专利名称：一种突变的人基因核苷酸序列编码多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因序列多肽，具体涉及一种突变的人基因核苷酸序列编码多肽，即一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列编码多肽。
肿瘤细胞的基本生物学特征是增殖失控、分化受阻、基因结构和功能异常。传统化疗和放疗主要抑制肿瘤细胞的继续增殖和杀伤肿瘤细胞，但由于药物缺乏特异性，同时损伤正常细胞，以致于治疗中产生毒副作用。随着对肿瘤形成机制的深入研究，已经发现正常细胞与肿瘤细胞在表达某些凋亡相关分子方面存在差异，这给人们研究如何有效杀伤肿瘤细胞，保护正常组织带来了希望，同时也为抗癌药物研究提供了新的发展方向。
肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL，亦称Apo2L)是新近发现的一种细胞毒蛋白，其分子结构与TNF和FasL(CD95)相近，属于TNF家系成员。TNF和Fas L(CD95L)虽然也具有快速诱导细胞凋亡的作用，但因其选择性不强，临床应用显示明显的副作用。如在肝细胞中表达丰富的CD95，CD95L作用后迅速诱导肝细胞凋亡，致使肝细胞受损，产生严重的毒副作用。TRAIL具有快速诱导多种肿瘤细胞发生凋亡的作用，而正常细胞不受TRAIL的影响，因此TRAIL作为药物进行肿瘤治疗具有很好的应用前景。人TRAIL由281个氨基酸组成，研究发现全序列的TRAIL蛋白无诱导肿瘤细胞凋亡的活性，而去除N端部分氨基酸后，具有快速诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
本发明根据Pitti等人(Pitti RM at alInduction of apoptosis byApo-2 ligant，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Bio Chem.1 996，27112687-12690)报导，TRAIL 全序列cDNA表达蛋白无诱导细胞死亡活性，而去除N端部分氨基酸后，具有快速诱导肿瘤细胞凋亡的作用。
本发明的目的在于通过改造，获得具有快速诱导肿瘤细胞凋亡性死亡的作用。
根据TRAIL的特点，本发明人在已有的克隆的人体TRAIL全序列cDNA的基础上，去除了N端编码1-113氨基酸的碱基序列，同时改造去除了第119和第120两个氨基酸的碱基，保留了编码C端氨基酸的DNA序列，获得具有一段能编码168个氨基酸缺失体TRAIL的cDNA。缺失体TR AIL cDNA与表达载体连接，通过筛选获得表达质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了稳定的工程菌株，产物鉴定表明表达的缺失体TRAIL即本发明具有快速诱导肿瘤细胞凋亡性死亡的作用，体外抗肿瘤活性明显高于原TRAIL，在动物模型中，也显示了明显的抗肿瘤活性，使它有希望成为一种新型的基因工程抗肿瘤药物。
本发明提供了一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列编码多肽，该多肽序列包括一种缺失突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体cDNA序列和一种缺失突变两个氨基酸的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列(命名为mh TRAIL)。
本发明的另一目的是提供了一种利用重组技术生产上述一种缺失突变两个氨基酸的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列编码多肽的方法。
该方法包括下列步骤(1)表达质粒的构建选取去除N端1-113的编码序列的cDNA分子作为模板，并考虑表 达 需 要 设 计 引 物， 上 游 引 物 5‘-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3’，其中包含了一个限制性内切酶Nde位点和一个起始氨基酸Met的序列，同时去除了编码119和120氨基酸的碱基序列CCT CAG；下游引物5‘-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3’，其中包含了限制性内切酶HindIII的位点。PCR扩增该片段基因，反应参数95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35个循环，PCR扩增产物经Nde I和Hind III酶切，其片段大小大约为550碱基对(图1)，经进一步测序确认其序列的正确性(图2)。将两个不同酶切的粘性末端片段克隆至大肠杆菌蛋白表达载体pRSET上，得到本发明的表达质粒；(2)质粒的表达和纯化将本发明表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经氨苄青霉素筛选，挑取单菌落在5ml LB培养基中30℃培养过夜，以1∶50转接至大瓶，30℃继续培养至OD 0.8-1.0，加入IPTG诱导表达本发明，4小时后离心收集菌体，将菌体悬于裂菌缓冲液，加入溶菌酶室温处理1小时，之后冰浴条件下超声裂菌至无完整杆菌。为确定本发明在大肠杆菌中的位置，分别取诱导表达后离菌上清、离菌沉淀、超声破菌后离心上清及超声破菌后离心沉淀进行SDS-PAGE电泳，包涵体用8mol/L尿素在室温下抽提2小时以上，离心收集上清为粗提物，再经PBS梯度透析，获得复性样品，最后经柱层析纯化。
