专利名称：分离的编码t细胞诱导因子(tif)的核酸分子,其编码蛋白及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新分离的核酸分子及其应用。细胞因子白细胞介素-9(IL-9)可上调这些核酸分子。本文还公开了这些核酸分子所编码的蛋白。它们被称为T细胞衍生的诱导因子(TIF)。这些核酸分子编码的蛋白可诱导细胞中STAT活化。它们可用于如刺激靶组织再生。而且，它们的抑制剂或拮抗剂可用于延迟、阻滞或抑制其它组织的分化。
背景技术：
在过去十年中，对免疫系统及其调节作用的了解不断深入。其中一个受关注的领域是对调节免疫系统的蛋白和糖蛋白的研究。这些分子中最了解的家族之一是细胞因子。这些分子参与细胞间“通信”。细胞因子家族的个别成员参与了更广泛的病理过程，如肿瘤和过敏。一方面细胞因子参与病理过程，另一方面它们也具有治疗价值。
白细胞介素是其中一类细胞因子。有关白细胞介素的文献很多。如Mertelsmann等的美国专利4778879；Stern的美国专利4490289；Mark等的美国专利4518584；和Miyaji等的美国专利4851512，它们均涉及白细胞介素-2或“IL-2”。涉及白细胞介素-1(IL-1)的已授权专利如Cosman的美国专利4,808,611。所有这些专利均全文引入作参考。涉及不同白细胞介素的更近期专利有美国专利5694234(IL-13)；5650492(IL-12)；5700664；5371193和5215895(IL-11)；5728377，5710251，5328989(IL-10)；5580753，5,587,302，5157112，5208218(IL-9)；5194375，4965195(IL-7)；5723120，5178856(IL-6)，和5017691(IL-4)。对专利文献的粗略回顾显示，白细胞介素家族成员的特点多样。可以设想更大的细胞因子家族将显示更多的不同。见如Aggarwal等的《人类细胞因子基础和临床研究手册》(Blackwell科技出版社，1992)，Paul编，基础免疫学(Raven出版社，1993)，763-836页，“T细胞衍生的细胞因子和它们的受体”，“前炎性细胞因子和免疫。”所有引用的文献均全文引入作参考。
不同细胞因子间的关系很复杂。从引证的文献可见，特定细胞因子水平的增高或降低可以直接或间接影响其它分子的水平。受影响的分子有些是其它细胞因子。
淋巴因子IL-9，曾被称为“P40”，是T细胞衍生的分子，最初被鉴定为支持T4细胞系的持久抗原非依赖性生长的因子。见如Uyttenhove等，美国国家科学院院刊856934(1988)，和Van Snick等，实验医学杂志169363(1989)，及Simpson等，欧洲生物化学杂志183715(1989)，均引入作参考。
首先观察到IL-9对限制性T4细胞系的活性，但未观察到对CTL或新分离的T细胞的活性。见如Uyttenhove等，出处同上和Schmitt等，欧洲免疫学杂志192167(1989)。当实验确定IL-9和称作T细胞生长因子III(TCGFIII)的分子与MEA(肥大细胞生长增强活性)作用相同时，其活性范围扩大了，其中MEA可增强骨髓来源的肥大细胞对IL-3的增殖应答，可见于Hultner等，欧洲免疫学杂志和1990年3月23日提交的美国专利申请498,182，这两篇文献均引入作参考。还发现人型IL-9刺激成巨核细胞白血病的增殖。可见于Yang等，血液741880(1989)。最近的工作显示IL-9也支持红细胞集落形成(Donahue等，血液75(12)2271-2275(6-15-90))；促进髓系红细胞爆发形成的增殖(Williams等，血液76306-311(9-1-90))；支持成人和胎儿来源的BFU-E′s的克隆成熟(Holbrook等，血液77(10)2129-2134(5-15-91))。IL-9的表达还与霍奇金病和大细胞退行性淋巴瘤有关(MerZ等，血液78(8)1311-1317(9-1-90))。对易患或不易患支气管过度反应的小鼠的遗传分析揭示，这一模型与IL-9基因的联系，及IL-9产量与易感性的关系(Nicolaides等，美国国家科学院院刊，94，13175-13180，1997)。人类遗传学研究也指出IL-9和IL-9R基因是哮喘的侯选基因(Doull等Am.J.Respir.Crit.Care Med.，153，1280-1284，1996；Holroyd等Genomics52，233-235，1998)。其次，对IL-9转基因小鼠的研究证实IL-9表达增加导致肥大细胞增多症，嗜酸性粒细胞增多症，支气管过度反应和高水平的IgE(Temann等，实验医学杂志1881，307-1320，1998；Godfraind等，免疫学杂志160，3989-3996，1998；McLane等Am.J.Resp.Cell.Mol.19713-720(1999))。总之，这些观察有力说明IL-9在该疾病中发挥重要作用。另有研究表明IL-9及其突变蛋白与哮喘和过敏有关。见PCT申请US96/12757(Levitt等)，和PCT US97/21992(Levitt等)，均引入作参考。
已知IL-9影响受试者中其它分子的水平。见于Louahed等，免疫学杂志1545061-5070(1995；Demoulin等，分子细胞生物学164710-4716(1996)，均引入作参考。还认识到受影响的分子在生物系统中有自己的功能。例如，Demoulin等显示IL-9的众多已知活性由STAT转录因子的活化介导。因此领域内一直在尝试对其存在和/或水平受其它分子如细胞因子影响的分子进行鉴定。
发明内容
本发明以下内容将描述这类分子。发现编码本发明蛋白的核酸分子在IL-9存在时表达，缺乏IL-9时不表达。因此，这些分子尤其是IL-9的表达或效应的“标志”。这些分子在后文被称为T细胞衍生的诱导因子或“TIF”。在下面的描述中将显示本发明的这些和其它特点。
