团头鲂低氧性状相关snp分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于鱼类分子标记制备领域，具体设及团头妨低氧相关基因fih-1的SNP 分子标记及应用，所述的分子标记可应用于团头妨育种基因型的辅助选择。
【背景技术】
[0002] 团头妨（Megalobrama amblyce地ala),俗称武昌鱼、编鱼，隶属于經形目，經科， 妨属，是我国重要的草食性经济鱼类之一。但与草鱼、經、娜等典型的經科鱼类相比，团头 妨是不耐低氧的种类，容易发生缺氧浮头，制约了其养殖产量的提高。而同一群体的不同个 体对低氧环境的耐受能力不同。因此团头妨耐低氧新品系的培育对于团头妨养殖业的发展 具有重要意义。
[0003] 低氧诱导因子（Hypoxia-in化ciblefactor,HI巧在动物耐受低氧的生理应答中 起关键作用，其活性主要由α亚基决定。因此，可W在分子水平上探究不同个体对低氧环 境的耐受能力的差异。HIF-1是在研究缺氧诱导的促红细胞生成素（&ryt虹opoietin，EP0) 基因表达时被发现的（SemenzaandWang1992)，研究显示缺氧可诱导细胞内HIF的活性 增强。HIF能够激活下游一系列氧敏感基因的转录，来调控诸如能量代谢、血管生成W及 细胞增殖和调亡等生理过程，从而维持机体在缺氧状态下的存活。目前已在多种鱼类中 都发现了HIF-la、HIF-2a和HIF-3QΞ种α亚基，其在低氧应答反应中发挥不同的功 能（Shenet曰1 2010)。HIF-1通过与其勒1基因上的低氧反应元件化ypoxiaresponsive element,HR巧结合，引发下游祀基因诸如EPO、诱导型一氧化氮合酶（in化cible nitricoxidesynthase,iNOS)、血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowth factor,VEGF)等基因的转录，从而影响红细胞生成、血管发生、细胞调亡和增殖等生理、病 理过程，并使机体产生一系列的缺氧适应性反应（陆蕴松等2009)。
[0004] HIF-1 抑制因子（factorinhibitingHIF-1，FIH-1)是一个重要的HIF-1 上游调 控基因。在常氧条件下它能够将HIF-la中天冬酷胺的氨基径基化，从而阻碍了HIF-1基 因C端的反式结构域TAD-C与转录辅因子CBP/P300的结合，抑制HIF-1的转录活性度ell etal2005)。相反，在低氧条件下，天冬酷胺径化酶活性受到抑制，从而增加了CBP/P300 的结合作用，促进祀基因的表达（化ee血anetal2002)。因此，FIH-1在低氧调节中具有 极其重要的作用。
[0005] 单核巧酸多态（singlenuclearpolymo巧hisms,SNPs)主要是指在基因组水平上 由于单个核巧酸的变异所引起的DNA序列多态性，即同一物种不同个体间染色体上遗传密 码单个碱基的变化。常表现为单碱基的转换、颠换、插入和缺失（唐立群等2012)。根据它 们在基因组分布的位置可分为基因编码区SNPs(cSNPs)、基因间SNPs(iSNPs)和基因周边 SNPs(pSNPs)Ξ类（Wanget曰1 1998)。Sun等（2007)通过关联分析发现CASP8基因启动 子区域-6526N缺失与肺癌风险的降低存在显著相关，同时对其进行了SNPs功能验证，发 现由于-6526N的缺失使得CASP8基因对应的mRNA表达量有所下降，最终导致T淋己细胞中 CASP8的活性和在癌细胞抗原诱导下的细胞死亡率降低。目前，SNPs分子标记已在鱼、邮、 蟹、贝等水产动物中得到了广泛的研究和应用，包括亲缘关系分析、遗传多样性调查、Q化定 位、分子标记辅助选育等方面。Moen等（2008)基于EST开发了 304个SNPs标记，构建了 大西洋娃雌性和雄性的SNP连锁图谱。Prudence等（2006)对太平洋牡颇（化assostrea gigas)amylase基因（AMYA和AMYB)进行了PCR-RFLP分析，结果表明，牡颇肉重与amylase 基因型显著相关，运对于遗传育种中提高牡颇生长速度具有重要的潜在价值。
[0006] 随着分子生物技术的发展，分子标记辅助育种在鱼类育种工作中越来越重要。分 子标记技术已开始应用于鱼类育种实践，并表现出其独特的优越性。但目前尚未见到有关 团头妨低氧相关基因的SNP分子标记的报道。而本发明在团头妨低氧耐受和低氧敏感群体 中进行fih-1基因的SNPs位点检测W及与低氧性状的关联分析，发现其SNPs与团头妨低 氧性状显著相关，本发明可用于团头妨遗传育种及功能基因组中。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供团头妨fih-1基因的SNP分子标记，利用分子标记作为团 头妨育种基因型的辅助选择。
[0008] 实现本发明的技术方案如下所示：
[0009] 本发明通过团头妨低氧处理及基因组DNA提取，引物设计，PCR扩增，产物纯化测 序，SNP分子标记的筛选与分析，W及通过限制性内切酶酶切法（PCR-RFL巧和高分辨率烙 解曲线法（HRM)在团头妨低氧敏感和耐受群体中确定基因型，利用SPSS软件进行数据处 理，卡方检验分析基因型与低氧性状的显著性差异，在fih-1基因共发现3个与团头妨低氧 性状显著相关的SNPs位点：即位于启动子上-402T/A突变位点，位于5'UTR上-106G/T突 变位点及位于3'UTR上+1557C/T突变位点（起始密码子设为0)。
[0010] 申请人通过基因克隆技术，获得团头妨低氧相关基因fih-lcDNA及启动子序列， 首次证实3个与团头妨低氧性状相关的基因fih多态性SNP分子标记，所述的分子标记是 下列基因片段所对应的核巧酸序列：
[0011] (1)团头妨fih-1基因启动子上的SNP分子标记，其核巧酸序列如SEQIDNO;1所 示，其中在该序列表的l〇9bp处有一个等位基因突变，利用HRM法来进行通量分析；
