专利名称：分离的编码t细胞诱导因子或白介素－21的核酸分子,其编码的蛋白和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及新分离的核酸分子及其应用。该核酸分子显示可被白介素-9(“IL-9”)上调。本文还公开了这些核酸分子所编码的蛋白。这些分子曾被称为“T细胞衍生的诱导因子”或“TIFs”；但是现在它们被称为“白介素-21”或“IL-21”，也叫做“IL-TIF”。为此，这些术语在本文中是可以相互替换的。这些核酸分子编码的蛋白可诱导细胞中STAT活化。它们可用于如刺激靶组织再生。而且，它们的抑制剂或拮抗剂(antagonist)可用于延迟、阻滞或抑制其它组织的分化。
背景技术：
和现有技术在过去十年中，对免疫系统及其调节作用的了解不断深入。其中一个倍受瞩目的领域是对调节免疫系统的蛋白和糖蛋白的研究。这些分子中最了解的家族之一是细胞因子。这些分子参与细胞间“通信”。细胞因子家族的个别成员参与了更广泛的病理过程，如癌症和过敏症。一方面细胞因子参与病理过程，另一方面它们也具有治疗价值。
白介素是其中一类细胞因子。有关白介素的文献很多。不可能穷举本领域的全部专利，仅示范性地举例包括Mertelsmann等的U.S.Patent No.4,778,879；Stern的U.S.Patent No.4,490,289；Mark等的U.S.PatentNo.4,518,584；以及Miyaji等的U.S.Patent No.4,851,512，它们都涉及白介素-2或“IL-2”。涉及白介素-1(“IL-1”)的其它专利，如Cosman的U.S.Patent No.4,808,611。所有这些专利均全文引入作为参考。涉及不同白介素的更近期专利包括U.S.Patent No.5,694,234(IL-13)；5,650,492(IL-12)；5,700,664；5,371,193和5,215,895(IL-11)；5,728,377；5,710,251；5,328,989(IL-10)；5,580,753，5,587,302，5,157,112，5,208,218(IL-9)；5,194,375，4,965,195(IL-7)；5,723,120，5,178,856(IL-6)和5,017,691(IL-4)。对专利文献的粗略回顾显示，白介素家族成员的特定多样。可以设想更大的细胞因子家族将显示更多的多样性。参见，如Aggarwal等的Human CytokinesHandbook For Basic AndClinical Research(Blackwell Scientific Publications，1992)，Paul编，Fundamental Immunology(Raven Press，1993)，763-836页，“T-CellDerived Cytokines And Their Receptors”，以及“ProinflammatoryCytokines and Immunity”。所有引用的文献均全文引入作为参考。
各种细胞因子之间的关系很复杂。从引用的文献可见，特定细胞因子水平的增高或降低可以直接或间接影响受试者所产生的其它分子的水平。受影响的分子有些是其它细胞因子。
白介素-9，曾被称为“P40”，是T细胞衍生的分子，最初被鉴定为支持T4细胞系的持久抗原非依赖性生长的因子。见如Uyttenhove等，Proc.Natl.Acad.Sci.856934(1988)，和Van Snick等，J.Exp.Med.169363(1989)，以及Simpson等，Eur.J.Biochem.183715(1989)，均引入作为参考。
首先观察到IL-9对限制性T4细胞系的活性，但未观察到对CTL或新分离的T细胞的活性。见如Uyttenhove等，同上，和Schmitt等，Eur.J.Immunol.1921679(1989)。当实验确定IL-9和称作T细胞生长因子III(“TCGF III”)的分子与MEA(肥大细胞生长增强活性)作用相同时，其活性范围扩大了，其中MEA是可增强骨髓来源的肥大细胞对IL-3的增殖应答的因子，可见于Hültner等，Eur.J.Immunol.和U.S.Patent No.5,164,317，这两篇文献均引入作为参考。还发现人型IL-9刺激成巨核细胞白血病的增殖。可参见Yang等，Blood741880(1989)。对IL-9的研究显示其还可以支持红细胞集落形成(Donahue等，Blood 75(12)2271-2275(6-15-90))；促进髓系红细胞爆发形成的增殖(Williams等，Blood 78(8)306-311(9-1-90))；支持成人和胎儿来源的BFU-E’s的克隆成熟(Holbrook等，Blood 77(10)2129-2134(5-15-91))。IL-9的表达还与霍奇金病和大细胞退行性淋巴瘤有关(Merz等，Blood 78(8)1311-1317(9-1-90))。对易患或不易患支气管过度反应的小鼠的遗传分析揭示，这一模型与IL-9基因的联系，及IL-9产量与易感性的关系(Nicolaides等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9413175-13180，1997)。人类遗传学研究也指出IL-9和IL-9R基因是哮喘的候选基因(Doull等，Am.J.Respir.Crit.CaTe Meded.，153，1280-1284，1996；Horoyd等，Genomics52，233-235，1998)。同样，对IL-9转基因小鼠的研究证实IL-9表达增加导致肺肥大细胞增生病，嗜酸细胞增多症，支气管过度反应和高水平的IGE(Temann等，J.Exp.Med.188，1307-1320，1998；Godfraind 等，J.Immunol.160，3989-3996，1998；McLane等，Am.J.Resp.Cell.Mol.19713-720(1999))。综上所述，这些观察有力地说明IL-9在该疾病中发挥重要作用。另有研究表明IL-9及其突变蛋白与哮喘和过敏有关。见PCT申请US96/12757(Levitt等)和PCT US97/21992(Levitt等)，均引入作为参考。
已知IL-9能够影响受试者体内其它分子的水平。参见Louahed等，J.Immunol.1545061-5070(1995)；Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710-4716(1996)，均引入作为参考。还认识到受影响的分子在生物系统中具有自己的功能。例如，Demoulin等显示IL-9的众多已知活性由STAT转录因子的活化介导。因此，一直在尝试对其存在和/或水平受其它分子如细胞因子影响的分子进行鉴定。
以下内容将描述这类分子。发现编码本发明蛋白的核酸分子在IL-9存在时表达，缺乏IL-9时不表达。因此，这些分子尤其是受试者中IL-9的表达或效应的“标志”。这些曾被称为T细胞衍生的诱导因子或“TIF”的分子现在被称为白介素-21，或“IL-21”。下面的描述将显示本发明的这些及其它特点。
优选实施例详述实施例1已知小鼠淋巴细胞系BW5147可在体外生长，且其培养基中不需加入任何细胞因子。为确定经IL-9诱导的基因，BW5147样品用或不用IL-9(200U/ml)培养24小时。然后，用异硫氰酸胍裂解，CsCl梯度离心，分离总RNA。这些是本领域公知技术。之后，用oligo(dT)纤维素柱从总RNA中纯化多聚腺苷化RNA。然后用分离的polyA RNA生成双链cDNA。使用商业可获得的oligo(dT)引物。3-5μg polyA RNA的任意部位与1μg寡聚dT加热至70℃，10分钟，然后与5x第一链缓冲液(250mM HCl(pH8.3)，375mMKCl，15mM MgCl2)，10mM二硫苏糖醇，500μM脱氧核苷三磷酸，和800U逆转录酶一起孵育。反应总体积是20μl，37℃反应1小时。由此合成第一条cDNA链。加入30μl的5x第二链缓冲液(100mM Tris-HCl(pH6.9))，450mM KCl，23mM MgCl2，0.75mMβ-NAD+，50mM(NH4)2SO4，60U大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶，2U的大肠杆菌RNase H，10U的大肠杆菌DNA连接酶，和250μM脱氧核苷三磷酸，终体积150μl，来实现第二链的合成。混合物在16℃孵育2小时。
产物用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。cDNA终产物重悬于200μl TE。
对接受刺激的BW5147细胞(下文中称为“试验物”(tester))，和平行的未受刺激的BW5147(下文中称为“对照物”(driver))进行这些步骤。实施例2根据已知的方法将实施例1中制备的cDNA进行扣除克隆(sub tractloncloning)。为此，制备了6个寡核苷酸5′-AGCACTCTCC AGCCTCTCAC CGCA-3(SEQ ID NO1)；5′-GATCTGCGGT GA-3′(SEQ ID NO2)；5′-ACCGACGTCG ACTATCCATG AACA-3′(SEQ ID NO3)；5′-GATCTGTTCA TG-3′(SEQ ID NO4)；5′-AGGCAACTGT GCTATCCGAG GGAA-3′(SEQ ID NO5)；和5′-GATCTTCCCT CG-3′(SEQ ID NO6).