本发明的产品经SDS-PAGE还原电泳确定本发明分子量约为19kDa，略低于原TRAIL的分子量，测定蛋白含量并进一步鉴定产物，应用免疫印迹法，将本发明与抗TRAIL抗体结合并显色，表明本发明具有TRAIL的免疫原性，结合测序结果，可以肯定本发明即为缺失体TRAIL(图4、5)。经蛋白扫描确定纯度大于90％，可用于抗肿瘤活性的研究。
本发明的产品具有诱导人体白血病细胞凋亡作用细胞凋亡期间由于核酸酶的作用，使核染色质DNA降解，并产生不同长度(180-200bp)的寡聚核小体片段，此特征是判断细胞凋亡发生的重要指标。应用琼脂糖凝胶电泳方法检测了本发明在25ng/ml浓度条件下分别作用0-4小时后，诱导人早幼粒白血病细胞的DNA降解状况。操作步骤如下所述。
经本发明处理不同时间的细胞约3×106，用含2mmol/L EDTA的PBS洗2次，加入0.3ml TBE缓冲液，0.25％NP-40以及RNase A(终浓度为1％)，混匀后，37℃温育30分钟；再加入蛋白酶K(终浓度为1mg/ml)37℃继续温育30分钟。取上清液45ul加5ul上样缓冲液，在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，紫外检测仪观察结果并照相。
本发明具有抑制人体恶性肿瘤细胞体外生长活性三种肿瘤(乳腺癌、结肠癌、肾癌)细胞按一定比例分别接种在含5％小牛血清的RPMI1640的96孔培养板中，在5％CO2，37℃条件下培养24小时。换用含不同浓度本发明以及非临床用标准样品(Leinco Technologies Inc.产品)的新鲜培养基，继续培养48小时。SRB方法染色处理细胞，经酶标仪比色测定，并计算GI50(50％细胞生长抑制所需要的浓度)。
表1 标准品TRAIL与本发明抑制三种肿瘤细胞体外生长的比较(GI50，ng/ml)肿瘤细胞类型 标准样品本发明乳腺癌30.0 20.0结肠癌20.0 10.0肾癌 50.0 20.0本发明具有抑制小鼠异种移植人体肿瘤细胞生长效应无菌条件下以匀浆法制备人体结肠癌细胞悬液，按适当密度每鼠腋皮下接种0.2ml，次日按设计方案静脉注射给予本发明，连续十天，停药后继续观察 天，解剖各组动物，剖取肿瘤称重，按下列公式计算抑瘤率
表2 本发明对小鼠异种移植人体肿瘤细胞生长的抑制效应处理组动物数处理剂量抑瘤率(％)阴性对照 12 //5-氟尿嘧啶625mg/kg48.15mg/kg本发明 615mg/kg 74.6本发明 65mg/kg 65.76本发明 61.67mg/kg52.5
图1本发明DNA序列测定2缺失突变体TRAIL的氨基酸序列图3聚合酶链反应产物电泳鉴定泳道1为DNA分子大小Marker(1Kb DNA Ladder)泳道2-4分别是从3个相同PCR反应体系中取5ul进行电泳，结果表明扩增DNA片段与预期大小相符。
图4本发明表达形式1为低分子量蛋白电泳Marker，2为未经IPTG诱导表达形式；3为IPTG诱导后的表达形式；4为裂解上清；5为包涵体形式。
图5本发明蛋白印迹分析鉴定经抗TRAIL单克隆抗体鉴定的表达产物1为本发明；2为原TRAIL。
图6本发明诱导肿瘤细胞凋亡的DNA降解图1.DNA Marker2.本发明作用0小时3.本发明作用0.5小时4.本发明作用1小时5.本发明作用2小时6.本发明作用3小时7.本发明作用4小时实施例1本发明表达质粒的构建本发明根据Pitti等人(Pitti RM at alInduction of apoptosis byApo-2 ligant，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family.J Bio Chem.1996，27112687-12690)报导，TRAIL全序列cDNA表达蛋白无诱导细胞死亡活性，而去除N端部分氨基酸后，具有快速诱导肿瘤细胞凋亡的作用。选取去除N端1-113的编码序列的cDNA分子作为模板，并考虑表达需要设计引物，上游引物5‘-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3’，其中包含了一个限制性内切酶Nde位点和一个起始氨基酸Met的序列，同时去除了编码119和120氨基酸的碱基序列CCT CAG；下游引物5‘-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3’，其中包含了限制性内切酶HindIII的位点。PCR扩增该片段基因，反应参数95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35个循环。