本发明还提供测定IL-9在细胞中效应的方法，其包括使所述细胞与一种试剂接触，其中该试剂特异于(i)一种分离的核酸分子，其编码蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO29，SEQ ID NO24或SEQ ID NO25编码的氨基酸序列一致，和(ii)一种蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO29，SEQ ID NO24或SEQ ID NO25编码的氨基酸序列一致，测定所述试剂与(i)或(ii)的相互作用以确定IL-9对所述细胞的效应。优选所述试剂是与(ii)特异性结合的抗体，或者所述试剂包含SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO29，SEQ ID NO24或SEQID NO25的分离的核酸分子。
本发明还提供确定样品中TIF的存在的方法，其包括使所述样品与一种试剂接触，该试剂可与TIF或与编码TIF的核酸分子结合，测定所述结合作为对所述样品中TIF的测定。优选所述试剂是抗体或者核酸分子。
本发明还提供确定一种物质能否影响IL-9活性的筛选方法，其包括将所述物质加入TIF生成细胞的样品中，在有IL-9存在的情况下测定TIF的产生，其中所述细胞的TIF生成与所述细胞在有IL-9但无所述物质的情况下的TIF生成之间的差异可指示所述物质对IL-9活性的影响。在一个优选方案中，所述物质为IL-9抑制剂或拮抗剂，所述方法还包括测定所述细胞在有所述物质时的TIF生成水平比没有所述物质时的降低。在另一个优选方案中，所述物质为IL-9激活剂，所述方法还包括测定所述细胞在有所述物质时的TIF生成水平比没有所述物质时的提高。
附图简述
图1对比推导的小鼠和人TIF的氨基酸序列(分别是SEQ ID NO27和28)。
优选实施方案详述实施例1已知小鼠淋巴瘤细胞系BW5147可在体外生长，且其培养基中不需加入任何细胞因子。为确定经IL-9诱导的基因，BW5147样品用IL-9(200U/ml)或不用IL-9培养24小时。然后，用异硫氰酸胍裂解，CsCl梯度离心，分离总RNA。这些是已知技术。之后，用oligo(dT)纤维素柱从总RNA中纯化多聚腺苷化RNA。然后用分离的polyA RNA生成双链cDNA。用市场购买的oligo(dT)作引物。3～5μg polyA RNA的任意部位与1μg的oligo dT加热至70℃，10分钟，然后与5x第一链反应缓冲液(250mM HCl(pH8.3)，375mM KCl，15mM MgCl2)，10Mm DTT(二硫苏糖醇)，500μM dNTPs，和800U的逆转录酶一起保温。反应总体积是20μl，37℃反应1小时。由此合成第一条cDNA链。加入30μl的5x第二链反应缓冲液(100mMTris-HCl(pH6.9)，450mM KCl，23mM MgCl2，0.75mM β-NAD+，50mM(NH4)2SO4，60U的E.coli(大肠杆菌)DNA聚合酶I，2U的E.coli RNaseH(RNA酶H)，10U的E.coli DNA连接酶，和250μM dNTPs，终体积150μl，16℃保温2小时，由此合成第二条链。
产物用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。cDNA终产物重悬于200μl的TE。
用接受刺激的BW5147细胞(“试验者”(tester))，和平行的未受刺激的BW5147细胞(“对照者”(driver))进行实验。
实施例2根据已知的方法将实施例1中制备的cDNA进行扣除克隆。为此制备了6个寡核苷酸5′-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3′(SEQ ID NO1)；5′-GATCTGCGGTGA-3′(SEQ ID NO2)；5′-ACCGACGTCGACTATCCATGAACA-3′(SEQ ID NO3)；5′-GATCTGTTCATG-3′(SEQ ID NO4)；
5′-AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAA-3′(SEQ ID NO5)；5′-GATCTTCCCTCG-3′(SEQ ID NO6)。
这些序列作如下使用。双链cDNA(2μg)用限制性内切酶DpnII消化，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，重悬于20μl的TE(10mM Tris-HCl(pH7.5)；1mMEDTA)中。12μl酶切的cDNA(1.2μg)与4μl脱盐的SEQ ID NO1(2mg/ml)，4μl脱盐的SEQ ID NO2(1mg/ml)，10μl 5x接头缓冲液(330mM Tris-HCl，pH7.6，50mM MgCl2，5mM ATP)，7μl DTT(100mM)，和28μl水混合，使所述cDNA连接至双链SEQ ID NO1和2。加热该混合物至50℃，使寡核苷酸之间及与样品DNA间退火，然后冷却至10℃1小时以上，加入5μl的T4DNA连接酶，12-16℃保温12-14小时。加入140μl TE稀释。200μl的样品以如下方式进行PCR。
实施例3为进行PCR，在缓冲液66mM Tris-HCl，pH8.8，4mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，33μg/ml BSA，dNTP各0.3mM(浓度500μM)中含有2μl连接产物，取200μl样品和2μg SEQ ID NO2在72℃加热3分钟，除去与实施例2中产物杂交的SEQ ID NO1。用5U Taq多聚酶(72℃，5分钟)填平3’端。扩增20个循环(每个循环95℃1分钟，72℃3分钟)，将产物汇总后，酚抽提，乙醇沉淀，重悬于TE缓冲液，浓度为0.5μg/μl。后文中将它称为代表产物(representation)。