[001引 似团头妨fih-1基因5'UTR上的SNP分子标记，其核巧酸序列如沈QIDNO:2 所示，其中在该序列表的337bp处有一个等位基因突变，产生酶切多态性：
[001引 做团头妨fih-1基因3'UTR上的SNP分子标记，其核巧酸序列如沈QIDNO:3 所示，其中在该序列表的87bp处有一个等位基因突变，利用HRM法来进行通量分析。
[0014] 上述Ξ个标记为单独使用，且使用时无先后顺序。
[0015] 本发明所述-402T/A和+1557C/T位点的SNPs采用HRM方法制备，而-106G/T位 点采用PCR-RFLP方法制备。
[0016] 本发明制备的SNPs分子标记可应用在检测团头妨低氧相关基因fih-1多态性中， 可有效辅助选择低氧耐受基因型。
【附图说明】
[0017] 序列表SEQIDNO:1，是团头妨fih-1基因启动子和cDNA序列。
[0018] 序列表SEQIDN0:2,是用于检测团头妨fih-1基因启动子-402T/A突变位点的 序列，序列长度为163bp，是突变后的序列，突变位点灯/A)位于该序列的109bp处。
[0019] 序列表SEQIDNO:3是用于检测团头妨fih-1基因5'UTR区-106G/T突变位点 的序列，序列长度为49化P，是突变后的序列，突变位点（G/T)位于该序列的337bp处。
[0020] 序列表SEQIDNO:4是用于检测团头妨fih-1基因3'UTR区+1557C/T突变位点 的序列，序列长度为14化P，是突变后的序列，突变位点（C/T)位于该序列的87bp处。
[002。 序列表SEQIDN0:5,是用于检测团头妨fih-1基因启动子-402T/A突变位点的 突变前序列，序列长度为163bp。
[002引序列表SEQIDNO:6,是用于检测团头妨fih-1基因5'UTR区-106G/T突变位点 的突变前序列，序列长度为49化P。
[002引序列表SEQIDNO:7,是用于检测团头妨fih-1基因3'UTR区+1557C/T突变位点 的突变前序列，序列长度为14化P。
[0024] 是序列表SEQIDN0:8,是用于扩增团头妨fih-1基因-402T/A位点的左侧引物 序列。
[002引是序列表SEQIDN0:9,是用于扩增团头妨fih-1基因-402T/A位点的右侧引物 序列。
[0026] 序列表SEQIDN0:10,是用于扩增团头妨fih-1基因-106G/T位点的左侧引物序 列。
[0027] 序列表SEQIDN0:11，是用于扩增团头妨fih-1基因-106G/T位点的右侧引物序 列。
[0028] 序列表SEQIDN0:12,是用于扩增团头妨fih-1基因+1557C/T位点的左侧引物 序列。
[0029] 序列表SEQIDN0:13,是用于扩增团头妨fih-1基因+1557C/T位点的右侧引物 序列。
[0030] 图1 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因启动子中-402T/A位点不同基因型的 测序峰图。
[003。 图2 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因5'UTR中-106G/T位点不同基因型的 测序峰图。
[003引 图3 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因3'UTR中+1557C/T位点不同基因型的 测序峰图。
[003引图4 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因启动子中-402T/A位点不同基因型的HRM结果。
[0034] 图5 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因5'UTR中-106G/T位点PCR-RFLP产物MboI酶切电泳结果分析。
[003引 图6 :本发明的实施例中团头妨fih-1基因3'UTR中+1557C/T位点不同基因型的 HRM结果。
[003引 图7 :是团头妨fih-1基因启动子和cDNA序列（SEQIDNO:1)。
[0037] 图8 :是用于检测团头妨fih-1基因启动子-402T/A突变位点的序列（SEQIDNO: 2)，序列长度为163bp，是突变后的序列，突变位点灯/A)位于该序列的109bp处。
[003引图9 :是用于检测团头妨fih-1基因5'UTR区-106G/T突变位点的序列（SEQID NO:3)，序列长度为49化p，是突变后的序列，突变位点（G/T)位于该序列的337bp处。
[0039] 图10 :是用于检测团头妨fih-1基因3'UTR区+1557C/T突变位点的序列（SEQID NO:4)，序列长度为14化P，是突变后的序列，突变位点（C/T)位于该序列的87bp处。
[0040] 图11 :是用于检测团头妨fih-1基因启动子-402T/A突变位点的突变前序列（SEQ IDNO:5)，序列长度为163bp。
[0041] 图12 :是用于检测团头妨fih-1基因5'UTR区-106G/T突变位点的突变前序列 (沈QIDNO:6)，序列长度为49化P。
[0042] 图13 :是用于检测团头妨fih-1基因3'UTR区+1557C/T突变位点的突变前序列 (沈QIDNO: 7)，序列长度为14化P。
[004引 图14 :是用于扩增团头妨fih-1基因-402T/A位点的左侧引物序列（SEQIDNO: 8)。
[0044] 图15 :是用于扩增团头妨fih-1基因-402T/A位点的右侧引物序列（SEQIDNO: 9) ο
[004引 图16 :是用于扩增团头妨fih-1基因-106G/T位点的左侧引物序列是（SEQIDNO: 10) 。
[004引图17 :是用于扩增团头妨fih-1基因-1