专利名称：一种肝癌细胞凋亡诱导因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域中一种肝癌细胞凋亡诱导因子及其编码基因与应用。
背景技术：
肝癌在世界范围内每年导致25万人死亡，其中40％发生在我国，仅次于胃癌与食管癌，占我国癌症患者的第三位，而且患者多为30-59岁的中年男性，危害之大，不言而喻。肝癌的细胞模型与动物模型是开展防治研究的两根支柱，在细胞模型方面，我国人体肝癌细胞系继60年代初BEL-16之后又建成BEL-7402，7404，7405；SMMC-7721；QGY-7703；近年来又建成了具有甲胎蛋白(AFP)和HBsAg双标记的人肝癌细胞株，并已用于人体肝癌的免疫、生化、细胞生长分化、药物筛选、导向等项研究。运用这些模型，寻找新的诱导肝癌细胞凋亡的因子，可能是一个有效的肝癌防治途径。
4-6月孕龄的人胎肝是造血、免疫、肝脏系统干祖细胞的主要来源，表达基因在各类组织中最为丰富，表明其中存在大量具有医学价值的活性成分。
发明创造内容 本发明的目的是提供一种肝癌细胞凋亡诱导因子及其编码基因。
本发明所提供的肝癌细胞凋亡诱导因子，名称为SAPL，来源于人，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
序列表中的SEQ ID №2是由441个氨基酸残基组成的蛋白质，自氨基端第8-44位氨基酸序列为典型的SAP结构域。
肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的编码基因SAPL，是下列核苷酸序列之一 1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列； 2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸； 3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1是由2269个碱基组成的cDNA，其开放阅读框架(ORF)为自5′端第69位-1397位碱基，其中，自5′端第69位-71位碱基为起始密码子ATG，自5′端第1392位-1397位碱基为终止密码子TAATAA。
含有肝癌细胞凋亡诱导因子编码基因SAPL的表达载体和细胞系也属于本发明的保护范围，利用现有分子生物学的方法可以得到不同的表达载体和细胞系。
本发明所提供的肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的基因定位于人染色体15q13.3。其基因组基因的序列全长57.7kb，含有11个外显子，10个内含子。其cDNA全长2269bp，编码蛋白含441个氨基酸，分子量49451.8kDa，等电点为9.92。该因子的氨基端第8-44位含有典型的SAP结构域。在已发现的含有SAP结构域的蛋白中，若SAP结构域位于蛋白的氨基端，此蛋白功能多与细胞凋亡相关。SAP结构域可能结合基因组DNA结构中的一类核基质结合的被称为SAR/MAR(scaffold attachmentregion/matrix attachment region)的序列。SAR/MAR可与核基质相互作用，并推测可能参与基因转录调控、复制起始等。
本发明所提供的肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL表达具有组织特异性。Northern杂交的结果显示，在13种人组织中，仅表达于胸腺。点杂交的结果显示，在人50种组织中，SAPL高表达于胸腺、胎儿胸腺、骨髓、胎肝。成人组织和胎儿组织的SAPL表达谱的差异表明胎儿组织中的表达明显高于成人组织。人免疫系统相关的Northern杂交结果显示，SAPL表达于胎肝、骨髓、胸腺。提示该因子可能与造血调控相关。
本发明所提供的肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL在表达后定位于细胞核。将SAPL过表达于肝癌细胞系SMMC-7721中，可以导致50％左右的细胞发生凋亡。SAPL对肝癌细胞的诱导凋亡的特征具有细胞类型特异性，SAPL过表达于宫颈癌细胞HeLa、鼻咽癌细胞HNE和人胚肾细胞HEK293等都没有发生明显的凋亡。进一步的分析表明，SAPL过表达可以激活caspase-3、9，而不激活caspase-8、12，由于caspase-3、9的激活与凋亡中的线粒体途径相关，因此SAPL可能通过激活线粒体介导的途径而诱发凋亡。同时，还检测到SAPL的过表达可以导致细胞凋亡前细胞周期的G2/M期阻滞效应。因此，SAPL是一种新型的肝癌细胞凋亡诱导因子。本发明的肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL及其编码基因可用于制备预防和/或治疗肝癌的药物，为临床上治疗肝癌提供新的治疗途径。