实施例4代表产物经DpnII消化，除去SEQ ID NO1，准备扣除杂交。消化产物经酚抽提，乙醇沉淀。所用为未刺激的样品时产生对照者，所用为刺激的样品时产生试验者。部分试验者(20μg)经1.2％琼脂糖凝胶纯化和分离。用上述连接SEQ ID NO1和SEQ ID NO2同样的方法，将样品(2μg)与SEQ ID NO3和SEQ ID NO4连接起来。
扣除杂交的首次循环中，已连接了SEQ ID NO3和4的0.4μg试验者样品与40μg对照者cDNA混合。混合物经酚抽提，乙醇沉淀，溶于2μl的3xEE缓冲液(30mM EPPS pH8.0)，3mM EDTA。加盖30μl的矿物油，98℃变性5分钟。加入5M NaCl，DNA在67℃杂交20小时。用TE和tRNA载体稀释反应混合物至200μl。样品72℃保温3分钟，使SEQ ID NO4解链，然后制备4个PCR反应(200μl)。它们包括20μl经稀释的无引物的杂交混合物，用于填平重新退火的试验者末端，加入SEQ ID NO3样品后扩增10个循环(每个循环95℃1分钟，70℃3分钟)，将产物汇总后，酚抽提，乙醇沉淀，重悬于40μl 0.2xTE缓冲液中。用20U绿豆核酸酶将20μl该物质处理30分钟以降解单链DNA，此阶段总体积40μl。用50mMTris-HCl，pH8.9稀释样品(1∶5)，98℃加热5分钟使所述酶灭活。用20μl上述产物，2μl的SEQ ID NO3(1mg/ml)，和1μl(5U)的Taq DNA聚合酶进行第二轮PCR。共18个循环(每个循环95℃1分钟，70℃3分钟)。将产物汇合，酚抽提，乙醇沉淀，重悬至0.5-1μg/μl。该产物称为“DP1”，或第一个示差产物。
实施例5DP1如上述用内切酶DpnII消化，与SEQ ID NO5和6连接，过程同SEQ ID NO1，2，3和4时的描述。重复实施例4描述的扣除杂交和选择性扩增，产生第二个示差产物或“DP2”。实验中50ng的DP1是试验者。对照者(40μg)如上述。重复上述过程，用SEQ ID NO3和4作接头，产生第三个示差产物。为产生第三个示差产物，将100pg的试验者与40μg的对照者混合。重复上述所有实验步骤，但最后扩增22个循环，其中每个循环为95℃1分钟，70℃3分钟。如此产生最终示差产物。
实施例6用DpnII消化最终示差产物，克隆进市场购买的ptZ19R载体的BamHI位点。制备双链DNA质粒，用标准方法测序。其序列用BLAST搜索程序与GenBank和EMBL数据库的已知序列比较。
在扣除过程的最后，确定了一短的cDNA片段，长约200个碱基对。这个片段用于筛选BW5147细胞的cDNA文库。对最大的克隆进行测序。下面将作讨论。其不与任何已知序列相符。
核苷酸序列(SEQ ID NO7)长1121个碱基，包括537个碱基对的开放读码框架，其编码长179个氨基酸的蛋白。该蛋白的预计分子量是20093。另有两个ATG密码子，假如作为起始密码子，将分别产生长172和167个氨基酸的蛋白，分子量分别为19335和18770道尔顿。该蛋白质每种形式的特征在于有一段疏水氨基酸的序列，其穿过内质网时被切除，从而产生成熟蛋白。
对该序列的分析显示有三个富含AT的基序(TTATTTAT)。常在细胞因子和癌基因的5′非翻译区发现这些基序。Kruys等，科学245852(1989)显示这些重复区调整TIF mRNA的稳定性。
实施例7以上述实施例6中分离和分析的cDNA作探针，鉴定TIFα的基因组DNA。
采用标准方法用SEQ ID NO7筛选小鼠株129的基因组文库。将一个阳性克隆的EcoRI片段亚克隆进pZERO质粒，并部分测序。这部分序列称为SEQ ID NO8。
实施例8实施例7中所述阳性克隆的第二个EcoRI片段也被亚克隆。同源性较多，但序列不相同。具体而言，这个序列的内含子1与SEQ ID NO8有98％相同，内含子2有100％相同，内含子3有92％相同。
该序列中令人惊讶的是启动子均无同源性，说明其调节是独特的。5′非翻译区有92％相同。TIFα的1号外显子分为外显子1α和外显子1β。第一编码外显子(TIFα外显子1b和TIFβ外显子1)有99.5％相同，第二外显子是100％相同，第三外显子是97％相同，第四外显子是98.5％相同，第五外显子是96％相同。3′非翻译区中同源性为96％。
实施例9用上述实施例8中的信息，推测出所述第二个克隆的cDNA序列，其称为TIFβ，见SEQ ID NO9。用上述同样的方法还确定了基因组DNA序列，见SEQ ID NO29。
与TIFα相比，TIFβ的编码区有6个沉默变化。有2个改变导致不连续的氨基酸改变(在36位和113位，TIFα的Val变为TIFβ的Ile)。在112位有更明显的改变，Gln变为Arg。
实施例10用实验研究TIF的表达。用重组小鼠IL-9(200U/ml)刺激BW5147细胞，达不同时长(0.2，0.5，1，2及24小时)。用标准方法和试剂分离总RNA。用5μg的总RNA和oligo(dT)引物进行逆转录。对应于20ng总RNA的cDNA样品用不同引物扩增25个循环。(每个循环94℃4分钟，57℃1分钟，72℃2分钟)。TIF引物是5′-CTGCCTGCTTCTCATTGCCCT-3′(SEQ ID NO10)和5′-CAAGTCTACCTCTGGTCTCAT-3′(SEQ ID NO11)(分别是有意义链和反意义链)。
它们分别对应于SEQ ID NO7的核苷酸106-126，和764-784。β-肌动蛋白作为对照也进行扩增，扩增18个循环(第一个循环94℃4分钟，60℃1分钟，72℃2分钟。后续循环是94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟)。
