专利名称：咔唑生物碱类细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类新的用于细胞周期抑制和细胞凋亡诱导的组合物，特别是一类含咔唑生物碱衍生物的组合物及其制备。
咔唑类生物碱虽然有一些化合物已人工合成，但大多还主要来源于天然产物，而且对某些结构类型的咔唑类化合物已有人进行了部分生物活性的研究，如文献Tian-Shung Wu,et al,Carbazole alkaloids from Clausena excavata and their biological activity:Phytochemistry,Vol.43.No.1.pp133-140,1996及文献A.Chakraborty,et al,Carbazole alkaloid with antimicrobial activity from Clausena heptaphylla:Phytochemistry,Vol.38.No.3.pp787-789,1995曾报道这类化合物具有抗菌作用和血小板聚集抑制作用。但有关天然咔唑生物碱类化合物的生物活性至今未见有细胞周期抑制及细胞凋亡诱导等抗癌作用的研究报道。
天然咔唑类生物碱很多都来源于芸香科(Rutaceae)黄皮属(Clausena)植物。迄今该属植物化学成分的研究报道很多，主要成分为咔唑类生物碱和香豆素类化合物。同属植物黑果黄皮Clausena dunniana Levl在我国局部地区民间用于治疗癌症，但其化学成分特别是有关该植物抗癌活性成分的研究至今未见报道。
本发明的目的是研制一类新的用于细胞周期抑制和细胞凋亡诱导的物质，特别是一类咔唑生物碱衍生物及其制备。
本发明首次发现黑果黄皮的粗提物有很好的细胞周期抑制、细胞凋亡诱导及一定的细胞毒等抗癌活性，遂对其相关抗癌活性成分进行了系统的研究，并发现了下述四种结构类型的咔唑类生物碱，具有细胞周期抑制和细胞凋亡诱导作用，其结构如下 用上述化合物作为主要活性成分，配之以药物可接受的辅剂、赋形剂，可以制成一类新型的细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂。
上述化合物的制备方法是用适量乙醇或含水乙醇溶液提取黑果黄皮茎皮的干燥碎块，得粗浸膏，将所得粗浸膏依次用有机溶剂萃取，得到提取物。将上述有机溶剂提取物经反复的硅胶和Sephadex LH20柱层析、反复的制备硅胶薄层层析和重结晶等分离纯化操作，分离出浸膏中的活性成分，得到上述四种结构类型的咔唑类生物碱活性单体。
本发明采用流式细胞术并配以细胞显微形态特征观察、荧光显微形态特征观察及颗粒粒度分析法，以对tsFT210小鼠乳腺癌细胞的细胞周期抑制、细胞凋亡诱导以及对该癌细胞的杀伤作用为主要指标进行了抗癌活性的筛选和测试工作。同时，采用HT-1080、K562等人癌细胞系，用MTT法检测了活性成分对人癌细胞的杀伤作用。结果表明，本专利所提供的上述四种结构类型的咔唑类生物碱在所测试的抗癌活性模型中均具有很好的相关活性。
本发明的咔唑生物碱类的作用特征是或者通过抑制癌细胞的细胞周期周转，或通过诱导癌细胞发生凋亡，或者通过直接杀伤癌细胞发挥作用，上述咔唑生物碱类活性化合物也可作为生命科学的研究试剂～细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂用于探索生命现象。
实施例1分离制备1．药材的提取及活性部位的制备黑果黄皮茎皮的干燥碎块5公斤每次用70％的乙醇15L回流浸提，共提取三次，每次4小时。合并提取液，减压浓缩，得粗浸膏300克。
将该浸膏用2500ml水分散，依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取三次，分别收集各萃取液并浓缩。分别得石油醚提取物25克、氯仿提取物30克、乙酸乙酯提取物35克、正丁醇提取物60克和水溶部分150克。2．石油醚提取物中活性成分的追踪分离取石油醚提取物25克，用30克硅胶G拌样，上减压柱(250克硅胶H干法装柱)层析，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脱分段，按极性粗分为20个流份，经活性测试及薄层检测后合并，得到6个组分A组分1.5g(PE洗脱)，B组分6.35g[PE-EA(99∶1～97∶3)洗脱]，C组分6.25g[PE-EA(96∶4～95∶5)洗脱]，D组分1.25g[PE-EA(95∶5～93∶7)洗脱]，E组分0.35g[PE-EA(93∶7～92∶8)洗脱]，F组分9g[PE-EA(90∶10～50∶50)洗脱]。其中B、C组分活性以诱导凋亡和细胞毒为主，D、E组份活性以细胞周期抑制为主，A和F组分无活性。