这些序列作如下使用。双链cDNA(2μg)用限制性内切酶DpnII消化，用酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，重悬于20μl TE(100mM Tris-HCl(pH7.5)；1mM EDTA)中。12μl酶切的cDNA(1.2μg)与4μl脱盐的SEQ ID NO1(2mg/ml)，4μl脱盐的SEQ ID NO2(1mg/ml)，10μl 5x衔接子缓冲液(330mM Tris-HCl，pH7.6，50mM MgCl2，5mM ATP，7μl DDT(100mM)，和28μl水混合，使所述cDNA连接到双链SEQ ID NO1和2。加热该混合物到50℃，使寡核苷酸之间及与样品DNA间退火，然后冷却到10℃ 1小时以上，再加入5μl T4 DNA连接酶，在12-16℃孵育12-14小时。加入140μl TE稀释。然后用200μl样品以如下方式进行PCR。实施例3为进行PCR，取200μl样品与2μg SEQ ID NO1在72℃加热3分钟，去除与实施例2中产物杂交的SEQ ID NO2，其中所述样品是含有2μl连接产物的66mM Tris-HCl，pH8.8，4mM MgCl2，16mM(NH4)2SO4，33μg/ml BSA，0.3mM各种dNTP(浓度500μM)的缓冲液。用5U的Taq聚合酶(72℃，5分钟)填平3’端。扩增20个循环(每个循环95℃ 1分钟，72℃ 3分钟)，将产物汇总后，酚抽提，乙醇沉淀，重悬于TE缓冲液，使其浓度为0.5μg/μl。下文中将其称为代表产物(representation)。实施例4然后代表产物经DpnII消化，去除其中的SEQ ID NO1，准备扣除杂交。消化产物经酚抽提，乙醇沉淀。所用为未刺激的样品时即产生对照物，所用为刺激的样品时则产生试验物。部分试验物(20μg)经1.2％琼脂糖凝胶纯化和分离。用上述连接SEQ ID NO1和SEQ ID NO2同样的方法，将样品(2μg)与SEQ ID NO3和SEQ ID NO4连接起来。
在扣除杂交的首次循环中，将0.4μg已连接了SEQ ID NO3和4的试验物样品与40μg对照物cDNA混合。混合物经酚抽提，乙醇沉淀，溶于2μl3xEE缓冲液(30mM EEPS pH8.0)，3mM EDTA；pH8.0，3mM EDTA。加盖30μl矿物油，在98℃变性5分钟。加入5M NaCl(0.5μl)，然后，DNA在67℃杂交20小时。用TE和tRNA载体稀释反应混合物到200μl。样品72℃孵育3分钟，使SEQ ID NO4解链，然后进行4个PCR反应(200μl)。这包括20μl经稀释的无引物的杂交混合物，用于填平重新退火的试验物末端，加入SEQID NO3样品后，进行10个扩增循环(每个循环95℃ 1分钟，70℃ 3分钟)，将产品汇总后，酚抽提，乙醇沉淀，重悬于40μl 0.2x TE缓冲液。将20μl该材料用20U绿豆核酸酶处理30分钟以降解单链DNA，此步骤的总体积为40μl。用50mM Tris-HCl，pH8.9稀释样品(1∶5)，然后98℃加热5分钟使酶失活。用20μl上述产物，2μl SEQ ID NO3(1mg/ml)，和1μl(5U)Taq DNA聚合酶进行第二轮PCR。共进行18轮循环(每个循环95℃ 1分钟，70℃ 3分钟)。将产物汇总，酚抽提，乙醇沉淀，重悬至0.5-1μg/μl。该产物称为“DP1”，或第一个示差产物(difference product)。实施例5
DP1如上述用内切酶DphII消化，与SEQ ID NO5和6连接，过程同SEQ ID NO1，2，3和4的描述。重复实施例4描述的扣除杂交和选择性扩增，则产生了第二个示差产物，或“DP2”。这些实验中50ng的DP1是试验物。对照物(40μg)如上所述。重复上述过程，用SEQ ID NO3和4作接合物，产生第三个示差产物。为产生第三个示差产物，将100pg的试验物与40μg对照物混合。重复上述所有实验步骤，但最后扩增22轮循环，其中每个循环为95℃1分钟，70℃3分钟。如此产生最终示差产物。实施例6用DpnII消化最终示差产物。克隆到商业可获得载体pTZ19R的BamHI位点。制备双链DNA质粒，然后用常规方法测序。其序列用BLAST检索程序与GenBank和EMBL数据库的已知序列进行比较。
在扣除过程的最后，确定了一段短cDNA片段，即，约200个碱基对长度的片段。这个片段用于筛选BW5147细胞的cDNA文库。对最大的克隆进行测序。下面将对其进行讨论。其不与任何已知序列相符。
核苷酸序列(SEQ ID NO7)长1119个碱基对，包括537个碱基对的开放阅读框，其编码长179个氨基酸的蛋白质。该蛋白的预计分子量是20,093。另有两个ATG密码子，假如作为起始密码子，将分别产生长172和167个氨基酸的蛋白，分子量分别为19,335和18,770道尔顿。该蛋白的每中形式的特征在于有一段疏水氨基酸序列，该序列在穿过内质网时被切除，从而产生成熟蛋白。
对该序列的分析显示具有三个富含AT的基序(TTATTTAT)。常在细胞因子和癌基因的5’非翻译区发现这些基序。Kruys等，Science 245852(1989)显示这些重复区可以调整mRNA的稳定性。实施例7以上述实施例6中分离和分析的cDNA作探针，鉴定TIFα的基因组DNA。
采用标准方法用SEQ ID NO7筛选小鼠品系129的基因组文库。将一个阳性克隆的EcoRI片段亚克隆到pZERO质粒中，并部分测序。这部分序列称为SEQ ID NO8。实施例8上面实施例7中所述阳性克隆的第二个EcoRI片段也被亚克隆。同源性很高，但序列不相同。具体而言，这个序列的内含子1与SEQ ID NO8有98％相同，内含子2有100％相同，内含子3有92％相同。
令人惊讶的时，该序列中的启动子均无同源性，说明其调节是独立的。5’非翻译区有92％相同。TIFα的第一外显子分为外显子1α和外显子1β。第一编码外显子(TIFα外显子1b和TIFβ外显子1)有99.5％相同，第二外显子100％相同，第三外显子97％相同，第四外显子98.5％相同，第五外显子是96％相同。非翻译区中的同源性为96％。实施例9用上述实施例8中的信息，推测出所述第二个克隆的cDNA序列，称为TIFβ，如SEQ ID NOSEQ ID NO9所示。还用上述同样的方法确定了基因组DNA序列，如SEQ ID NO42所示。其氨基酸序列如SEQ ID NO41所示。
与TIFα相比，TIFβ的编码区有6个沉默改变。有两个改变导致不连续的氨基酸改变(在36位和113位，TIFα的Val变为TIFβ的Ile)。在112位有一个更显著的改变，由Gln变为Arg。实施例10用实验研究TIF的表达。用重组小鼠IL-9(200U/ml)刺激BW5147细胞达不同时长(0.2，0.5，1，2和24小时)。用标准方法和试剂分离总RNA。使用5μg总RNA和oligo(dT)引物进行逆转录。对应于20ng总RNA的cDNA样品用不同引物扩增25个循环。(每个循环94℃ 4分钟，57℃ 1分钟，72℃ 2分钟)。TIF引物为5’-CTGCCTGCTT CTCATTGCCC T-3’(SEQ ID NO10)和5’-CAAGTCTACC TCTGGTCTCA T-3’(SEQ ID NO11)(分别是有义链和反义链)它们分别对应于SEQ ID NO7的107-127和766-786核苷酸。B-肌动蛋白作为对照也进行扩增，扩增18个循环(第一个循环94℃ 4分钟，60℃1分钟，72℃2分钟。后续循环是94℃1分钟，60℃1分钟，72℃2分钟)。