扩增后的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶分析，用放射标记的内部探针印记证实特异性扩增。TIF探针是5′-GACGCAAGCATTTCTCAGAG-3′(SEQ ID NO12)所示条件和探针并非特异于TIF的某一种形式；然而，TIFα的扩增产物包含一个KpnI限制位点，TIFβ无此位点。用KpnI消化扩增产物显示，IL-9诱导的TIF mRNA主要(如果不是全部)是TIFα，说明经IL-9迅速诱导TIFα的表达。刺激30分钟后可检出TIFα的mRNA，在1-24小时内达到平台期。
实施例11实验显示上述IL-9对TIF mRNA的诱导不需要合成蛋白。在这些实验中，如实施例10所述，从刺激24小时的细胞中抽提总RNA，用或不用10μg/ml的蛋白合成抑制剂放线菌酮作用4.5小时。在一组平行实验中，细胞未受刺激。如实施例10所述抽提总RNA并进行RT-PCR扩增。用EB染色的1％琼脂糖凝胶分析PCR产物。结果发现当蛋白合成受阻时，IL-9的诱导仍可发生。因此IL-9的作用是直接作用，不需要蛋白介导物的合成。
实施例12在这些实验中，在BW5147细胞系的衍生物上研究STAT蛋白对TIFmRNA的诱导作用。第一个细胞系，BWh9R表达野生型人IL-9受体。BW-Phe116细胞系是具有单个突变(在116位)的转染体，它使受体不能活化STAT转录因子。另一个细胞系BW-mut6有一突变，它使受体不能活化STAT5，但仍有活化STAT1和STAT3的能力。最后，细胞系BW-mut7有一个突变，它使IL-9受体不能活化STAT1和STAT3，但仍有活化STAT5的能力。
如实施例10所述，刺激细胞，分离总RNA，逆转录和扩增cDNA(细胞刺激24小时，所用为人和小鼠重组IL-9)。如上所述，PCR产物在EB染色的1％琼脂糖凝胶上分析。
分析显示，人IL-9不能诱导BW-Phe116中的表达，说明其涉及STAT转录因子。已发现IL-9在BW-mut6突变细胞中诱导TIF表达，但在mut7变体中不能诱导，说明与STAT1或STAT3有关，而不涉及STAT5。
实施例13研究正常小鼠脾细胞中TIF mRNA的表达。
来自10-12周龄Balb/c小鼠的脾细胞培养24小时，所用培养基为对照培养基或含有20μg/ml LPS(其可活化B淋巴细胞和巨噬细胞)或ConA(其可活化T细胞)，或ConA加1％抗小鼠IL-9封闭抗血清的对照培养基，以β-肌动蛋白作对照。如上纯化RNA，进行RT-PCR分析。
数据显示，TIF在静息脾细胞中表达很弱，不受LPS诱导，但受ConA强烈诱导。抗IL-9的抗血清不能影响ConA的诱导作用，说明该效应不经IL-9介导，或经其它细胞因子介导。
用RT-PCR产物的序列分析ConA活化的脾细胞，发现这些细胞显著表达或只表达TIFα。
实施例14进一步的研究显示，甚至在缺乏IL-9诱导时仍能表达TIF mRNA。
用尼龙毛柱从来自5周龄FVB小鼠的脾细胞中富集T细胞。然后在含有ConA(一种T细胞活化物)或PMA(在大多数细胞中活化PKC)的培养液中，加入或不加入IL-9的情况下刺激所述细胞24小时。
用标准技术分离总RNA，10μg样品在含有2.2M甲醛的1.3％琼脂糖凝胶上电泳分离，转至硝酸纤维膜，标记，在Van Snick等，实验医学杂志169363(1989)(已引入作参考)所述的杂交试验中进行分析。
结果显示，ConA对TIF的诱导不能被修饰，而IL-9在PMA活化的脾细胞中不能诱导TIF RNA。
实施例15检测各种细胞系中TIF mRNA的表达。在这些实验中，用特定的细胞因子刺激小鼠细胞系至少一天。具体为，9T7是T细胞淋巴瘤，其对IL-2，IL-4或IL-9应答，TS3和TS6细胞系来自T辅助细胞克隆，并在IL-2或IL-9存在时增殖。MC9和LI38是肥大细胞系，其在IL-3或IL-9存在时增殖。
刺激后，用常规的异硫氰酸胍裂解和CsCl梯度离心制备总RNA。
然后如实施例14所述用Northern印记分析9T7细胞系，用上述RT-PCR方法分析其它细胞系。
发现IL-9可上调T辅助细胞和肥大细胞中TIF的表达。IL-2和IL-3则不能。然而，不管是否有细胞因子，9T7细胞系中显示大致相同的表达水平，说明IL-9对于TIF的表达不是必须的。
实施例16研究B细胞系中TIF mRNA的表达。A20，70Z/3和BCL-1是B细胞白血病细胞系，它们体外生长不需要细胞因子。这些细胞用IL-4和IL-9刺激24小时，用标准方法分离总RNA。如上述经RT-PCR扩增35个循环，然后经印记和杂交来分析其表达。
结果显示，在B细胞中检出TIF表达，IL-9和IL-4存在时最多仅有很弱的上调。
实施例17研究本发明分子在T辅助细胞系中的表达。TS2和TS1是已知的T辅助细胞系，它们来自T辅助细胞克隆，在IL-9或IL-2(TS2)和IL-9或IL-4(TS1)存在时增殖。具体为，存在列出的细胞因子时，TS2或TS1细胞可生长至少10天，然后用已知方法抽提RNA。用上述的实验方法，经RT-PCR(35个循环)研究这些分子的表达。IL-4和IL-9均可诱导TS1细胞TIF的表达，IL-2不能诱导TS2表达TIF。
实施例18研究不同小鼠器官TIF mRNA的表达。用标准的异硫氰酸胍方法和CsCl梯度离心，从肝，肾，心，脑，肠，脾，胸腺，肺，肌肉和骨髓中制备总RNA。用上述实验方案进行40个循环的RT-PCR。在胸腺组织中发现最强表达，脑组织中发现次强的信号，在其它组织中表达比这两者弱。
实施例19在下面的实验描述293-EBNA细胞中TIFα的产生。
如上描述的TIFα的cDNA被亚克隆进市场购买的pCEP-4表达载体并与CMV启动子可操作地连接。用标准的脂转染胺(lipofectamine)方法将该质粒转染至293-EBNA细胞。转染后，细胞在无蛋氨酸的培养液和加入35S标记的蛋氨酸的培养液中保温24小时。收获上清，进行丙烯酰胺凝胶电泳。胶干燥后放射自显影1天。将cDNA反向克隆进相同质粒后转染细胞作为对照。