图1为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL基因的染色体定位示意图 图2为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的基因组基因结构示意图 图3为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL在13种人源组织中的表达分析电泳图谱 图4为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL在50种人源组织中的表达分析 图5为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL在人免疫系统各组织中的表达分析 图6为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL在胎儿与成人组织中表达丰度的比较分析 图7为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL蛋白的亚细胞定位 图8为肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL过表达于SMMC-7721肝癌细胞后的细胞周期分析
具体实施例方式 实施例1、SAPL编码基因(cDNA)的克隆 方法利用胎肝大规模测序得到的一段SAPL基因的EST序列(该EST序列为SEQ ID№3的核苷酸序列)，通过Blast搜索得到213条EST序列，通过电子拼接得到其cDNA，全长2269bp。利用NCBI的ORF finder程序进行开放阅读框(ORF)分析。根据上述得到的SAPL的cDNA序列，设计如下引物正向引物5’-TAGGATCCAGAGCTCG-AATCGCGATGATCAT-3’(斜体为BamHI与SacI位点)和反向引物5’-ACTCGAGGGCCCATATCTTCAGCCAAAATGAGGC-3’(斜体为XhoI与ApaI位点)，以人胎肝cDNA文库(购自Clontech公司)为模板分别按常规方法进行PCR扩增，PCR产物与T载体(即pGEM-T，购自Promega公司)连接后，转入E.coli JM109感受态细胞中，利用氨苄抗性筛选阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定，挑选有插入片段的克隆(即pGEM-T-SAPL质粒)测序鉴定，得到SAPL的序列。
SAPL的编码基因序列如序列表中SEQ ID №1所示，它是由2269个碱基组成的cDNA，其ORF为自5′端第69位-1397位碱基，其中，自5′端第69位-71位碱基为起始密码子ATG，自5′端第1392位-1397位碱基为终止密码子TAATAA；SAPL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID №2所示，它是由441个氨基酸残基组成的蛋白质，其分子量为49451.8kDa，等电点为9.92。使用Motif Scanner软件对肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的氨基酸序列进行模体(motif)分析，结果表明它含有N端SAP结构域(自氨基端第8-44位氨基酸序列)和至少12种激酶的底物位点。
实施例2、SAPL基因的定位 通过对SAPL序列进行Blast分析得到Unigene序列Hs.7594，后者可以直接确定基因的染色体定位。结果如图1所示，表明肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL基因定位于染色体15q13.3。
实施例3、SAPL的基因组基因结构 以SAPL序列对人类基因组序列进行Blast搜索确定基因的基因组结构。肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的基因组基因结构如图2所示，表明SAPL的基因组基因具有11个外显子，10个内含子；其外显子和内含子的剪接形式如表1所示。SAPL的基因组基因的序列全长为57.7千核苷酸对。
表1.SAPL的基因组基因中外显子-内含子的交界区* 内含子 大小(Kb) 5′-交界区 3′-交界区 19.3aacctgaggGTACGGCGCTG CTCTCTTGCAGgcaaccaag 26.6gagaatcagGTGAGTAATGTCTCTTTTCAGgatgaaagt 31.7gactcacagGTGAATGGAAA TAAATTTGTAGcagaatcat 44.0gtttcctcagGTAAACGTGG TTGGATTTAGgtaacagaga 52.0actactccaaGTAAGTTTTG AACATTCTAGactttaaaaa 67.1tgaactgaagGTATGTAGAT TTCTCTTCAGcagcagccca 75.9cgggtgtcagGTAAAGAAAT TCCTATTTAGgttttcagct 84.0tctgctgctgGTAAAAAAAA TGTGTTTTTAGttattaccc 91.3ccacacaaagGTATGTGGGA CCTAAACTAGgaaagctaaa 10 2.7tccagacaaaGTAAGTACAT TCCCTCTCAGggaagagcaa 注外显子序列为小写字母，内含子序列为大写字母。