B、C组分用硅胶G(1∶50)上常压柱，正已烷/丙酮95∶5洗脱，得到化合物7和8粗品5g和4.0g。
D组分用LH-20(1∶50)柱层析分离，常压湿法上样，甲醇洗脱，得到化合物1和2粗品0.6g和25mg。
E组分经LH-20柱层析分离，取活性组份，再经制备薄层层析分离得到化合物9粗品35mg。
取B～E组分经上述柱层析分离得到的活性化合物粗品，经反复ODS柱层析(70％乙腈/水洗脱)精制，得到纯品化合物1(0.7g)、2(15mg)、7(4.5g)、8(3.5g)、9(25mg)。3．氯仿提取物中活性成分的追踪分离取氯仿提取物30克，用36克硅胶G拌样，上减压柱(300克硅胶H干法装柱)，用石油醚(PE)-乙酸乙酯(EA)梯度洗脱分段，按极性粗分为20个流份，经活性测试及薄层检测后合并，得到6个组分G组分1g(PE洗脱)，H组分5.0g[PE-AE(97∶3)洗脱]，I组分4.0g[PE-AE(93∶7)洗脱]，J组分0.65g[PE-AE(9∶1)洗脱]，K组分1.35g[PE-AE(9∶1～8∶2)洗脱]，L组分16g[PE-EA(7∶3～1∶1)洗脱]。其中H、I组分主要含与石油醚层相同的成分，J、K组分含新的活性成分，G和L组分无活性。
H、I组分参照分离石油醚提取物的方法分离，分别得到化合物1(0.5g)、7(2.7g)、8(2g)。
J、K组分分别上LH-20柱，经甲醇洗脱层析后，取活性流份，经薄层检查相似者合并，得到12个活性组分。从这些活性组分中，经反复的LH-20柱层析、制备薄层层析分离精制，分别得到化合物3(25mg)、4(12mg)、5(8mg)和6(10mg)。 4．活性化合物1 ～9的理化常数及光谱数据化合物1淡黄色油状物。ESI-MS(m/z):212[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:341(3.67),328(3.71),291(4.19),250(4.57),241(4.75),228(4.64).IR νmaxcm-1(KBr):3422,3056,2918,2852,1588,1503,1394,828。1H NMRδ(CDCl3):8.30(brs,NH),8.20(d,J=8Hz),7.66(s),7.55(t,J=8Hz),7.49(d,J=8Hz),7.37(t,J=8Hz),6.87(s),4.07(s,3H),2.70(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):145.4,139.5,129.5,128.1,125.5,124.4,123.6,120.4,119.2,112.5,110.9,107.7,55.5,21.9。化合物2无色柱状结晶，mp178-179℃.ESI-MS(m/z):264[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:342(3.70),328(3.74),295(4.46),258(4.42),246(4.53),235(4.80),229(4.78).IRνmaxcm-1(KBr):3405,3050,2917,2858,1607,1460,1243,847。13CNMRδ(CDCl3):139.9,137.8,128.8,127.2,125.7,123.6,123.3,120.2,120.2,119.3,110.6,110.2,21.4。化合物3无色细针柱状结晶，mp236-237℃.ESI-MS(m/z):212.3[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:344(4.06),333(4.06),287(4.31),274(4.49),250(4.28),239(4.38),221(4.25).IRνmaxcm-1(KBr):3400,3047,2917,2815,1670,1473,1251,851。