发现正向转染TIF的细胞有大约25-32kd的一条异质性带。在本系统中，预测分子量与实际分子量之间的偏差以及异质性均归因于糖基化。在一组平行实验中，编码人TIF的cDNA以相同于小鼠cDNA的方式表达。除了cDNA的改变，所有实验参数均相同。
实施例20进一步实验研究COS细胞中TIFα的产生。具体为，将TIFα的cDNA亚克隆进上述Demoulin等描述的质粒pEF-BOS.puro中，与EF-1α启动子可操作地相连。采用上述同样的脂转染胺方法将质粒cDNA转染至COS细胞。细胞在无蛋氨酸的培养液和加入35S标记的蛋氨酸的培养液中保温24小时，之后用实施例20所述的方法处理上清。再次观察到一条25-30kd的异质性带，还有一条18kd的条带，其很可能代表该分子的非糖基化形式。
实施例21从以下实验发现TIF诱导肾小球膜细胞、神经元黑色素瘤细胞和肝癌细胞中的STAT活化。已知当细胞因子活化STAT因子时，这些因子形成二聚体，从胞浆移至核内，与启动子的靶序列结合。实验细节如下。
如上述转染的293-EBNA细胞在正常培养液中保温48小时备用，对照上清也如上述处理。使用小鼠肾小球膜细胞系(“MES13”)样品，大鼠嗜铬细胞瘤细胞系(“PC12”)，4种不同的人黑色素瘤细胞(SK23，AUMA，NA-8mel和MULL)，人肝癌细胞(HepG3)和大鼠肝癌细胞(H-4-II-K)。用1％的上清刺激细胞样品(0.5×106)5-10分钟。根据已引入作参考的Demoulin等，分子细胞生物学164710(1996)制备核提取物。简言之，用PBS洗细胞，然后重悬于冰冷却的1ml低渗缓冲液15分钟。(缓冲液是10mM HEPES缓冲液，pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，5％甘油，0.5mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM DTT和1mM Pefabloc，1mM Na3V4，和5mM NaF)。加入65μl的NP-40裂解细胞，然后离心。14000rpm离心30秒沉淀核，用含HEPES(20mM)，甘油(20％)，和NaCl(420mM)的缓冲液抽提。离心2分钟除去核碎片。根据Demoulin等(出处同上)的方法确定DNA结合活性，其中用32P标记的双链寡核苷酸“GRR”，它包含FcγRI基因启动子的STAT结合位点，即5′ATGTATTTCCCAGAAA-3′(SEQ ID NO13)和5′-CCTTTTCTGGGAAATAC-3′(SEQ ID NO14)
其对应于GRR探针中结合位点的上链和下链。简言之，5μl核提取物在结合缓冲液(12mM HEPES，pH7.6，10mM KCl，0.5mM EDTA，2.5％甘油，0.1mg poly(dI-dC)/ml)中保温5分钟。加入放射标记的GRR探针(105cpm；大约0.5ng)，继续保温25分钟，然后上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶。
还注意到上述MES13细胞中发现的复合物在凝胶中的迁移被抗STAT5和抗STAT3抗体导致部分改变(overshift)，这表明(i)所检测的细胞是TIF的靶标，(ii)STAT5和STAT3是TIF活化的复合物中的重要成分。与上述实施例12比较，STAT的不同特点归因于细胞来源的不同(人对小鼠)。还观察到人TIF可在小鼠细胞中起作用，反之亦然。
实施例22本实施例详述编码人TIF的核酸分子的分离和克隆。首先，用标准的密度梯度离心制备人外周血单核细胞。随后，以3×106个细胞/ml的密度培养24小时，期间加入或不加抗CD3单抗(该抗体是市场购买的OKT3单抗，为1/500稀释的腹水)。使用该抗体是因为T细胞来源的细胞因子通常只在CD3特异性抗体的活化下表达。
采用标准异硫氰酸胍/CsCl超速离心技术从这些细胞中分离总RNA。用oligo(dT)15引物逆转录10μg的RNA样品。
如上述方法制备cDNA，用PCR扩增与100ng总RNA相当的cDNA，所用引物如下5′-AGCTGCTCAACTTCACCCTGGA-3′(SEQ ID NO15)5′-CCACTCTCTCCAAGCTTTTTCA-3′(SEQ ID NO16)它们均基于小鼠cDNA序列(即SEQ ID NO7)。进行30个循环的PCR，每个循环是94℃1分钟，42℃1分钟，72℃2分钟。用标准方法经琼脂糖凝胶分离扩增产物，然后测序。结果显示扩增的是cDNA片段。从而进行第二个反应，除用SEQ ID NO17(如下)替换SEQ ID NO16外，其余物质相同5′-CAAGTCTACCTCTGGTCTCAT-3′第二个PCR反应进行25个循环，每个循环为94℃1分钟，45℃1分钟，72℃2分钟。扩增产物的处理同第一个反应。结果显示扩增的是cDNA片段。
实施例23制备扩增产物后，用标准的5′-RACE技术分离5′端cDNA。简言之，以SEQ ID NO18(如下)作引物制备cDNA第一链
5′-TGGCCAGGAAGGGCACCACCT-3′这个引物基于实施例22的序列信息。简言之，5′-RACE法实施如下将上述制备的1μg总RNA，2.5pM的SEQ ID NO18，逆转录酶，逆转录缓冲液，2.5μl的dNTP混合物(10mM)，2.5μl MgCl2(25mM)，和2.5μl DTT(0.1M)混合。反应完成后，加入RnaseH和RnaseT1除去原始RNA。还除去未掺入的dNTP，引物和蛋白。用末端转移酶，或“TdT”给cDNA加尾。如下所述，该酶为缩短的锚定引物产生一3′结合位点。通过加入纯化的cDNA第一链，TdT，缓冲液(10mM Tris-HCl，25mM KCl，1.5mM MgCl2)和200μM dCTP进行加尾。