实施例4、肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL的表达 1、Northern杂交分析SARL在13种人源组织中的表达 杂交膜购自Clontech公司。随机引物标记试剂盒购自Promega公司。α-32P-dCTP购自亚辉公司。以上述构建成功的pGEM-T-SAPL质粒为模板，以5’-CCCACTGAATTCCAGAATCATGAAAAGC-3’和5’-TACTCTGACTTGCAGGGCCACAAGACCGG-3’为引物按常规方法进行PCR扩增，得到一段长400bp的SARL片段。以其作为探针，进行Northern杂交反应，具体步骤如下 (1)探针制备 a.将标记试剂盒中的Klenow大片段置于-20℃冰盒中，其余试剂置于冰上融解； b.DNA模板变性将SAPL的400bp片段置于95℃-100℃2min后快速冰上冷却； c.在1.5ml离心管中依次加入表1中的试剂 表1 随机引物标记DNA探针反应体系 试剂 终浓度用量 无核酸酶的水 标记的5×缓冲液 1× 10μl 未标记的dNTPs混合物2μl 变性DNA模板 500ng/ml 25ng 无核酸酶的牛血清白蛋白 400μg/ml 2μl α-32P-dCTP(进入同位素室后加入) 333nM 5μlDNA聚合酶I，Klenow大片段(进入同位100u/ml 1μl(5U) 素室后加入) 总体积 50μl 注水+模板的体积应为30μl。
d.轻轻混匀，室温反应至少1h； e.终止反应95℃-100℃×2min，快速冰上冷却。
f.纯化探针 1)DNA纯化柱制作取适量Sephadex G-50用水膨胀，洗后除去气泡；填柱，如不均，用细药勺勾兑，使柱体颜色均一。
2)50μl体系+10μl染料，用100μl Tips全部滴加到纯化柱中(上层液体已流完)。
3)缓慢滴加TEN。待液体流出10滴左右起用1.5ml离心管收集，4滴/管。收集10-20管。
4)随后计数各管的CPM值。第1、2、3连续高峰合并得到400μl-600μl探针，取100μl使用。不用时置于铅盒中，-20℃保存。
(2)Northern杂交反应 a.预热杂交液(购自Clontech公司)杂交液预热68℃；摇动至沉淀完全溶解。
b.预杂交将膜放入至少5ml杂交液中，68℃，30min，不停摇动。
c.探针变性步骤(1)中得到的放射性标记的探针，95-100℃，2-5min，迅速冰浴。
d.加探针加100μl-200μl探针到预热的5ml新鲜杂交液中，充分混合。
e.杂交倒出预杂交液或回收，加入含有探针的杂交液。68℃，1h，不停摇动。
f.洗膜小心地倒出杂交液，弃入适当的废液缸。洗液1(2×SSC，0.5％SDS)，室温，20min×3，不停摇动；洗液2(0.5×SSC，0.5％SDS)，50℃，20min×2，不停摇动。
g.取膜用镊子从管中取出膜，沥去多余的洗液。将潮湿的膜包入保鲜膜中。计数检测放射性，若未洗干净，用洗液2加洗一次。
h.放射自显影压片，将膜用胶带压在增感屏上，一般压3张，-70℃，一般3天后检测。
i.洗片显影1-3min，定影10min，流水冲洗30min。
j.洗膜从膜上洗去cDNA探针，以便再次使用。150-200ml 0.5％SDS，煮沸10min；冷却10min；取出膜，检测CPM值，如果仍可查出放射性(CPM＞20)，则重复洗膜；将膜放入杂交管，进行下一轮实验或包装于保鲜膜中-20℃储存备用。
结果如图3所示，表明在13种人组织中，SAPL特异表达于胸腺。
2、点杂交分析SAPL在50种人源组织中的表达 杂交膜购自Clontech公司。
a.准备预热杂交液 1)15ml杂交液预热50-60℃； 2)150μl(1.5mg)鲑精DNA，95℃-100℃×5min；快速冰上冷却； 3)将变性的鲑精DNA同预热的杂交液混合。
b.预杂交将膜放入10ml预杂交液中，杂交炉中65℃×30min，不停摇动。
准备探针在离心管中加入表2中试剂，加入已预热的剩余的5ml预杂交液中，充分混合。
表2 RNA Master Blot杂交检测反应体系 试剂 用量 加入量 放射性标记的DNA探针(步骤1 20μg，10-20×106150μl 中制备的探针)CPM C0t-1DNA30μg - 鲑精DNA 150μg 15μl 20×SSC 50μl 总体积 215μl 95℃-100℃×5min→65℃×30min c.杂交倒出预杂交液，加入含有探针的杂交液。于杂交炉中65℃×6h或过夜，不停摇动。
d.洗膜小心地倒出杂交液，弃入废液缸。
预热洗液1200ml，65℃×20min×4，不停摇动； 预热洗液2200ml，55℃×20min×2，不停摇动。
e.取膜用镊子取出膜，抖去多余的洗液，立即将潮湿的膜包入保鲜膜中。
f.检测放射量背景＜20cpm时压片，否则继续洗膜。
g.放射自显影压片，-70℃×过夜或3天，视压片时CPM而定。如果压片时CPM＞500，则过夜即可。如CPM在100左右，则3天或更多。
h.洗片显影1-3min，定影10min，流水冲洗30min。
i.洗膜从膜上洗去cDNA探针，以便再次使用。150-200ml 0.5％SDS，煮沸10min；冷却10min； 取出膜，检测CPM值，如果仍可查出放射性(CPM＞20)，则重复洗膜；将膜放入杂交管，进行下一轮实验或包装于保鲜膜中-20℃储存备用。