扩增后，PCR产物经1％琼脂糖凝胶分析，用放射标记的内部探针印记证实特异性扩增。TIF探针为5’-GACGCAAGCA TTTCTCAGAG-3’(SEQ ID NO12)所示条件和探针并非特异于TIF的某一种形式；然而，TIFα的扩增产物包含一个KpmI限制位点，而TIFβ无此限制位点。用KpnI消化扩增产物显示，IL-9诱导的主要(如果不是全部)TIF mRNA是TIFα，说明经IL-9迅速诱导TIFα的表达。刺激30分钟后可以检出TIFα的mRNA，在1-24小时内达到平台期。实施例11进行实验，该实验显示上述IL-9对TIF mRNA的诱导不需要合成蛋白。在这些实验中，如实施例10所述，从刺激24小时的细胞中抽提总RNA，用或不用10μg/ml的蛋白合成抑制剂放线菌酮作用4.5小时。在一组平行实验中，细胞未受刺激。如实施例10所述抽提总RNA并进行RT-PCR扩增。用EB染色的1％琼脂糖凝胶分析PCR后的产物。结果发现当蛋白合成被阻断时，IL-9的诱导仍会发生。因此IL-9的作用是直接作用，不需要蛋白介导物的合成。实施例12在这些实验中，用BW5147细胞系的衍生物来研究STAT蛋白对TIF mRNA的诱导作用。第一个细胞系，BWh9R，表达野生型人IL-9受体。BW-Phe116细胞系是具有单个突变(在116位)的转染子，它使受体不能活化STAT转录因子。另一个细胞系BW-mut6，具有一个突变，它使受体不能活化STAT5，但仍有活化STAT1和STAT3的能力。最后，细胞系BW-mut7具有一个突变，它使IL-9受体不能活化STAT1和STAT3，但仍有活化STAT5的能力。
如实施例10所述，刺激细胞，分离总RNA，逆转录并扩增cDNA(细胞被刺激24小时，使用人和鼠重组IL-9)。如上所述，PCR产物在EB染色的1％琼脂糖凝胶上分析。
分析显示，人IL-9不能诱导BW-Phe116的表达，说明其涉及STAT转录因子。已发现IL-9在BW-mut6突变体中可诱导TIF表达，但在mut7变异体中不能诱导，说明其与STAT1或STAT3有关，而不涉及STAT5。实施例13研究正常小鼠脾细胞中TIF mRNA的表达。
培养来自10-12周龄的Balb/c小数的脾细胞24小时，所用培养基为对照培养基或补充有20μg/ml LPS(其可活化B淋巴细胞和巨噬细胞)，或ConA(其可活化T细胞)，或ConA加1％抗小鼠IL-9的阻断抗血清的对照培养基，以β-肌动蛋白作为对照。如上纯化RNA，进行RT-PCR分析。
数据显示，TIF在休眠的脾细胞中表达很弱，不受LPS诱导，但受ConA的强烈诱导。抗IL-9的抗血清不能影响ConA的诱导作用，说明该效应不经IL-9介导，或经其它细胞因子介导。
用RT-PCR产物的序列分析ConA活化的脾细胞，发现这些细胞主要表达TIFα，或排它性地表达TIFα。实施例14进一步的研究显示，即使在缺乏IL-9诱导时，TIF mRNA仍能表达。用尼龙毛(wool)柱从来自5周龄FVB小鼠的脾细胞中富集T细胞。然后在补充有ConA(一种T细胞活化物)或PMA(其能够在大多数细胞中激活PKC)的培养基中，加入或不加入IL-9的情况下，刺激所述细胞24小时。
用标准技术分离总RNA，10μg样品在含有2.2M甲醛的1.3％琼脂糖凝胶上电泳分离，转至硝酸纤维素膜上，标记，按Van Snick等，J.Exp.Med.，169363(1989)的杂交实验进行分析，该文献引入作为参考。
结果显示，ConA对TIF的诱导不能被修饰，而IL-9在PMA活化的脾细胞中不能诱导TIF RNA。实施例15检测各种细胞系中TIF mRNA的表达。在这些实验中，用特定的细胞因子刺激小鼠细胞系至少一天。具体为，9T7是一种T细胞淋巴瘤，其可对IL-2，IL-4或IL-9产生应答。TS3和TS6细胞系是来自T辅助细胞克隆，并在IL-2或IL-9存在下增殖。MC9和LI38是肥大细胞系，其在IL-3或IL-9存在下增殖。
刺激后，用常规的异硫氰酸胍裂解和CsCl梯度离心制备总RNA。
然后用Northern印记分析9T7细胞系，用上述RT-PCR方法分析其它细胞系。
发现IL-9可上调T辅助细胞和肥大细胞中TIF的表达。IL-2和IL-3则不能。然而，无论是否存在细胞因子，9T7细胞系中显示大致相同的表达水平，说明IL-9对于TIF的表达不是必须的。实施例16然后研究B细胞系中TIF mRNA的表达。A20，70Z/3和BCL-1是B细胞白血病细胞系，它们体外生长不需要细胞因子。这些细胞用IL-4和IL-9刺激24小时，用标准方法分离总RNA。如上述经RT-PCR扩增35个循环，然后经印记和杂交来分析其表达。
结果显示，在B细胞中检出TIF的表达，IL-9和IL-4存在时最多仅有很弱的上调。实施例17研究本发明分子在T辅助细胞系中的表达。TS2和TS1是已知的T辅助细胞系，它们来自T辅助细胞克隆，在IL-9或IL-2(TS2)和IL-9或IL-4(TS1)存在下增殖。具体为，存在列出的细胞因子时，TS2或TS1细胞可生长至少10天，然后用已知方法抽提RNA。用上述的实验方法，经RT-PCR(35个循环)研究这些分子的表达。IL-4和IL-9均可诱导TS1细胞TIF的表达，IL-2不能诱导TS2表达TIF。实施例18研究不同小鼠器官TIF mRNA的表达。用标准的异硫氰酸胍方法和CsCl梯度离心，从肝，肾，心，脑，肠，脾，胸腺，肺，肌肉和骨髓中制备总RNA。用上述方案进行40个循环的RT-PCR。在胸腺组织者发现最强表达，脑组织中发现次强的信号，在其它组织者表达比这两者弱。实施例19以下实验描述了293-EBNA细胞中产生TIFα。
TIFα的互补DNA如上所述。将其亚克隆到商业可获得的pCEP-4表达载体并与CMV启动子操纵性连接。用标准脂转染胺(lipofectamine)方法将所获的质粒转染到293-EBNA细胞。转染后，细胞在不含蛋氨酸但补充了35S标记蛋氨酸的培养基中孵育24小时。收集上清，进行丙烯酰胺凝胶电泳。胶干燥后放射自显影1天。将cDNA以反义方向克隆到相同质粒后，转染细胞作为对照。
发现用TIF正向转染的细胞有一条大约25-30kd的异质性带。在本系统中，预测分子量与实际分子量之间的偏差以及异质性均归因于糖基化。在一组平行实验中，编码人TIF的cDNA的表达方式与小鼠cDNA的表达方式相同。除了cDNA的改变，所以实验参数均相同。实施例20进一步进行实验来研究COS细胞中TIFα的产生。具体为，将TIFα的cDNA亚克隆到上述Demoulin等描述的质粒pEF-BOS.puro中，与EF-1α启动子操纵性连接。采用上述同样的脂转染胺方法将质粒cDNA转染到COS细胞。细胞在不含蛋氨酸但补充了35S标记蛋氨酸的培养基中孵育24小时，之后用上面实施例19所述方法处理上清。再次观察到一条25-30kd的异质性带，还有一条18kd的带，其很可能代表该分子的非糖基化形式。实施例21从以下实验发现TIF能够诱导肾小球膜细胞、神经元黑色素瘤细胞和肝癌细胞中STAT的活化。已知当细胞因子活化STAT因子时，这些因子形成二聚体，从胞浆移至核内，与启动子的靶序列结合。实验细节如下。
如上述转染的293-EBNA细胞在正常培养基中孵育48小时备用，对照上清也如上述处理。使用小鼠肾小球膜细胞系(下文中称为“MES13”)样品，大鼠嗜铬细胞瘤细胞系(下文中称“PC12”)，4种不同的人黑色素瘤细胞(SK23，AUMA，NA-8mel和MULL)，人肝癌细胞(HepG3)和大鼠肝癌细胞(H-4-II-K)。在1％的上清存在下，刺激细胞样品(0.5×106)5-10分钟。根据已引入作为参考的Demoulin等，Mol.Cell.Biol.164710(1996)制备核提取物。简言之，用PBS洗涤细胞，然后重悬于冰冷却的1ml低渗缓冲液15分钟。(缓冲液是10mM HEPES缓冲液，pH7.5，10mM KCl，1mM MgCl2，5％甘油，0.5mM EDTA，0.1mM EGTA，0.5mM二硫苏糖醇和1mM Pefabloc，1mMNa3V4，和5mM NaF)。加入65μl的NP-40裂解细胞，然后离心。14000rpm离心30秒沉淀核，用补充有HEPES(20mM)，甘油(20％)和NaCl(420mM)的缓冲液抽提。离心2分钟除去核碎片。根据上述Demoulin等的方法确定DNA结合活性，使用称为“GRR”的32P标记双链寡核苷酸，它包含FcγRI基因启动子的STAT结合位点，即5’-ATGTATTTCCCAGAAA-3’(SEQ ID NO13)和5’-CCTTTTCTGGGAAATAC-3’(SEQ ID NO14)其对应于GRR探针中结合位点的上链和下链。简言之，5μl的核提取物在结合缓冲液(12mM HEPES，pH7.6，10mM KCl，0.5mM EDTA，2.5％甘油，0.1mg poly(dI-dC)/ml)中孵育5分钟。加入放射标记的GRR探针(105cpm；约0.5ng)，继续孵育25分钟，然后上样至非变性聚丙烯酰胺凝胶。