下面是加尾反应，用下述引物进行PCR反应5′-TGGCCAGGAAGGGCACCACCT-3′(SEQ ID NO19)和5′-RACE缩短的锚定引物5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′(SEQ IDNO20)。
扩增35个循环(每个循环为94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟)。随后对1/100稀释的扩增产物5μl，以SEQ ID NO19和缩短的通用扩增引物进行巢式扩增5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′(SEQ ID NO21)扩增30个循环(每个循环为94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟)。用标准方法克隆PCR产物，并测序。
这三个实验，即上述两个产生片段的实验，和上述5′-RACE PCR可使扩增产物已测序的序列进行对比排列，以产生完全的序列。
排列后得到推测的开放阅读框架侧翼的寡核苷酸序列5′-CCTTCCCCAGTCACCAGTTG-3′(SEQ ID NO22)和5′-TAATTGTTATTCTTAGCAGG-3′(SEQ ID NO23)。
这些引物用于扩增完整开放阅读框架，所用mRNA来自上述CD3特异性单抗刺激的细胞。扩增25个循环(每个循环为94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟)。
人cDNA的完整序列见SEQ ID NO24。
小鼠序列中可能的起始密码子在SEQ ID NO24的氨基酸1和13，对应于蛋氨酸的密码子在氨基酸58，85和92位。可能的起始物的密码子对应于分子量分别为19998d和18735d(分别为176和167个氨基酸)的蛋白。该蛋白的小鼠形式可见疏水性前导序列，提示大约20-40个氨基酸的N端信号序列。
实施例24这些实验详细描述与上述cDNA对应的人基因组DNA。
根据所述cDNA序列，将引物设计为与SEQ ID NO24的51-70位核苷酸和631-650位核苷酸相对应。用标准方法进行PCR。具体为，以100ng的基因组DNA作模板，扩增33个循环(每个循环为94℃30秒，50℃30秒，72℃5分钟)。分离序列并测序，将其示于SEQ ID NO25。该序列长约4.8Kb，被认为包含编码TIF分子的完整基因组序列，仅缺少5′侧翼区，启动子区和3′末端。
实施例25有必要确定上述基因组DNA是否位于人基因组中。为此采用两种不同的方法。在第一个方法中，用荧光标记上述SEQ ID NO25序列作为探针，采用标准的原位杂交(“FISH”)探查人的基因组。
第二个方法中，用SEQ ID NO24的51-70位核苷酸以及5′-ATCAGATGGATTACTGAATG-3′(SEQ ID NO26)作探针筛选一组放射性杂合克隆。用25ng的基因组DNA作模板进行PCR，扩增35个循环，每个循环为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟。
两种方法均显示该基因位于12q15。一些研究发现，哮喘与该位点有关。参见Nat.Genet.15389-392(1997)；Ober等，Hum.Mol Genet.7(9)1393-1398(1998)；Nickel等Genomic 46(1)159-162(1997)；Takahashi等Genomics44(1)150-2(1997)；Barnes等Genomics 37(1)41-50(1996)，均引入作参考。
实施例26这些实验描述与TIF蛋白结合的抗体的制备。为此，用标准方法将SEQID NO7编码的氨基酸40-61组成的肽与KLH载体蛋白耦联，比例为1mg肽比1mg载体蛋白。用150μg该复合物以两周的间隔免疫动物(兔)3次。第一次注射时，免疫原经完全弗氏佐剂乳化，后二次用不完全弗氏佐剂。
末次注射后1个月第一次放血，用已知方法制备血清。
用标准Western印记检测血清。简言之，从转染SEQ ID NO7或SEQID NO24的细胞取上清10μl，经SDS-PAGE电泳分离，然后印迹至PVDF膜。抗血清1∶500稀释，在标准Western印记方案中使用，还用到抗兔抗体作为二抗，用市售的检测试剂盒。
发现该血清确实可以识别TIF蛋白。
图1列出小鼠和人TIF的推测的氨基酸序列。框内可见高度同源序列。
以下实施例描述了本发明，其中一方面是分离的核酸分子，其编码TIF蛋白如具有核苷酸序列SEQ ID NO7，24或25所编码氨基酸序列的蛋白。本领域技术人员将认同，遗传密码的简并性有利于制备可能与SEQ ID NO7，24或25的核苷酸序列不同，但编码相同蛋白的核酸分子。当然，SEQ IDNO7，24和25是本发明的优选实施方案，但其它实施方案也是本发明的一部分。基因组DNA，cDNA和RNA，如mRNA均包括在内。从其它动物物种，包括其它哺乳动物分离的核酸分子也是本发明的一部分。本发明的一个优选方面为分离的核酸分子，其互补物可在严谨条件下与SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO24杂交。使用的“严谨条件”如在缓冲液(3.5xSSC)，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.1％SDS，2mM EDTA中65℃杂交，然后室温2xSSC洗涤，然后在如65℃的高温下0.1xSSC/0.2xSSC中洗涤。也可使用更严谨的条件，如0.1xSSC。这些核酸分子编码约17-22kD的蛋白，如SDS-PAGE所测，它们可活化STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5。经SDS-PAGE测定，这些蛋白的糖基化形式约为17到30kD。