点杂交结果如图4所示，表明在人50种组织中SAPL基因高表达于胸腺(E5)、骨髓(E8)、胎肝(G4)、胎胸腺(G6)。图4中，A1为全脑；A2为杏仁核；A3为尾状核；A4为小脑；A5为大脑皮质；A6为额叶；A7为海马；A8为延髓；B1为枕叶；B2为壳核B3为黑质；B4为颞叶；B5为丘脑；B6为丘脑下核；B7为脊髓；C1为心；C2为主动脉；C3为骨骼肌；C4为结肠；C5为膀胱；C6为子宫；C7为前列腺；C8为胃；D1为睾丸；D2为卵巢；D3为胰腺；D4为垂体；D5为肾上腺；D6为甲状腺；D7为唾液腺；D8为乳腺；E1为肾；E2为肝；E3为小肠；E4为脾脏；E5为胸腺；E6为外周血淋巴细胞；E7为淋巴结；E8为骨髓；F1为阑尾；F2为肺；F3为气管；F4为胎盘；G1为胎脑；G2为胎心；G3为胎肾；G4为胎肝；G5为胎脾；G6为胎胸腺；G7为胎肺；H1为RNA；H2为酵母tRNA；H3为大肠杆菌rRNA；H4为大肠杆菌DNA；H5为多聚r(A)人Cotl DNA；H6-H8为人基因组DNA。
3、SAPL在人免疫系统各组织中的表达分析 方法同Northern杂交，杂交膜购自Clontech公司。
结果如图5所示，表明SAPL在胸腺、骨髓、胎肝中高表达。图5中，A为胸腺，B为胎肝，C为外周血白细胞，D为骨髓，E为淋巴结，F为脾脏。
4、SAPL在胎儿与成人组织中表达丰度的比较 扫描步骤2中的点杂交结果，图中的点以灰度表示，以PDQuest软件分析定量，得到的值再以点到杂交膜上的RNA的量进行校正，得到的分值为SAPL的表达量，选其正常组织与对应胚胎组织中的SAPL表达量作图。
结果如图6所示，表明在7种组织中，胚胎组织中的SAPL表达普遍高于成人组织，尤以肝脏最为明显。图6中各组的顺序从左至右依次为脑、心、肾、肝、脾、胸腺、肺，每一组的左侧为成人组织，右侧为胚胎组织。
实施例5、SAPL蛋白的亚细胞定位 pEGFP-C1/N1表达载体购自Clontech公司，转染试剂lipofectamine购自Gibco，Hoechst33342购自Sigma公司。
(1)定位质粒构建利用引物5’-CCCACTGAATTCCAGAATCATGAAAAGC-3’和5’-TACTCTGACTTGCAGGGCCACAAGACCGG-3’，以pGEM-T-SAPL为模板，将SAPL构建到pcDNA3.1B-myc-his载体中，PCR条件体系同上。再用SacII和SacI从构建好的pcDNA3.1B-SAPL上切出SAPL，插入到pEGFP-N1中得到pEGFP-N1-SAPL。
(2)细胞转染与荧光观察将1×105个COS-7细胞接种于35mm培养皿或六孔培养板中，37℃，5％CO2，培养18-24h，使细胞达到60-80％融合率；而后按lipofectamine方法转染；转染24-48小时后观察细胞，并用Hoechst33342染色以指示核。在Olympus显微镜下观察荧光，利用冷CCD数码相机拍照。结果如图7所示，表明SAPL定位于细胞核内。图中左侧部分为GFP-SAPL融合蛋白的绿色荧光，中间部分为Hoechst染核的结果，右侧部分为二者叠加的结果。
实施例6、SAPL在SMMC-7721肝癌细胞中的过表达 SMMC-7721细胞购自协和医科大学；细胞转染方法同实施例5中的步骤(2)，分别将上述构建的pEGFP-N1-SAPL质粒和空载体pEGFP-N1转染到SMMC-7721细胞、HeLa(宫颈癌细胞)、HNE(鼻咽癌细胞)、HEK293(人胚肾细胞)。采用流式分析术分析细胞周期与细胞凋亡率，具体方法如下 (1)转染后24到48小时胰酶消化细胞并用离心收集；(此步前可以先观察荧光看转染效率。) (2)洗涤细胞并用含5％小牛血清、70％乙醇的PBS于-20℃固定细胞； (3)离心，3000rpm×5min，去上清，PBS洗一次； (4)加入无DNA酶的RNA酶，37℃孵育半小时；同时或孵育后加入PI染色至少10分钟。
(5)流式细胞仪分析细胞周期与细胞凋亡率。
肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL过表达于SMMC-7721肝癌细胞后36小时的细胞凋亡结果如表3所示，表明SAPL过表达可以诱导50％左右的SMMC-7721细胞发生凋亡，而HeLa(宫颈癌细胞)、HNE(鼻咽癌细胞)、HEK293(人胚肾细胞)细胞均没有明显的凋亡发生。
表3.肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL过表达于SMMC-7721肝癌细胞后的细胞凋亡率细胞种类转染空载体的细胞凋亡率 转染SAPL的细胞凋亡率SMMC77210.56％50.33％HeLa5.31％7.65％HNE2.06％3.41％HEK 2934.07％3.13％ 肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL过表达于SMMC-7721肝癌细胞后24小时的细胞周期分析如图8所示，表明SAPL过表达可以引起G2/M期阻滞。表达pEGFP-N1空载体的细胞G0-G1期为24.65％，G2-M期为15.66％，S期为59.69％，表达SAPL的细胞G0-G1期为20.75％，G2-M期为44.39％，S期为34.87％。可以看出，G0-G1期的差别不明显，而G2-M期发生了明显的阻滞。
