑制蛋白类肽拮抗剂作为抗肿瘤药物的应用。
[0035] 与现有技术相比，本发明的提供的技术方案与XIAP-BIR3的结合亲和力强，是一种 新型、高效的XIAP类肽拮抗剂，具有较好抗癌效果，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0036] 图1是化合物K1的1H NMR检测谱图；
[0037] 图2是化合物Κ2的1H NMR检测谱图；
[0038] 图3是化合物Κ3的1H NMR检测谱图；
[0039] 图4是化合物K4的1H NMR检测谱图；
[0040] 图5是化合物K5的1H NMR检测谱图；
[0041 ] 图6是化合物Κ5与XIAP-BIR3竞争性结合抑制曲线。
【具体实施方式】
[0042]下面结合【具体实施方式】，对本发明的权利要求做进一步的详细说明。
[0043] 所有试剂未经特别说明，均为市售分析纯，无进一步纯化，直接使用。无水无氧反 应的玻璃仪器在使用前，在烘箱中干燥，反应在Ar保护下进行。溶剂重蒸均在Ar保护下进 行，THF在金属钠和二苯甲酮的条件下干燥，二氯甲烷、乙酸乙酯用氢化钙干燥。柱层析使用 63~200目硅胶，薄层层析使用Merck TLC silica gel 60 F254塑料色谱板，用254nm紫外 光照、或碘蒸气、或2%茚三酮的乙醇溶液显色检测。核磁共振谱使用Bruker AVANCE III 400NMR谱仪测定，化学位移值以ppm为单位记录。质谱使用LCT Premier XE型飞行时间质谱 仪测定。旋光值用JASCO P-1010旋光仪测定。
[0044] 高效液相色谱(HPLC)条件：（1)制备型HPLC:Perkin Elmer Series 200UV/VIS检 测器;Perkin Elmer Series 200二相栗;真空除气器;Gilson FC203b馏分接收仪；（2)分析 型HPLC:Perkin Elmer Series 225自动进样器；Perkin Elmer Series 220UV/VIS检测器； Perkin Elmer Series 200四相栗;真空除气器。流动相：（1)流动相A:水+0.045%TFA; (2) 流动相B: 10 % 水+90 % 乙腈+0 · 038 % TFA。
[0045] 实施例1
[0046]中间体A的合成方法如下：
[0047]
5 °
[0048] (S) -1 -苄基-5-氧代吡咯烷-2-羧酸(2)
[0049]
[0050]将三乙胺（38mL，0 · 273mol)加入至L-谷氨酸（20 · 0g，0 · 140mo 1)和苯甲醛（17 · 4g， 0.160mol)的甲醇溶液(200mL)中。混合物室温搅拌1小时后，将溶液温度降低至0°C，然后将 NaBH4(5.67g，0.150mol)缓慢加入至反应液中。搅拌2小时后，将反应液倒入冰的4M HC1溶 液(50mL)中。将所形成的悬浮液减压浓缩和加热至固体全部溶解。冷却一段时间后，过滤得 到的固体便是化合物1。无需纯化，可直接进行下一步反应。将1的水溶液(300mL)加热至回 流，搅拌过夜。将反应液冷却至室温，用二氯甲烷萃取3次，有机相用硫酸镁干燥，过滤，减压 浓缩，粗产品过柱纯化(流动相:从环己烷/乙酸乙酯= 1/1至二氯甲烷/甲醇= 15/1)，得到 无色油状物2 (17.4g，三步总产率为58 % )
[0051] 4 Mffi(400MHz，CDCl3):Sll.l0(br，lH) ,7.35-7.22(m，5H)，5.17(d，J = 14.8Hz， 1H),4.05-3.98(m，2H)，2.70-2.61(m，lH)，2·56-2.48(m，lH)，2.35-2.24(m，lH),2.21-2.14 (m,1H).