1H NMRδ(Acetone):9.98(s),8.24(d,J=1.5),8.17(d,J=8Hz),7.63(d,J=8Hz),7.45(dd,J=8.0,8.0Hz),7.42(t,J=1.5Hz),7.24(dd,J=8.0,8.0Hz),13C NMRδ(CDCl3):191.4,143.7,140.3,134.0,130.2,126.2,124.1,123.6,120.4,119.9,118.2,111.8,107.5。化合物4无色针状结晶，mp165-166℃.ESI-MS(m/z):224[M-H].UVλmaxnm(logε)in MeOH:339(4.10),330(4.10),386(4.31),273(4.50),248(4.25),237(4.46),222(4.24).IRνmaxcm-1(KBr):3177,3103,2918,1661,1501,1344,1141,846。1HNMRδ(CDCl3):10.06(s,CHO),8.19(brs),8.11(d,J=8Hz),7.51(d,J=8Hz),7.48(dd,J=8.0,8.0Hz),7.46(d,J=1.0Hz),7.32(dd,J=8.0,8.0Hz),4.06(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):191.8,146.1,139.4,134.1,130.2,126.6,123.7,123.6,120.7,120.7,120.3,111.5,103.6,55.8。化合物5白色粒状结晶，mp229-230℃.ESI-MS(m/z):242[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:353(3.95),340(3.91),296(4.27),278(4.32),255(4.14),242(4.18),223(4.19).IRνmaxcm-1(KBr):3391,3360,2927,2829,1670,1459,1216,842。1HNMRδ(CDCl3):9.96(s,CHO),8.23(s),7.75(d,J=2Hz)7.54(d,J=9Hz),7.39(s),7.09(dd,J=9.0,2.0Hz),3.88(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):191.3,154.5,143.7,135.0,134.6,129.8,124.1,124.0,118.7,115.8,112.5,106.9,102.7,55.2。化合物6橘红色针晶。ESI-MS(m/z):211[M-1]+.UVλmaxnm(logε) in MeOH:286(3.84),258(4.19),224(4.39).IRνmaxcm-1(KBr):3220,2921,2853,1664,1637,1468,887,747。1H NMRδ(CDCl3):8.04(d,J=8Hz),7.52(d,J=8Hz),7.38(dd,J=8,8Hz),7.30(dd,J=8,8Hz),6.62(d,J=1Hz),2.06(d,J=1Hz)。13C NMRδ(CDCl3):183.1,180.1,148.0,137.4,135.9,131.6,126.2,123.8,123.6,121.6,115.4,113.8,15.6。化合物7无色片状结晶，mp176-177℃.ESI-MS(m/z):264[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:357(4.04),342(4.10),327(4.07),287(4.80),236(4.84).IRνmax cm-1(KBr):3320,2975,2931,1642,1460,1146,1058,882。1H NMRδ(CDCl3):7.83(brs,NH),7.93(d,J=8Hz),7.69(s),7.37(d,J=8Hz),7.33(t,J=8Hz),7.20(t,J=8Hz),6.60(d,J=10Hz),5.69(d,J=10Hz),2.36(s,3H)1.51(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):149.9,139.6,134.9,129.4,124.3,124.0,121.2,19.6,119.3,118.7,118.7,117.2,116.8,110.4,104.5,75.9,27.7,27.7,16.0。化合物8白色针絮状结晶，mp95.5-96.5℃.