2)SAPL诱导SMMC-7721肝癌细胞凋亡的机理 caspase-9，caspase-8，caspase-12抗体购自oncogene公司。Caspase-3，P53，P21，Bax，Bc1-2抗体购自Santa Cruz公司。将pEGFP-N1-SAPL质粒和pEGFP空载体按常规方法转染SMMC-7721细胞，分别于28小时和36小时后，收集细胞，加入RIPA溶液进行裂解，而后加入等体积的上样缓冲液，电泳，Western分析Caspase是否发生激活(即是否有小片段切出)及p53等分子的蛋白水平变化。
分析表明，SAPL过表达可以激活caspase-3、9，而不激活caspase-8、12，由于caspase-3、9的激活与凋亡中的线粒体途径相关，因此SAPL可能通过激活线粒体介导的途径而诱发凋亡。
序列表
<160>3
<210>1
<211>2269
<212>DNA
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>1
gggatttgaa ccgcgctgac gaagtttggt gatccatctt ccgagtatcg ccgggatttc 60
gaatcgcgat gatcatcccc tctctagagg agctggactc cctcaagtac agtgacctgc 120
agaacttagc caagagtctg ggtctccggg ccaacctgag ggcaaccaag ttgttaaaag 180
ccttgaaagg ctacattaaa catgaggcaa gaaaaggaaa tgagaatcag gatgaaagtc 240
aaacttctgc atcctcttgt gatgagactg agatacagat cagcaaccag gaagaagctg 300
agagacagcc acttggccat gtcaccaaaa caaggagaag gtgcaagact gtccgtgtgg 360
accctgactc acagcagaat cattcagaga taaaaataag taatcccact gaattccaga 420
atcatgaaaa gcaggaaagc caggatctca gagctactgc aaaagttcct tctccaccag 480
acgagcacca agaagctgag aatgctgttt cctcaggtaa cagagattca aaggtacctt 540
cagaaggaaa gaaatctctc tacacagatg agtcatccaa acctggaaaa aataaaagaa 600
ctgcaatcac tactccaaac tttaagaagc ttcatgaagc tcattttaag gaaatggagt 660
ccattgatca atatattgag agaaaaaaga aacattttga agaacacaat tccatgaatg 720
aactgaagca gcagcccatc aataagggag gggtcaggac tccagtacct ccaagaggaa 780
gactctctgt ggcttctact cccatcagcc aacgacgctc gcaaggccgg tcttgtggcc 840
ctgcaagtca gagtaccttg ggtctgaagg ggtcactcaa gcgctctgct atctctgcag 900
ctaaaacggg tgtcaggttt tcagctgcta ctaaagataa tgagcataag cgttcactga 960
ccaagactcc agccagaaag tctgcacatg tgaccgtgtc tgggggcacc ccaaaaggcg 1020
aggctgtgct tgggacacac aaattaaaga ccatcacggg gaattctgct gctgttatta 1080
ccccattcaa gttgacaact gaggcaacgc agactccagt ctccaataag aaaccagtgt 1140
ttgatcttaa agcaagtttg tctcgtcccc tcaactatga accacacaaa ggaaagctaa 1200
aaccatgggg gcaatctaaa gaaaataatt atctaaatca acatgtcaac agaattaact 1260
tctacaagaa aacttacaaa caaccccatc tccagacaaa ggaagagcaa cggaagaaac 1320
gcgagcaaga acgaaaggag aagaaagcaa aggttttggg aatgcgaagg ggcctcattt 1380
tggctgaaga ttaataattt tttaacatct tgtaaatatt cctgtattct caactttttt 1440
ccttttgtaa attttttttt ttttgctgtc atccccactt tagtcacgag atctttttct 1500
gctaactgtt catagtctgt gtagtgtcca tgggttcttc atgtgctatg atctctgaaa 1560