[0052] (S)-1-苄基-5-氧代吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(3)
[0053]
[0054] 在Ar保护和0 °C下，将草酰氯(6.40mL，70.0 mmo 1)的乙腈溶液(5.2mL)加入至乙腈 (40mL)和DMF(15mL)的混合溶剂中，搅拌15分钟，加入化合物2 (14.8g，70.0 mmo 1)。再搅拌15 分钟后，加入叔丁醇（16.2mL，0.170mo 1)的吡啶（16.5mL)溶液。混合液室温搅拌15小时。反 应完毕后，用20%KHC03溶液（150mL)淬灭反应。有机相用乙醚(2X150mL)萃取，然后依次用 1M HC1溶液(2 X 100mL)、饱和碳酸氢钠溶液、饱和食盐水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，浓缩， 所得粗产品蒸馏纯化(〇. 〇7mbar，155 °C)，得到白色固体3 (11.24g，60 % )。
[0055] 咕 NMR(400MHz，CDC13):S7.25-7.12(m，5H)，4.97(d，J= 14.7Hz，1H)，3.88((1, J = 14·8Ηζ，1Η),3.82-3.74(m，lH)，2.51-2.42(m，lH),2.35-2.27(m，lH)，2.18-2.07(m，lH)， 1.98-1.90(m,lH),1.35(s,9H).
[0056] (S)-1-苄基-5-硫代吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(4)
[0057]
[0058] 将· / g，ZU·ummol JOT二狐，仕Η训八王?1 甘糊1〇·9g，40·Ommol)的 THF溶液(400mL)中。室温搅拌8小时，过滤，所得固体用乙醚(500mL)洗涤。将滤液浓缩，残留 物溶于乙醚（250mL)，依次用20%KHC03溶液（170mL)和饱和食盐水（170mL)洗涤。同时，水相 再次用乙醚萃取。将有机相合并，硫酸镁干燥，减压浓缩，所得粗产品过柱纯化(环己烷/乙 酸乙酯= 6/1)，得到淡黄色油状物4(9.69g，83%)。
[0059] 4 NMR(400MHz，CDCl3):S7.37-7.28(m，5H)，5.82(d，J = 14.6Hz，lH)，4.29(dd，J = 14.6,0.8Hz，lH)，4.16(dd，J=9.6,3.6Hz，lH)，3.21-3.05(m，2H)，2.30-2.20(m，lH)，2.14-2.07(m,lH),1.45(s,9H).
[0060] (s，E) -1-苄基-5-( 2-甲氧基-2-氧代亚乙基)吡咯烷-2-羧酸叔丁酯(5)
[0061]
[0062] 将化合物4 (9 · 60g，30 · Ommo 1)和溴代乙酸甲酯(6 · 05g，40 · Ommo 1)溶于乙腈(27mL) 中，所得混合液室温搅拌42小时，然后冷却至-5 °C。在20分钟之内，将三苯基膦（13 . Og， 50.0 mmol)的二氯甲烷溶液(200mL)加入至反应液中，接着加入三乙胺（13.8mL，lOOmmol)。 室温搅拌30小时，有机相用1M NaH2P〇4溶液(75mL)洗涤，水相再用二氯甲烷(3 X 20mL)萃取。 合并有机相，硫酸镁干燥，减压浓缩，过柱纯化(环己烷/乙酸乙酯= 15/1)，得到淡黄色油状 物 5(8.97g，82%)。
[0063] 4 NMR(400MHz，CDC13):S7.36-7.19(m，5H)，4.77(s，lH)，4.55(d，J = 15.6Hz，1H)， 4.21(d,J=15.6Hz,lH) ,3.96(dd,J = 9.0,3.0Hz, 1H) ,3.63( s,3H) ,3.46-3.38(m,lH), 3·14-3.05(m，lH),2.27-2.17(m，lH),2.12-2.05(m，lH),1.43(s，9H); 13C 匪R(100MHz, CDC13):5171.43,169.89,165.42,135.88,129.04,127.94,127.91,82.36,80.57,65.42, 50.41,49.75,31.30,28.