还注意到上述MES13细胞中发现的复合物在凝胶中的迁移被抗STAT5和抗STAT3抗体导致部分改变(overshift)，这表明(i)所检测的细胞是TIF的靶目标，(ii)STAT5和STAT3是TIF活化的复合物中重要成分。与上述实施例12比较，STAT图谱的差异归因于细胞来源的不同(人和小鼠相比)。还观察到人TIF可在小鼠细胞中起作用，反之亦然。实施例22本实施例详述编码人TIF的核酸分子的分离和克隆。首先，用标准的密度梯度离心制备人外周血单核细胞。随后，以3×106个细胞/ml的密度培养24小时，其间加入或不加抗CD3单抗(该抗体是商业可获得的OKT3单抗，为1/500稀释的腹水)。使用该抗体是因为T细胞来源的细胞因子通常只在CD3特异性抗体的活化下表达。
采用标准异硫氰酸胍/CsCl超速离心技术从这些细胞中分离总RNA。用oligo(dT)引物逆转录10μg的RNA样品。
如上述方法制备cDNA，用PCR扩增与100ng总RNA相当的cDNA，所用引物如下5’-AGGTGCTGAACTTCACCCTGGA-3’(SEQ ID NO15)5’-CCACTCTCTCCAAGCTTTTTCA-3’(SEQ ID NO16)它们均基于小鼠cDNA序列(即SEQ ID NO7)。进行30个循环的PCR，每个循环是94℃ 1分钟，42℃ 1分钟，72℃ 2分钟。用标准方法经琼脂糖凝胶分离扩增产物，然后测序。结果显示扩增的是cDNA片段。从而进行第二个反应，除用SEQ ID NO17替换SEQ ID NO16外，其余物质相同，SEQID NO17为；5’-CAAGTCTACCTCTGGTCTCAT-3’第二个PCR反应进行25个循环，每个循环为94℃ 1分钟，45℃ 1分钟，72℃2分钟。扩增产物的处理同第一个反应。418个核苷酸的片段被扩增，该片段被发现于抗CD-3刺激的细胞中，但未见于休眠的(resting)PBMCs中。该片段的核苷酸序列如SEQ ID NO18所示。实施例23制备扩增产物后，用标准的5’-RACE技术分离5’端cDNA。简言之，以SEQ ID NO19(如下)作为引物制备cDNA第一链5’-TGGCCAGGAAGGGCACCACCT-3’这个引物基于实施例22的序列信息。简言之，5’-RACE法实施如下将上述制备的1μg总RNA，2.5pM的SEQ ID NO19，逆转录酶，逆转录缓冲液，2.5μl的dNTP混合物(10mM)，2.5μl MgCl2(25mM)，和2.5μl DDT(0.1M)混合。反应完成后，加入RnaseH和RnaseT1除去原始RNA。还除去未掺入的dNTP，引物和蛋白。用末端转移酶，或“TdT”给cDNA加尾。如下所述，该酶为缩短的锚定引物产生3’结合位点。通过加入纯化的cDNA第一链，TdT，缓冲液(10mM Tris-HCl，25mM KCl，1.5mM MgCl2)和200μM dCTP进行加尾。
下面是加尾反应，用下述引物进行PCR反应5′-CCTATCAGAT TGAGGGAACA G-3′(SEQ ID NO20)和5’-RACE缩短的锚定引物5′-GGCCACGCGT CGACTAGTAC GGGIIGGGIIGGGIIG-3′(SEQ ID NO21)。
扩增35个循环(每个循环为94℃ 1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟)。随后对1/100稀释的扩增产物5μl，以SEQ ID NO20和缩短的通用扩增引物进行巢式扩增(nested amplification)5’-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3’(SEQ ID NO22)扩增30个循环(每个循环为94℃1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 2分钟)。用标准方法克隆PCR产物，并测序。
这三个实验，即上述两个产生片段的实验，和上述5’-RACE PCR可使扩增产物已测序的序列进行对比排列，以产生完全的序列。
排列后得到推测的开放阅读框侧翼的寡核苷酸序列5’-CCTTCCCCAGTCACCAGTTG-3’(SEQ ID NO23)和5’-TAATTGTTATTCTTAGCAGG-3’(SEQ ID NO24)。
这些引物用于扩增完整开放阅读框，所用mRNA来自上述CD3特异性单抗刺激的细胞。扩增25个循环，(每个循环为94℃1分钟，56℃1分钟，72℃2分钟)。
人cNDA的完整序列见SEQ ID NO25。其含有537个碱基对的ORF，该ORF编码179个氨基酸的蛋白。与鼠蛋白的长度相同。人蛋白与鼠蛋白具有79％的氨基酸同一性，而IL-10具有25％同一性。人和鼠蛋白分别如SEQID NO43和40所列。实施例24这些实验详细描述与上述cDNA对应的人基因组DNA。
根据该cDNA序列，将引物设计为与SEQ ID NO25的51-70位核苷酸和631-650位核苷酸相对应。用标准方法进行PCR。具体为，以来自CESS细胞(EBV转染，类淋巴母细胞细胞系)的100ng的基因组DNA作模板，扩增33个循环(每个循环为94℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 5分钟)。分离序列并测序，将其示于SEQ ID NO26。该序列长约4.8Kb，被认为包含编码TIF分子的完整基因组序列，仅缺少5’侧翼区，启动子区和3’末端。分析显示其含有6个外显子和5个内含子，与小鼠的基因组序列相同。
使用标准方法进行Southern印记杂交。显示基因组只含有TIF基因的单一拷贝。实施例25有必要确定上述基因组DNA是否位于人基因组中。为此采用两种不同的方法。在第一个方法中，用荧光标记上述SEQ ID NO26序列作为探针，采用标准的原位杂交(“FISH”)探查人的基因组。
第二个方法中，用SEQ ID NO25的51-70位核苷酸以及5’-ATCAGATGGATTACTGAATG-3’(SEQ ID NO27)作探针筛选一组放射性杂合克隆。用25ng的基因组DNA作模板进行PCR，扩增35个循环，每个循环为94℃1分钟，55℃1分钟，72℃2分钟。
两种方法均显示该基因位于染色体12q15。一些研究发现，哮喘相关疾病与该位点有关。参见Nat.Genet.15398-392(1997)；Ober等，Hum.MolGenet.7(9)1393-1398(1998)；Nickel等，Genomic 46(1)159-162(1997)；Takahashi等，Genomics 44(1)1502(1997)；Barnes等，Genomics 37(1)41-50(1996)，均引入作为参考。
访问公共数据库，确定该序列是否已存在于其中。在BAC克隆中发现了TIF的末尾的一个外显子，其衍生自染色体12q15。(序列号AC007458；191，111碱基对，BAC RDCI11-444B24)。在该克隆中鉴定到这个末尾的外显子说明TIF基因位于距IFN基因约90Kb碱基处，距AK155基因不超过30Kb碱基，该AK155是IL-10相关的细胞因子(Knappe等，J.Virol 743881-3887(2000))。实施例26这些实验描述与TIF蛋白结合的抗体的制备。为此，用标准方法将SEQID NO7编码的氨基酸40-61组成的肽与KLH载体蛋白偶联，比例为1mg肽比1mg载体蛋白。用150μg该复合物以两周的间隔免受试动物(兔)3次。第一次注射时，免疫原经完全弗氏佐剂乳化，后二次用不完全弗氏佐剂。
末次注射后1个月第一次放血，用已知方法制备血清。
用标准Western印迹检测血清。简言之，从转染SEQ ID NO7或SEQ IDNO25的细胞取上清10μl，经SDS-PAGE电泳分离，然后印迹至PVDF膜。抗血清1∶500稀释，在标准Western印记方案中使用，还用到抗兔抗体作为二抗，用市售的检测试剂盒。
发现该血清确实可以识别TIF蛋白。实施例27本实施例描述为鉴定可与人TIF反应的细胞系所进行的实验。在转染前，以3×105个细胞/孔每天的量将如上所述HEK293-EBNA人胚胎肾细胞接种到6孔板。用2μg含有人TIF cDNA的pCEP-4质粒转染这些细胞，该质粒是在CMV启动子的调控下。转染后细胞在1.5ml正常培养基中培养3天，为使重组人TIF的产量达到最大。
可以假定，人TIF能够以与小鼠因子相同的方式诱导STAT转录因子的激活。接下来进行上述实施例21的方案。向核提取物的混合物中加入抗-STAT抗体(0.75μg抗-STAT1，1μg抗-STAT3，或1μl抗-STAT5b)以及标记探针，并孵育，进行迁移率的实验。