agacgttatc accttaaagc tcaaattctt tgggatggtt tttacttaag tccattaaca 1620
attcaggttt ctaacgagac ccatcctaaa attctgtttc tagattttta atgtcaagtt 1680
cccaagttcc ccctgctggt tctaatatta acagaactgc agtcttctgc tagccaatag 1740
catttacctg atggcagcta gttatgcaag cttcaggaga atttgaacaa taacaagaat 1800
agggtaagct gggatagaaa ggccacctct tcactctcta tagaatatag taacctttat 1860
gaaacggggc catatagttt ggttatgaca tcaatatttt acctaggtga aattgtttag 1920
gcttatgtac cttcgttcaa atatcctcat gtaattgcca tctgtcactc actatattca 1980
caaaaataaa actctacaac tcattctaac attgcttact taaaagctac atagccctat 2040
cgaaatgcga ggattaatgc tttaatgctt ttagagacag ggtctcactg tgttgcccag 2100
gctggtctca aactccacca aatgtacttc ttattcattt tatggaaaag actaggcttt 2160
gcttagtatc atgtccatgt ttccttcacc tcagtggagc ttctgagttt tatactgctc 2220
aagatcgtca taaataaaat tttttctcat tgtcaaaaaa aaaaaaaaa 2269
<210>2
<211>441
<212>PRT
<213>人属人(Homo sapiens)
<400>2
Met Ile Ile Pro Ser Leu Glu Glu Leu Asp Ser Leu Lys Tyr Ser Asp
1 5 10 15
Leu Gln Asn Leu Ala Lys Ser Leu Gly Leu Arg Ala Asn Leu Arg Ala
20 25 30
Thr Lys Leu Leu Lys Ala Leu Lys Gly Tyr Ile Lys His Glu Ala Arg
35 40 45
Lys Gly Asn Glu Asn Gln Asp Glu Ser Gln Thr Ser Ala Ser Ser Cys
50 55 60
Asp Glu Thr Glu Ile Gln Ile Ser Asn Gln Glu Glu Ala Glu Arg Gln
65 70 75 80
Pro Leu Gly His Val Thr Lys Thr Arg Arg Arg Cys Lys Thr Val Arg
85 90 95
Val Asp Pro Asp Ser Gln Gln Asn His Ser Glu Ile Lys Ile Ser Asn
100 105 110
Pro Thr Glu Phe Gln Asn His Glu Lys Gln Glu Ser Gln Asp Leu Arg
115 120 125
Ala Thr Ala Lys Val Pro Ser Pro Pro Asp Glu His Gln Glu Ala Glu
130 135 140
Asn Ala Val Ser Ser Gly Asn Arg Asp Ser Lys Val Pro Ser Glu Gly
145 150 155 160
Lys Lys Ser Leu Tyr Thr Asp Glu Ser Ser Lys Pro Gly Lys Asn Lys
165 170 175
Arg Thr Ala Ile Thr Thr Pro Asn Phe Lys Lys Leu His Glu Ala His
180 185 190
Phe Lys Glu Met Glu Ser Ile Asp Gln Tyr Ile Glu Arg Lys Lys Lys
195 200 205
His Phe Glu Glu His Asn Ser Met Asn Glu Leu Lys Gln Gln Pro Ile
210 215 220
Asn Lys Gly Gly Val Arg Thr Pro Val Pro Pro Arg Gly Arg Leu Ser
225 230 235 240
Val Ala Ser Thr Pro Ile Ser Gln Arg Arg Ser Gln Gly Arg Ser Cys
245 250 255
Gly Pro Ala Ser Gln Ser Thr Leu Gly Leu Lys Gly Ser Leu Lys Arg
260 265 270
Ser Ala Ile Ser Ala Ala Lys Thr Gly Val Arg Phe Ser Ala Ala Thr