[α]D25+55.9°(c1.8,MeOH).ESI-MS(m/z):332[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:357(4.18),342(4.22),329(4.19),287(4.94),238(4.97).IRνmaxcm-1(KBr):3325,2965,2926,2856,1647,1460,1218,846.1H NMRδ(CDCl3):7.93(brd,J=8Hz),7.81(brs,NH),7.67(m),7.37(brd,J=8Hz),7.32(td,J=8,1Hz),7.19(td,J=8,1Hz),6.63(d,J=10Hz),5.66(d,J=10Hz),5.14(brt,J=7Hz),2.36(s,3H),2.20(m,2H),1.79(m,2H,),1.69(s,3H),1.61(s,3H),1.47(s,3H)。13C NMRδ(CDCl3):150.0,139.5,134.9,131.7,128.5,124.3,124.2,124.0,121.2,119.5,119.3,118.5,117.5,116.7,110.4,104.2,78.2,40.9,25.9,25.6,22.8,17.6,16.0。化合物9无色柱状结晶，mp146.5-147.5℃.[α]D25+9.0°(c1.0,MeOH).ESI-MS(m/z):332[M+H]+.UVλmaxnm(logε)in MeOH:332(3.85),304(4.44),254(4.66),241(4.85),218(4.76).IRνmaxcm-1(KBr):3478,3062,2953,2859,1613,1458,1145,873.1H NMRδ(CD3OD):7.88(brd,J=8Hz),7.65(s),7.4(brd,J=8Hz),7.23(td,J=8Hz),7.08(rd,J=8,0.5Hz),3.46(d,J=9.5Hz),2.71(t,J=9Hz),2.54(m),2.33(s,3H),2.09(m),1.80(m),1.74(m),1.66(m),1.59(s,3H),1.38(s,3H)。13C NMRδ(CD3OD):151.7,141.7,139.5,125.1,124.7,120.4,119.8,119.7,119.6,117.5,111.8,108.7,85.0,48.1,40.9,40.8,40.5,38.1,34.9,26.7,26.2,19.1,16.8。
1)细胞周期抑制及细胞凋亡诱导活性温敏型小鼠乳腺癌tsFT210细胞用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在32℃、通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。活性测试时，取对数生长期的tsFT210细胞，用新鲜的培养基配制成密度为2×105cells/ml的细胞悬液，分别按0.5ml/well加至24孔板中，每孔加入5μl不同浓度的样品甲醇溶液，32℃下培养17h。取药物作用下培养后的细胞，首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化，判断有无细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征，然后将细胞分别从24孔板转移至1.5ml Eppendorf离心管中，4℃下3000rpm离心3min，吸去上清液，加0.5μl磷酸缓冲溶液震荡洗涤一次，相同条件下收集细胞，加150μl碘化丙啶(PI)水溶液(5mg PI,100mg Sodium citrate and 200mg NP-40in 100ml H2O),4℃下染色30min后，用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。另外，必要时取药物处理后的细胞，用Hoechst 33258荧光试剂将细胞染色，在荧光显微镜下观察细胞核染色质的形态学特征变化，判断有无细胞凋亡的形态学特征或细胞周期是被抑制在G2期还是在M期。