当使用肝细胞系HepG2时，可以观察到TIF诱导的带迁移。上述的抗体用于进一步突出该反应的特点。抗-STAT-3抗体最大程度地改变了复合物的滞后，而抗-STAT-1抗体则改变了较弱的其余复合物的迁移率。抗-STAT-5抗体没有任何作用。这说明STAT-3以及，更小范围而言，抗-STAT-1是TIF激活的主要转录因子。使用人肝细胞系HepG3以及肝细胞系H4IIE也得到这些结果。实施例28本实施例描述通过报道基因测定STAT激活而设计的实验。报道基因是“pGRR5”，其含有实施例21中所列序列的5个拷贝，TK启动子调控下的荧光素酶基因的上游。对照是pRL-TK载体，其含有在TK启动子调控下的remilla荧光素酶基因。
将106HepG2细胞与15μg pGRR5，1μg Pr1-TK(250V，74Ω，1,200μF)混合，进行该试验。将转染株汇集物分到24孔板中(42,000细胞/孔)。
1小时后，用人TIF(1％HEK293细胞上清)，与300U/ml人IL-6，来自假转染HEK239细胞的1％上清一起，或者仅仅用培养基，刺激细胞。
2小时后，将细胞制成球状，并溶解。使用标准方法监测荧光素酶活性。结果说明用本发明的分子进行刺激可以提高含有STAT结合位点的启动子转染活性。实施例29已知IL-6这样的细胞因子激活STAT-3可导致肝细胞中急性期蛋白的诱导。为测定TIF是否也具有相同活性，用来自瞬间转染的HEK293-EBNA细胞的1％上清，刺激5×106HepG2细胞2，13或24小时。在一些试验中使用10μg/ml的蛋白合成抑制剂放线菌酮，与细胞和上清共同孵育。刺激后，使用标准方法分离总RNA，使用oligo(dT)引物，用10μg总RNA样品进行逆转录。然后，相应于20ng RNA的cDNA，与人血清淀粉状蛋白A(“SAA”)特异性的引物一起，被扩增18个循环，引物为agctcagcta cagcacagat(有义链，SEQ ID NO28)cctgccccat ttattggcag(反义链，SEQ ID NO29)人α1抗胰凝乳蛋白酶tgtcctctgc caccctaaca(有义链，SEQ ID NO30)taattcacca ggaccatcat(反义链，SEQ ID NO31)人结合珠蛋白的gtggactcag gcaatgatgt(有义链，SEQ ID NO32)acatagagtgt taaagtggg(反义链，SEQ ID NO33)人β-肌动蛋白的gctggaaggt ggacagcgag(有义链，SEQ ID NO34)tggcatcgtg atggactccg(反义链，SEQ ID NO35)对于SAA，Tm为54℃，而对于人α1抗胰凝乳蛋白酶和结合珠蛋白是52℃，β-肌动蛋白是56℃。使用标准方法用溴乙锭染色的琼脂糖凝胶分析PCR产物。
结果显示TIF强有力地诱导SAA和α1抗胰凝乳蛋白酶以及，更小范围的说，结合珠蛋白。为检测TIF是否直接上调SAA或是否需要蛋白合成，在放线菌酮存在下，如上所述刺激HEPG2细胞。SAA的表达未受影响，说明蛋白合成对于TIF的活性而言并不是必须的。实施例30上述的结果显示TIF和IL-6对于急性期蛋白反应物显示出类似的活性。由于IL-6的活性是通过gp130介导，所以进行试验来检测是否TIF的活性也是通过gp130介导。
为检测是否如此，如上所述，用荧光素酶报道基因转染HepG2细胞，然后在多克隆，抗gp130抗体的存在下，用TIF或IL-6刺激，这些抗体已预先被鉴定为可以阻断gp130相互作用的细胞因子的活性。
结果显示多克隆仅能够阻断IL-6的活性。
进行平行试验来检测IL-10Rβ链是否相关。在-IL-10Rβ抗体的存在下，TIF的活性被彻底阻断，而IL-6的活性不受影响。对于SAA表达进行的试验中也观察到相同的效果。实施例31这些实验是为检测TIF体内调节急性期蛋白的能力而设计。
将各种剂量的重组鼠TIF(50，12.5，3.2，0.8，或0.2μg)腹膜注射到内毒素抗性的雌性小鼠C3H/HeJ(10-12周龄)内。注射6小时后，处死小鼠，接受了50μg TIF的小鼠除外，该小鼠在1，3，6，12或24小时后被处死。取出肝脏并直接冷冻在液氮中。然后使用标准方法分离总RNA，之后在含有2.2ml/升甲醛的1.3％琼脂糖凝胶中分离10μg总RNA样品。然后样品被转移到硝酸纤维素膜上。
使用商业可获得的标记试剂盒制备鼠SAA探针。根据Van Snick等，J.Exp.Med 169363-368(1989)进行杂交实验，将其并入作参考。探针本身是如上所述，使用如上述的来自小鼠肝脏的cDNA，通过PCR制备。制备探针所用的引物为tctgctccct gctcctggga(有义链SEQ ID NO36)以及tccaggaggt ctgtagtaat(反义链SEQ ID NO37)结果显示最高剂量的小鼠TIF(50μg)在短至腹膜注射后1小时后，即诱导了SAA的表达。最长的作用时期可达到6小时。在注射后24小时，SAA的表达水平降低。
使用各种剂量TIF的实验数据说明使用3.2μg剂量时，仍可获得最大程度的SAA诱导。当使用低至0.8μg剂量时，仍可检测到SAA信使(message)。实施例32起初，TIF被鉴定为一种T细胞衍生的细胞因子。多数调节肝脏急性期蛋白的细胞因子主要在炎症期间产生。为鉴定TIF能否在炎症刺激中体内产生，将2μg E.coli脂多糖抗原腹膜注射到12周龄的雌性BALB/c小鼠中。2小时后处死小鼠，器官被冷冻在液氮中。使用标准方法分离总RNA，使用oligo(dT)引物对10μg总RNA进行逆转录。逆转录后，相应于20ng总RNA的cDNA，与TIF特异性的引物一起，被扩增25个循环，引物为ctgcctgctt ctcattgccc t(有义链SEQ ID NO38)以及caagtctacc tctggtctca t(反义链SEQ ID NO39)其Tm为55℃。通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
结果说明LPS在所有受检测的器官中都诱导TIF表达，说明TIF与炎症过程相关。
以上实施例描述了本发明，其中一方面是分离的核酸分子，其编码TIF蛋白如具有核苷酸序列SEQ ID NO7，25或26所编码氨基酸序列的蛋白。本领域技术人员将认同，遗传密码的简并性有利于制备可能与SEQ ID NO7，25或26的核苷酸序列不同，但编码相同蛋白的核酸分子。当然，SEQ ID NO7，25或26是本发明的优选实施方案，但其它实施方案也是本发明的一部分。基因组DNA，互补DNA和RNA，如mRNA均包括在内。从其它动物物种，包括其它哺乳动物分离的核酸分子也是本发明的一部分。本发明的一个优选方面为分离的核酸分子，其互补物可在严谨条件下与SEQ ID NO7，SEQ IDNO8，SEQ ID NO9或SEQ ID NO25或SEQ ID NO26杂交。使用的“严谨条件”如在缓冲液(3.5×SSC)，0.02％Ficoll，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，25mM NaH2PO4(pH7)，0.1％SDS，2mM EDTA中65℃杂交，然后室温2×SSC洗涤，然后在如65℃的高温下0.1×SSC/0.2×SSC中洗涤。也可使用更严谨的条件，如0.1×SSC。这些核酸分子编码约17-22kD的蛋白，如SDS-PAGE所测，它们可活化STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5。经SDS-PAGE测定，这些蛋白的糖基化形式约为17到30kD。本发明另一部分是分离的核酸分子，其编码蛋白与SEQ ID NO7，25或26，所编码的蛋白具有至少30％，优选至少45％，更优选至少60％，最优选90％的氨基酸同一性例如SEQ ID NO42。
本发明另一方面为包含本发明核酸分子的表达载体，所述核酸分子与启动子操纵性连接，从而可促进所述DNA的表达。制备这类载体是本领域技术人员公知的。
所述载体及核酸分子本身均可用于制备原核或真核的重组细胞，这些重组细胞中掺入了所述表达载体，或是核酸分子本身。根据本发明这一方面可使用的细胞类型有E.coli细胞，COS细胞，CHO细胞等。