275 280 285
Lys Asp Asn Glu His Lys Arg Ser Leu Thr Lys Thr Pro Ala Arg Lys
290 295 300
Ser Ala His Val Thr Val Ser Gly Gly Thr Pro Lys Gly Glu Ala Val
305 310 315 320
Leu Gly Thr His Lys Leu Lys Thr Ile Thr Gly Asn Ser Ala Ala Val
325 330 335
Ile Thr Pro Phe Lys Leu Thr Thr Glu Ala Thr Gln Thr Pro Val Ser
340 345 350
Asn Lys Lys Pro Val Phe Asp Leu Lys Ala Ser Leu Ser Arg Pro Leu
355 360 365
Asn Tyr Glu Pro His Lys Gly Lys Leu Lys Pro Trp Gly Gln Ser Lys
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Leu Asn Gln His Val Asn Arg Ile Asn Phe Tyr Lys
385 390 395 400
Lys Thr Tyr Lys Gln Pro His Leu Gln Thr Lys Glu Glu Gln Arg Lys
405 410 415
Lys Arg Glu Gln Glu Arg Lys Glu Lys Lys Ala Lys Val Leu Gly Met
420 425 430
Arg Arg Gly Leu Ile Leu Ala Glu Asp
435 440
<210>3
<211>400
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
ctacattaaa catgaggcaa gaaaaggaaa tgagaatcag gatgaaagtc aaacttctgc60
atcctcttgt gatgagactg agatacagat cagcaaccag gaagaagctg agagacagcc120
acttggccat gtcaccaaaa caaggagaag gtgcaagact gtccgtgtgg accctgactc180
acagcagaat cattcagaga taaaaataag taatcccact gaattccaga atcatgaaaa240
gcaggaaagc caggatctca gagctactgc aaaagttcct tctccaccag acgagcacca300
agaagctgag aatgctgttt cctcaggtaa cagagattca aaggtacctt cagaaggaaa360
gaaatctctc tacacagatg agtcatccaa acctggaaaa 400
权利要求
1、一种肝癌细胞凋亡诱导因子，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2、根据权利要求1所述的肝癌细胞凋亡诱导因子，其特征在于所述肝癌细胞凋亡诱导因子是序列表中的SEQ ID №2。
3、一种肝癌细胞凋亡诱导因子的编码基因，是下列核苷酸序列之一
1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；
2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；
3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于所述肝癌细胞凋亡诱导因子的编码基因是序列表中的SEQ ID №1。
5、含有权利要求3所述基因的表达载体。
6、含有权利要求3所述基因的细胞系。
7、权利要求1所述的肝癌细胞凋亡诱导因子在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用。
8、权利要求3所述基因在制备预防和/或治疗肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种肝癌细胞凋亡诱导因子及其编码基因与应用。本发明所提供的肝癌细胞凋亡诱导因子，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。其编码基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的肝癌细胞凋亡诱导因子SAPL及其编码基因可用于制备预防和/或治疗肝癌的药物，为临床上治疗肝癌提供新的治疗途径。
文档编号A61K38/17GK1616487SQ200310103858
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月14日 优先权日2003年11月14日
发明者贺福初, 李璐, 孙立波, 张令强, 鱼咏涛, 邢桂春, 吴松锋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所