2)对人癌细胞的杀伤活性人纤维肉瘤细胞HT-1080和人慢性骨髓性白血病细胞K562均用含10％FBS的RPMI-1640培养基，在37℃、通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养。取对数生长期细胞，用新鲜RPMI-1640培养液稀释成密度为2×105个细胞/毫升的细胞液，将此细胞液接种到96孔板中，每孔分注100μl，置于5％CO2培养箱中，37℃培养4小时，每孔加入不同浓度的受试样品液或阳性对照顺铂溶液各5μl，每种样品或顺铂均设三孔，同时设三孔空白对照，于二氧化碳培养箱中37℃培养24小时。每孔加入5mg/ml的MTT液10μl，于二氧化碳培养箱中37℃培养4小时，4℃、2000rpm离心5分钟，吸去上清后，每孔加入100μl DMSO,37℃孵育约10分钟，待结晶溶解完全后，用定时微量振荡器振荡约1分钟，利用酶标仪测定各孔于570nm处的光密度(以下称OD)值。
取三孔OD值的平均值，按如下公式计算细胞增殖抑制率抑制率=(OD空白-OD样品)/OD空白×100％取每个样品在不同浓度下的抑制率，绘制量效曲线，由该曲线计算出半数抑制有效浓度。
2．生物活性测试结果1)细胞周期抑制及细胞凋亡诱导活性化合物1在浓度高时对tsFT210细胞有很强的细胞凋亡诱导作用，随着浓度降低凋亡诱导作用逐渐减弱，代之逐渐呈现对细胞周期很强的M期抑制活性；化合物3、4、5对细胞周期有很强的G2/M抑制作用；化合物6对tsFT210细胞呈现很强的杀伤作用；化合物7、8、9对tsFT210细胞均有很强的凋亡诱导作用和杀伤作用；而化合物2在小于400/μg/ml的测试浓度范围内对tsFT210细胞无明显活性。这些化合物对tsFT210细胞的最小有效浓度(MEC)分别为1,1.25μg/ml(0.85μg/ml＜MEC＜=1.25μg/ml)；2,MEC＞400μg/ml；3,9.38μg/ml(4.69μg/ml＜MEC＜=9.38μg/ml)；4,16.50μg/ml(8.25μg/ml＜MEC＜=16.50μg/ml)；5,8.25μg/ml(4.12μg/ml＜MEC＜=8.25μg/ml)；6,30.0μg/ml(15.0μg/ml＜MEC＜=30.0μg/ml)；7,25.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=25.0μg/ml)；8,15.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=15.0μg/ml)；9,20.0μg/ml(12.5μg/ml＜MEC＜=20.0μg/ml)。2)对人癌细胞的杀伤活性采用MTT法，测试部分化合物对人癌细胞的杀伤作用，结果如表1所示。
表1部分化合物对人癌细胞的杀伤作用(MTT法测得的IC50值，μg/ml)
上述生物活性测试结果表明，本发明所提供的咔唑生物碱类化合物可作为细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂用于探索生命现象，也可以通过配之以药物可接受的辅剂、赋形剂，制成一类新的抗癌治疗药物，该类药物的特征是咔唑生物碱类活性成分通过抑制癌细胞的细胞周期周转或通过诱导癌细胞发生凋亡或者通过直接杀伤癌细胞发挥抗癌治疗的药物作用。
权利要求
1．一种可作为细胞周期抑制剂及细胞凋亡诱导剂的组合物，其特征是该组合物的活性成分是一种咔唑类生物碱衍生物或其盐，所述咔唑类生物碱衍生物的结构包括如下式Ⅰ、式Ⅱ、式Ⅲ和式Ⅳ所示的结构。
2．权利要求1所述的咔唑类生物碱衍生物，其中优选的化合物为R1=OCH3,R2=CH3,R3=H,R=CH2CH2CH=C(CH3)2。
3．权利要求2所述的咔唑类生物碱的制备方法是用乙醇或60-70％的乙醇提取黑果黄皮茎皮的干燥碎块，得粗浸膏；用有机溶剂萃取该浸膏，得到提取物；将该提取物经反复的硅胶和Sephadex LH20柱层析、反复的制备硅胶薄层层析和重结晶，分离出浸膏中的活性成分。
全文摘要
本发明首次发现了可作为细胞周期抑制剂及细胞凋亡诱导剂的四种不同结构类型的咔唑类生物碱。这些化合物可通过抑制癌细胞的细胞周期周转或通过诱导癌细胞发生凋亡或者通过直接杀伤癌细胞发挥作用,也可单独作为生命科学的研究试剂～细胞周期抑制剂或细胞凋亡诱导剂。制备方法是用乙醇或含水乙醇提取黑果黄皮茎皮的干燥碎块,得粗浸膏,用有机溶剂萃取,经反复的柱层析、反复的制备硅胶薄层层析和重结晶等操作,分离出浸膏中的活性成分。
文档编号C07D491/00GK1309964SQ0110367
公开日2001年8月29日 申请日期2001年2月9日 优先权日2001年2月9日
发明者崔承彬, 蔡兵, 闫少羽, 赵庆春, 姚新生, 曲戈霞 申请人:崔承彬