本发明另一方面为上述核酸分子所编码的蛋白，优选其分离的形式。“蛋白”指核酸分子表达的直接产物，其糖基化形式，和多聚体形式，如二聚体，三聚体等。本发明还有一个部分是多聚体，如二聚体，其至少包含本发明的一个蛋白分子，和至少一个不同的蛋白分子。优选该不同的蛋白分子是细胞因子，如IL-10。本发明还有一个方面的构建体，如融合蛋白，其中上述蛋白的全部或一部分以某种形式，如融合蛋白的形式，与至少一种其它蛋白或多肽，或氨基酸序列相连。例如，“融合配对物”可以是直接或间接提供识别信号的分子，如FLAG肽，β-半乳糖苷酶，荧光素酶等。这些融合配对物优选与上述位于蛋白N端和/或C端的分子连接；但应理解已知有许多的技术可将分子与氨基酸连接，这些方法中任一个或全部均可尝试属于本发明的一部分的构建体。
如上所述，本发明的每个蛋白分子优选经SDS-PAGE测定分子量约17-30kD。当然在多聚体形式中，复合物的分子量会有变化，但其中所含TIF分子的分子量经SDS-PAGE测定均应为17-30kD。
这些蛋白优选包含至少约120个氨基酸，不超过约200个氨基酸。优选这些氨基酸序列由SEQ ID NO7，8，9，25或26编码的氨基酸序列组成，或包括其全部或部分。更优选该氨基酸序列包含上述各序列所编码的除约前40个氨基酸以外的所有氨基酸。甚至更优选它包含这些序列所编码的除约前20个氨基酸以外的所有氨基酸。最优选地，该蛋白包含SEQ ID NO40或41所示的氨基酸，以及上述这些氨基酸所定义的蛋白。
本领域技术人员将认同，上述核苷酸分子所编码蛋白的是本发明的特征，并可用于根据标准方法产生抗体。这些单克隆或多克隆形式的抗体，以及所述抗体的片段、嵌合形式、人源化形式、重组形式等均构成了本发明的另一方面。本发明的特征还有免疫原，其包含本发明蛋白分子的全部或部分氨基酸序列，优选与佐剂，如完全或不完全弗氏佐剂组合。这些蛋白序列的部分可与其它分子如匙孔血蓝蛋白连接，以增加其免疫原性。这些抗体可用于如确定是否有本发明蛋白存在。这是本发明的另一特征。现进行描述。实施例中已显示，存在IL-9时本发明核酸分子表达。因此本发明的另一特征是确定IL-9是否存在或已经存在的一种方法，其中可用抗体检测本发明蛋白，或用本发明核酸分子作探针检测mRNA。可直接测定mRNA，或其cDNA形式。这些探针可标记或不标记，取决于使用者。因此，可通过测定本发明核酸分子的存在来确定给予IL-9后细胞因子是否仍有效。这类试验可用于如定量研究，其中可确定细胞是否对IL-9敏感，如果是，敏感程度如何。还可利用本发明的蛋白使STAT蛋白，如STAT1，STAT3和/或STAT5磷酸化。这样可使STAT蛋白形成二聚体，然后移至细胞核，从而激活这些STAT蛋白对细胞的作用。
可将这些分子施用于受试者，如患淋巴瘤，免疫系统疾病如过敏，获得性免疫缺陷综合症，自身免疫性糖尿病，甲状腺炎或任何其他疾病的受试者，从而检验IL-9激动剂(agonist)或拮抗剂的效力，所述疾病可参见U.S.Patent No.5,830,454；5,824,551，以及1997年9月8日提交，现在被批准的申请08/925348，均引入作为参考。这些分子也可用于介导IL-9在这些或其它疾病中的作用。由于IL-9诱导TIF，所以TIF是IL-9活性的有效介导物。因此，本发明另一方面是在如哮喘，过敏和淋巴瘤等与IL-9活性过度有关的情况下，测定内源性IL-9活性的方法。还可使用例如反义分子，与TIF结合的抗体或这些分子的其它拮抗剂，通过阻断或抑制TIF或TIF活性来阻断或抑制IL-9活性，例如TIF突变蛋白可与TIF受体结合但不能活化该受体，因此可抑制IL-9诱导的活性，它是本发明的又一特征。可用这类TIF突变蛋白治疗的疾病有过敏，哮喘等。本发明的突变蛋白可根据Weigel等，Eur.J.Biochem180(2)295-300(1989)和Epps等，Cytokine 9(3)149-156(1997)所述制备，均引入作为参考。这类突变蛋白可用于治疗哮喘，过敏或二者。此外，本领域技术人员很清楚，上述分子还可用于筛选合适的突变蛋白。调节IL-9活性的能力对于上述疾病，以及凋亡，包括可地松诱导的凋亡，涉及BCL-3的核表达等疾病(condition)很重要，因为已知IL-9诱导这种表达。本文中“抗体”是指于TIF结合的抗体的任何部分，包括嵌合抗体和人源化抗体。
本发明的另一特征涉及本发明TIF型分子在其效应组织上刺激再生或抑制分化的能力。如上已示，TIF可靶向多种肿瘤和正常细胞系(即肾小球膜细胞，神经元细胞，以及黑色素瘤细胞和肝癌细胞)。因此可在需要通过TIF分子的作用使组织再生的样品中，加入一定量的TIF型分子，从而刺激组织再生。该方法在体内，体外均可使用。同样，需要抑制特定组织，如黑色素瘤细胞或肝癌细胞分化时，可加入TIF拮抗剂。
如实施例25所述，编码TIF的基因定位于12号染色体。已知这一染色体与哮喘有关。还公知12q15区域与其它炎症疾病相关。因此，本发明另一实施方案是测定疾病，如哮喘或与哮喘有关的疾病易感性的方法，其是通过确定TIF基因位点是否存在畸变，如多态性，缺失，添加等。这类畸变可以指示哮喘，过敏性疾病，或一或多种相关疾病的易感性或存在。检测DNA序列中的异常是本领域已知的，在此不再赘述。优选用标准技术，如PCR，并用上述方法和引物检测所述异常。
以上所列数据，特别是LPS对本发明分子表达的诱导，以及该分子对急性期蛋白的调节，都指示着本发明的分子与炎症反应十分相关。因此本发明的另一特征涉及使用IL-TIF/IL-21来鉴定促炎症以及抗炎症试剂。本领域技术人员公知IL-TIF/IL-21能够调节炎症反应。该调节的一个优选方面是，通过施用IL-TIF/IL-21或其拮抗剂来调节器官，例如肝脏所产生的急性期蛋白。参见如Janeway等，Immunobiology(4th版)，并入作为参考。Janeway解释了各种细胞因子如IL-1，IL-6和TNF-α激活肝细胞合成急性相蛋白，如c-反应蛋白，甘露聚糖结合凝集素，以及上面实施例描述的那些。
IL-TIF/IL-21激活急性期蛋白的功能还可通过测定在推定的激动剂或拮抗剂以及IL-TIF/IL-21存在下，急性期蛋白产量的改变，用于鉴定IL-TIF/IL-21激动剂或拮抗剂的方法。
本发明的另一部分是鉴于IL-TIF/IL-21与白介素-10受体的关系来调节其活性的方法。如上所示，IL-10Rβ拮抗剂，如抗体，能够抑制IL-TIF/IL-21活性。因此，本发明的另一特征是应用IL-10受体的激动剂和拮抗剂，如IL-10Rβ激动剂和拮抗剂，来调节IL-TIF/IL-21的产量。
本发明的其它特征对于本领域技术人员是显而易见的，无需赘述。
所用术语和表达方式旨在说明，并非限制，无意用这些术语和表达排除本发明所示和所述特征或其部分的任何等价体，应理解各种修改均包括在本发明的范围内。
序列表序列表<110>劳尔.杜穆蒂尔(Dumoutier，Laure)琼-克里斯托弗.雷诺尔德(Renauld，Jean-Christophe)<120>分离的编码T细胞诱导因子或白介素-21的核酸分子，其编码的蛋白和其应用<130>LUD 5664 PCT<140><141><150>US09/419,568<151>1999-10-18<150>US09/354,243<151>1999-07-16<150>US09/178,973<151>1998-10-26<160>43<210>1<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>1agcactctcc agcctctcac cgca24<210>2<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>2gatctgcggt ga12<210>3<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>3accgacgtcg actatccatg aaca24<210>4<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>4gatctgttca tg12<210>5<211>24<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>5aggcaactgt gctatccgag ggaa24<210>6<211>12<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>6gatcttccct