本发明另一方面为包含本发明核酸分子的表达载体，所述核酸分子与启动子可操作性相连，从而可促进所述DNA的表达。制备这类载体是本领域技术人员已知的。
所述载体及核酸分子本身均可用于制备原核或真核的重组细胞，这些重组细胞中掺入了所述表达载体，或是核酸分子本身。根据本发明这一方面可使用的细胞类型有E.coli细胞，COS细胞，CHO细胞等。
本发明另一方面为上述核酸分子所编码的蛋白，优选其分离的形式。“蛋白”指核酸分子表达的直接产物，其糖基化形式，和多聚体形式，如二聚体，三聚体等。本发明还有一个部分是多聚体，如二聚体，其至少包含本发明的一个蛋白分子，和至少一个不同的蛋白分子。优选该不同的蛋白分子是细胞因子，如IL-10。本发明还有一个方面为构建体，如融合蛋白，其中上述蛋白的全部或一部分以某种形式，如融合蛋白的形式，与至少一种其它蛋白或多肽，或氨基酸序列相连。例如，“融合配对物”可以是直接或间接提供识别信号的分子，如FLAG肽，β-半乳糖苷酶，萤光素酶等。这些融合配对物优选与上述位于蛋白N端和/或C端的分子连接；但应理解已知有许多的技术可将分子与氨基酸连接，这些方法中任一个或全部均可尝试属于本发明的一部分的构建体。
如上所述，本发明的每个蛋白分子优选经SDS-PAGE测定分子量约17-30kD。当然在多聚体形式中，复合物的分子量会有变化，但其中所含TIF分子的分子量经SDS-PAGE测定均应为约17-30kD。
这些蛋白优选包含至少约120个氨基酸，不超过约200个氨基酸。优选这些氨基酸序列由SEQ ID NOS7，8，9，24或25编码的氨基酸序列组成，或包括其全部或部分。更优选该氨基酸序列包含上述各序列所编码的除前40个氨基酸以外的所有氨基酸。甚至更优选它包含这些序列所编码的除前20个氨基酸以外的所有氨基酸。最优选，该蛋白包含SEQ ID NO27或28所示的氨基酸。
本领域技术人员将认同，上述核苷酸分子所编码蛋白的是本发明的特征，并可用于根据标准方法产生抗体。这类单克隆或多克隆形式的抗体，以及所述抗体的片段、嵌合形式、人源化形式、重组形式等构成了本发明的另一方面。本发明的特征还有免疫原，其包含本发明蛋白分子的全部或部分氨基酸序列，优选与佐剂，如完全或不完全弗氏佐剂组合。这些蛋白序列的部分可与其它分子如匙孔血蓝蛋白连接，以增加其免疫原性。这些抗体可用于如确定是否有本发明蛋白存在。这是本发明的另一特征。现进行描述。实施例中已显示，存在IL-9时本发明核酸分子表达。因此，本发明的另一特征是确定IL-9是否存在或已经存在的一种方法，其中可用抗体检测本发明蛋白，或用本发明核酸分子作探针检测mRNA。可直接测定mRNA，或其cDNA形式。这些探针可标记或不标记，取决于使用者。因此，可通过测定本发明核酸分子的存在来确定给予IL-9后细胞因子是否仍有效。这类试验可用于如定量研究，其中可确定细胞是否对IL-9敏感，如果是，敏感程度如何。还可利用本发明的蛋白使STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5磷酸化。这样可使STAT蛋白形成二聚体，然后移至细胞核，从而级分这些STAT蛋白对细胞的效应。
可将这些分子施用于受试者，如淋巴瘤，免役系统疾病如过敏、获得性免疫缺陷综合征，自身免疫性糖尿病，甲壮腺炎或任何其它疾病，从而检验IL-9激动剂或拮抗剂的效力，所述疾病可见于的美国专利5830454；5824551，以及1997年9月8日提交，现在被批准的申请08/925348，均引入作参考。这些分子也可用于介导IL-9在这些或其它疾病中的作用。由于IL-9诱导TIF，故TIF是IL-9活性的有效介导物。因此，本发明另一方面是测定内源性IL-9活性的方法，如哮喘，过敏和淋巴瘤等与IL-9活性过度有关的情况中。还可用与TIF结合的反义分子，抗体，或这些分子的拮抗剂通过封闭或抑制TIF或TIF活性来封闭或抑制IL-9活性。例如TIF突变蛋白可与TIF受体结合但不能活化该受体，因此可抑制IL-9诱导的活性，它是本发明的又一特征。可用这类TIF突变蛋白治疗的疾病有过敏，哮喘等。本发明的突变蛋白可根据Weigel等，欧洲生物化学杂志180(2)295-300(1989)和EppS等，细胞因子9(3)149-156(1997)所述制备，均引入作参考。这类突变蛋白可用于治疗哮喘，过敏或二者。此外，本领域技术人员很清楚，上述分子还可用于筛选合适的突变蛋白。调节IL-9活性的能力对于上述疾病，以及凋亡，包括可地松诱导的凋亡，涉及BCL-3的核表达(因为已知IL-9诱导这种表达)等状态很重要。本文中“抗体”指与TIF结合的抗体的任何部分，包括嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的另一特征涉及本发明TIF型分子在其效应组织上刺激再生或抑制分化的能力。如上已示，TIF可靶向在多种肿瘤和正常细胞系(即肾小球膜细胞，神经元细胞，以及黑色素瘤细胞和肝癌细胞)。因此可在需要通过TIF分子的作用使组织再生的样品中，加入一定量的TIF型分子，从而刺激组织再生。该方法在体内、体外均可使用。同样，需要抑制特定组织，如黑色素瘤细胞或肝癌细胞分化时，可加入TIF拮抗剂。
如实施例25所述，编码TIF的基因定位于12号染色体。已知这一染色体与哮喘有关。因此，本发明另一实施方案是测定疾病(如哮喘或与哮喘有关的疾病)易感性的方法，其是通过确定TIF基因位点是否存在畸变，如多态性，缺失，添加等。这类畸变可以指示哮喘，过敏性疾病，或一或多种相关疾病的易感性或存在。检测DNA序列中的异常是本领域已知的，在此不再赘述。优选用标准技术，如PCR，并用上述方法和引物检测所述异常。
本发明的其它特征对本领域技术人员是显而易见的，无需赘述。