PCR扩增产物经Nde I和Hind III酶切，其片段大小大约为550碱基对(图1)，经进一步测序确认其序列的正确性(图2)。将两个不同酶切的粘性末端片段克隆至大肠杆菌蛋白表达载体pRSET上，得到本发明的表达质粒。实施例2本发明的表达和纯化将本发明表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经氨苄青霉素筛选，挑取单菌落在5ml LB培养基中30℃培养过夜，以1∶50转接至大瓶，30℃继续培养至OD 0.8-1.0，加入IPTG诱导表达本发明，4小时后离心收集菌体。将菌体悬于裂菌缓冲液，加入溶菌酶室温处理1小时，之后冰浴条件下超声裂菌至无完整杆菌。为确定本发明在大肠杆菌中的位置，分别取诱导表达后离菌上清、离菌沉淀、超声破菌后离心上清及超声破菌后离心沉淀进行SDS-PAGE电泳。本发明主要以包涵体形式存在大肠杆菌内(图3)。包涵体用8mol/L尿素在室温下抽提2小时以上，离心收集上清为粗提物，再经PBS梯度透析，获得复性样品，最后经柱层析纯化，经SDS-PAGE还原电泳确定本发明分子量约为19kDa，略低于原TRAIL的分子量。测定蛋白含量并进一步鉴定产物，应用免疫印迹法，将本发明与抗TRAIL抗体结合并显色，表明本发明具有TRAIL的免疫原性，结合测序结果，可以肯定本发明即为缺失体TRAIL(图4、5)。经蛋白扫描确定纯度大于90％，可用于抗肿瘤活性的研究。
权利要求
1.一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列多肽，其特征在于该多肽序列包括一种缺失突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体cDNA序列和一种缺失突变的两个氨基酸的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列。
2.根据权利要求1所述的一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列，其特征在于其中所述的一种缺失突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体cDNA序列是通过在已有的克隆的人体TRAIL全序列cDNA的基础上，去除了N端编码1-113氨基酸的碱基序列，同时改造去除了第119和第120两个氨基酸的碱基，保留了编码C端氨基酸的DNA序列，获得具有一段能编码168个氨基酸缺失体TRAIL的cDNA。
3.根据权利要求1所述的一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列，其特征在于其中所述的一种缺失突变的两个氨基酸的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列是将缺失突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体cDNA序列与表达载体连接，通过筛选获得表达质粒，然后转化大肠杆菌获得的。
4.一种如权利要求1所述的一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤(1)表达质粒的构建选取去除N端1-113的编码序列的cDNA分子作为模板，并考虑表 达 需 要 设 计 引 物 ， 上 游 引 物 5‘-CATATGGTGAGAGAAAGAGGTAGAGT-3’，其中包含了一个限制性内切酶Nde位点和一个起始氨基酸Met的序列，同时去除了编码119和120氨基酸的碱基序列CCT CAG；下游引物5‘-GATCAAGCTTTTAGCCAACT-3’，其中包含了限制性内切酶HindIII的位点。PCR扩增该片段基因，反应参数95℃，20秒；55℃，30秒；72℃，30秒，共35个循环，PCR扩增产物经Nde I和Hind III酶切，其片段大小大约为550碱基对(图1)，经进一步测序确认其序列的正确性(图2)。将两个不同酶切的粘性末端片段克隆至大肠杆菌蛋白表达载体pRSET上，得到本发明的表达质粒；(2)质粒的表达和纯化将本发明表达质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，经氨苄青霉素筛选，挑取单菌落在5ml LB培养基中30℃培养过夜，以1∶50转接至大瓶，30℃继续培养至OD 0.8-1.0，加入IPTG诱导表达本发明，4小时后离心收集菌体，将菌体悬于裂菌缓冲液，加入溶菌酶室温处理1小时，之后冰浴条件下超声裂菌至无完整杆菌。为确定本发明在大肠杆菌中的位置，分别取诱导表达后离菌上清、离菌沉淀、超声破菌后离心上清及超声破菌后离心沉淀进行SDS-PAGE电泳。本发明主要以包涵体形式存在大肠杆菌内(图3)。包涵体用8mo/L尿素在室温下抽提2小时以上，离心收集上清为粗提物，再经PBS梯度透析，获得复性样品，最后经柱层析纯化。
5.一种如权利要求1所述的一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体序列的活性蛋白多肽在治疗癌症药物中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种突变的人肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的cDNA序列和由该序列编码的多肽。本发明的多肽具有快速诱导肿瘤细胞凋亡性死亡的作用。
文档编号C07K14/525GK1380339SQ0110594
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月10日 优先权日2001年4月10日
发明者李伯刚, 高小平, 刘忠荣 申请人:成都地奥制药集团有限公司