cg12<210>7<211>1119<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>7taaacaggct ctcctctcac ttatcaactg ttgacacttg tgcgatctct gatggctgtc60ctgcagaaat ctatgagttt ttcccttatg gggactttgg ccgccagctg cctgcttctc120attgccctgt gggcccagga ggcaaatgcg ctgcccgtca acacccggtg caagcttgag180gtgtccaact tccagcagcc gtacatcgtc aaccgcacct 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ggatatcata aaaaaaaaa 1119<210>8<211>7445<212>DNA<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>8gtctatcact tgcttaagat tcttctaatt tataaaaaaa actatttctt aaaatgaaaa60gcaaacagag cacgtattta tagcatggtg ttctgaccat gcaggtacag agtggaatgg120taagaggcgc tattatcagc attaaccaac atgttaatgt tttcttctgg caagcaaact180tgaaatctat gtcttaaaca atcttcaagc ctctaatata gtgctaacga ctggagtccg240ctgctgtcca acagagctct tgagcacgct ctcctctgtt tgcaatttta tgttctttga300tcgactcccc aacctctcac cttcggctcc tgatggccac ctttcaactt tctgcattta360tgaactccat gttttaatct ttttattaaa atattcacac aatcagtgtt tgtgcaagtc420tgtttcaccc acatgtatgt ctgtgcacca agtgctgcct ggtgcttgtg ggggcaagga480gcaggagagg gtgccctggc accggagtca cggatggttg tgagccacca tgaggatgct540gggagttaga cccaggtcct ccagaagtgc agcaaatgct cttaaccaca cgcaggcatt600tctctctcca gccccaacat gagtgctttt agattccacc tagaatagag atctgatggc660ttcactcact gccacctccc ctttgcatct ttctgccaag gaacaccaaa aagcaagaat720ccccacactg ctttcgctcc tcaagtctgc acctctcaac aggtcaagat tctccagtgt780ccctctaaca ctttccccag tgtccctcta acactttctc cagtgtccct ctaacacttt840ctccagtgtc cctctaacac ttttgatctc aattagctga ggggagaaag atctcacaca900gtgattttca tgacttcgcg ttctagtcta gatgtaggca tttgcgtgtc agtctagggt960aggcgtctgc tcccgctgct taggaaagac tttcctagtc tagttgtcag gtgctatctg1020ggattcagtg tacatacaat gcaaaaaatc ccagtatttt gtaaattctc ttcttcaact1080atccatctat atagtatgtt attgtaggct catttaaaaa taatattttg agacttatgc1140ttgcacaagt aaaatgtcag agaattagca aatgtatagt attattttat tttaaaaaaa1200tctatgctta aaatgtctat tagattgttc actaccgata tttccaaact taacttgacc1260ttggctatga tttcaacctt tgtatttgca tctaccataa cagtctctga accagaacat1320tctgtggcaa tgggagctgt gaagaaagcc aacattctta ttaaaaaaaa aaaacagcta1380gttatagttt aggattccat atactaaaaa aaatagagat ataattattt taaaaattga1440aataatctcc aagttttcat tatggcttat ttcaaagcac agaatatagg acacgggtct1500tttatttctg gtcacttcta aagagataag aatctatgaa gttggtggga aaatgagtcc1560gtgaccaaaa cgctgactca atagctacgg gagatcaaag gctgctctac tcaatcagaa1620tctactacgg caaagccatg gctttctttg aaaaccgtgt ttagaagatt 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tgctctcttc tgaactcata ctctcttggc tactcctgag acccactgcg2580gacatacatc tctacttaca ggcttttctt ccatctcctt gtcacccagg cacttagggt2640tttctctctt tcaggccagc cttgcagata acaacacaga cgtccggctc atcggggaga2700aactgttccg aggagtcagt gtaagtcctc actgtgatga gcagggctag ctgcgggagc2760tggtggaccc tctgggatag tctgacgtat gacccctgct gcttcttgtc tacctgcagg2820ctaaagatca gtgctacctg atgaagcagg tgctcaactt caccctggaa gacgttctgc2880tcccccagtc agacaggttc cagccctaca tgcaggaggt ggtacctttc ctgaccaaac2940tcagcaatca gctcagctcc tgtgtaagtc tgactctggc tacctatgct cctctctctt3000cctcttctat tccagtaaga acccgaggtc ctgccctctc tctcttcaca agagtgagga3060gggcctcagc accaccacca tcataggcca cttgaaatag gtcacaaagg ctttggcttc3120aattgagtaa tactttgagt ttgtatgagt gaagctttat ttgttttatc catggaaaga3180aatcaactca aattctgtag gatgagaaag atgttgggaa cgaaaaaagg cctagataga3240gaaacagatc tgctgagtat agtacttatg gggggagcag ggggcgatat ccactgagta3300caagtacttg tggggagaga aatccactga gtacaagtac ttgttggcat ggagatccac3360tgagtacaag tacttgtggg gggagggaat ggcacagagc 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gcgcccatca180gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc aaccgcacct240tcatgctggc