所用术语和表达方式旨在说明，并非限制，无意用这些术语和表达排除本文所示和所述特征或其部分的任何等价体，应理解各种修改均包括在本发明的范围内。
序列表<110>Dumoutier，LaureLouhed，JamilaRenauld，Jean-Christophe<120>分离的编码T细胞诱导因子(TIF)的核酸分子，其编码蛋白及其应用<130>LUD 5543.2PCT<140>PCT/US99/24424<141>1999-10-18<150>US09/354,243<151>1999-07-16<150>US09/178,973<151>1998-10-26<160>29<210>1<211>24<212>DNA<213>小鼠<220>
<400>1agcactctcc agcctctcac cgca 24<210>2<211>12<212>DNA<213>小鼠<220>
<400>2gatctgcggt ga 12<210>3<211>24<212>DNA<213>小鼠<220>
<400>3accgacgtcg actatccatg aaca 24
<210>4<211>12<212>DNA<213>小鼠<220>
<400>4gatctgttca tg 12<210>5<211>24<212>DNA<213>小鼠<220>
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<400>6gatct tccct cg 12<210>7<211>1119<212>DNA<213>小鼠<220>
<400>7taaacaggct ctcctctcac ttatcaactg ttgacacttg tgcgatctct gatggctgtc 60ctgcagaaat ctatgagttt ttcccttatg gggactttgg ccgccagctg cctgcttctc120attgccctgt gggcccagga ggcaaatgcg ctgcccgtca acacccggtg caagcttgag180gtgtccaact tccagcagcc gtacatcgtc aaccgcacct ttatgctggc caaggaggcc240agccttgcag ataacaacac agacgtccgg ctcatcgggg agaaactgtt ccgaggagtc300agtgctaaag atcagtgcta cctgatgaag caggtgctca acttcaccct ggaagacgtt360ctgctccccc agtcagacag gttccagccc tacatgcagg aggtggtacc tttcctgacc420aaactcagca atcagctcag ctcctgtcac atcagcggtg acgaccagaa catccagaag480
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<400>9gtctatcacc tgcttaagat tcttctaatt tataaaaaaa actatttctt aaaatgaaaa 60gcaaccagag cacgtattta tagcatggtg ttctgaccat gcaggtacag agtggaatgg120taagaggcgc tattatcagc attaaccaac atgttaatgt tttcttctgg caagcaaact180tgaaatctat gtcttaaaca atcttcaagc ctctaatata gtgctaacga ctggagtccg240ctgctgtcca acagagctct tgagcacgct ctcctctgtt tgcaatttta tgttctttga300tcgactcccc aacctctcac cttcggctcc tgatggccac ctttcaactt tctgcattta360tgaactccat gttttaatct ttttattaaa atattcacac aatcagtgtt tgtgcaagtc420tgtttcaccc acatgtatgt ctgtgcacca agtgctgcct ggtgcttgtg ggggcaagga480gcaggagagg gtgccctggc accggagtca cggatggttg tgagccacca tgaggatgct540
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1.一种体外刺激STAT转录因子表达的方法，包括使能够进行所述表达的细胞与一定数量的IL-TIF/IL-21相接触，使所述细胞足够刺激所述表达。
2.权利要求1的方法，其中所述STAT转录因子是STAT3或STAT1。
3.权利要求2的方法，其中所述STAT转录因子是STAT3。
4.权利要求1的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳动物IL-TIF/IL-21。
5.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
6.权利要求5的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21是由SEQ ID NO25或SEQ I D NO26所编码。
全文摘要
本发明涉及核酸分子的分离，其表达经IL－9上调。对应于该核酸分子的蛋白的氨基酸显示出细胞因子的某些结构特征。此外还公开了所述核酸分子和蛋白质分子的多种用途。这些分子可称作T细胞诱导因子。
文档编号C07H21/04GK1789411SQ200510116998
公开日2006年6月21日 申请日期1999年10月18日 优先权日1998年10月26日
发明者劳里·杜穆蒂尔, 杰米拉·劳埃德, 琼-克里斯托弗·雷诺尔德 申请人:路德维格癌症研究院