taaggaggct agcttggctg ataacaacac agacgttcgt ctcattgggg300agaaactgtt ccacggagtc agtatgagtg agcgctgcta tctgatgaag caggtgctga360acttcaccct tgaagaagtg ctgttccctc aatctgatag gttccagcct tatatgcagg420aggtggtgcc cttcctggcc aggctcagca acaggctaag cacatgtcat attgaaggtg480atgacctgca tatccagagg aatgtgcaaa agctgaagga cacagtgaaa aagcttggag540agagtggaga gatcaaagca attggagaac tggatttgct gtttatgtct ctgagaaatg600cctgcatttg accagagcaa agctgaaaaa tgaataacta accccctttc cctgctagaa660ataacaatta gatgccccaa agcgattttt 690<210>26<211>4797<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220><400>26tgcacaagca gaatcttcag aacaggttct ccttccccag tcaccagttg ctcgagttag60aattgtctgc aatggccgcc ctgcagaaat ctgtgagctc tttccttatg gggaccctgg120ccaccagctg cctccttctc ttggccctct tggtacaggg aggagcagct gcgcccatca180gctcccactg caggcttgac aagtccaact tccagcagcc ctatatcacc aaccgcacct240tcatgctggc taaggaggta tacatctcaa tcctgctctt tctcgttgga tctacttgga300atccaaatag 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Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn165 170 175Ala Cys Val<210>41<211>179<212>PRT<213>小鼠(Mus musculus)<220><400>41Met Ala Val Leu Gln Lys Ser Met Ser Phe Ser Leu Met Gly Thr Leu1 5 10 15Ala Ala Ser Cys Leu Leu Leu Ile Ala Leu Trp Ala Gln Glu Ala Asn20 25 30Ala Leu Pro Ile Asn Thr Arg Cys Lys Leu Glu Val Ser Asn Phe Gln35 40 45Gln Pro Tyr Ile Val Asn Arg Thr Phe Met Leu Ala Lys Glu Ala Ser50 55 60Leu Ala Asp Asn Asn Thr Asp Val Arg Leu Ile Gly Glu Lys Leu Phe65 70 75 80Arg Gly Val Ser Ala Lys Asp Gln Cys Tyr Leu Met Lys Gln Val Leu85 90 95Asn Phe Thr Leu Glu Asp Ile Leu Leu Pro Gln Ser Asp Arg Phe Arg100 105 110Pro Tyr Met Gln Glu Val Val Pro Phe Leu Thr Lys Leu Ser Asn Gln115 120 125Leu Ser Ser Cys His Ile Ser Gly Asp Asp Gln Asn Ile Gln Lys Asn130 135 140Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Val Lys Lys Leu Gly Glu Ser Gly Glu145 150 155 160Ile Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Leu Leu Phe Met Ser Leu Arg Asn165 170 175Ala Cys Val<210>42<211>5935<212>DNA<213>小鼠(Mus 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权利要求
1.刺激STAT转录因子表达的方法，包括使能够进行所述表达的细胞与一定数量的IL-TIF/TL-21相接触，使所述细胞足够刺激所述表达。
2.权利要求1的方法，其中所述STAT转录因子是STAT3或STAT1。
3.权利要求2的方法，其中所述STAT转录因子是STAT3。
4.权利要求1的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳动物IL-TIF/IL-21。
5.权利要求4的方法，其中所述哺乳动物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
6.权利要求5的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21是由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所编码。
7.诱导细胞产生急性期蛋白的方法，包括使所述细胞与一定数量IL-TIF/IL-21相接触，该数量足够诱导所述急性期蛋白的产生。
8.权利要求7的方法，其中所述细胞是肝脏细胞。
9.权利要求7的方法，其中所述急性期蛋白是人血清淀粉状蛋白A，α1胰凝乳蛋白酶或结合珠蛋白。
10.权利要求7的方法，其中所述IL-TIF/IL-21是哺乳动物IL-TIF/IL-21。
11.权利要求10的方法，其中所述哺乳动物IL-TIF/IL-21是人IL-TIF/IL-21。
12.权利要求11的方法，其中所述人IL-TIF/IL-21由SEQ ID NO25或SEQ ID NO26所编码。
13.调节IL-TIF/IL-21分子活性的方法，包括使IL-TIF/IL-21活性易感性的细胞与一定数量的IL-TIF-IL-21调节物相接触，所述数量足够调节IL-TIF/IL-21活性。
14.权利要求13的方法，其中所述调节物是能够与IL-10Rβ分子结合的物质。
15.权利要求14的方法，其中所述调节物是能够特异性结合IL-10Rβ分子的抗体。
16.权利要求16的方法，其中所述调节物是IL-10R分子的拮抗剂。
17.权利要求16的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10R分子的激动剂。
18.权利要求14的方法，其中所述分子是IL-10R分子的激动剂。
19.权利要求18的方法，其中所述IL-10R分子是IL-10Rβ。
20.检测暴露于炎症物质的方法，包括检测来自相信暴露于炎症的受试者的样品中IL-TIF/IL-21的表达，其中TIF的表达指示着暴露于炎症物质。
21.鉴定IL-TIF/IL-21调节物的方法，包括将确信为IL-TIF/IL-21调节物的物质与IL-TIF/IL-21源和表达急性期蛋白的细胞相接触，并测定所述细胞产生的急性期蛋白，其中与在缺乏所述物质情况下所述细胞产量相比，所述急性期蛋白产量的改变，指示所述物质是IL-TIF/IL-21调节物。
全文摘要
本发明涉及核酸分子的分离，其表达经IL－9上调。对应于该核酸分子的蛋白的氨基酸显示出细胞因子的某些结构特征。除核酸分子和蛋白之外，还公开了所述这些分子的多种用途。这些分子可称作T细胞诱导因子。这些分子涉及STAT分子的激活，急性期蛋白和炎症。
文档编号G01N33/566GK1443241SQ01813125
公开日2003年9月17日 申请日期2001年6月27日 优先权日2000年7月27日
发明者劳尔·杜穆蒂尔, 琼-克里斯托弗·雷诺尔德 申请人:路德维格癌症研究院