专利名称：利用内皮细胞特异性的、细胞周期依赖性的活性化合物对肿瘤进行基因治疗的制作方法
技术领域：
本发明描述了用于肿瘤基因治疗的DNA序列。所述DNA序列的基本组成元件包括激活物序列、启动子组件和编码活性物质的基因。
激活物序列在增生的内皮细胞或与所述内皮细胞毗连的细胞中以细胞特异性方式被激活。
该激活过程以细胞周期特异性方式受到启动子组件的调节。
所述活性物质是血管生成的抑制剂，或是细胞生长抑制分子或细胞毒性分子。将所述DNA序列插入病毒或非病毒载体中，所述载体已被增加了一个与激活的内皮细胞有亲和力的配体。1.肿瘤生长与血管生成许多抗肿瘤活性化合物抗肿瘤的活性不足至少在某种程度上可以从下列事实得到解释肿瘤块中的肿瘤细胞不能与抗肿瘤活性化合物，尤其是高分子量的活性物质接近(Burrows等人，药物治疗64，155(1994)，Baxter等人，微血管研究41，5(1991))。这类活性化合物为了能接触到每个肿瘤细胞，它们必须通过血管内皮和基底膜及通过肿瘤基质和肿瘤实质进行扩散。这一扩散程度基本上取决于活性化合物的浓度或浓度梯度及其理化特性。然而，由肿瘤内部高压所导致的向外对流作用(Burrows等人，微血管研究41，5(1991))正好与上述扩散作用方向相反。
因为即使是对于高分子量活性化合物而言肿瘤血管也是可以接近的，所以早期就有人提出利用肿瘤诱导的血管生成进行肿瘤治疗(Denekamp，应用微循环进展4，28，1984，Denekamp，癌症主题6，6 1986，Denekamp，癌转移评论9，267，1990，Denekamp，英国放射学杂志，66，181，1993)。
因此，人们试图利用抑制血管生成的物质抑制肿瘤生长(Bicknell癌症生物学研讨会，3，399(1992))。动物研究实验表明，全身性施用抑制血管生成的物质也能够抑制肿瘤增生。这可以应用于例如苏拉明(Gagliardi等人，癌症研究52，5073(1992))、肝素/甾族化合物共轭物(Thorpe等人，癌症研究53，3000(1993))、O-(氯乙酰甲氨酰基)烟曲霉醇(fumigillol)(Yamaoka等人，癌症研究53，4262(1993))、抗血管生成素的单克隆抗体(Olson等人，癌症研究54，4576(1994))和血管抑制素(angiostatin)(O’Reilly等人，细胞79，315(1994))。
然而，上述方法具有血管生成抑制剂全身性、非肿瘤特异性作用的缺陷，一旦出现副作用和新的肿瘤生长的危险，治疗就得中止。
作为另一种选择，设想通过损害内皮细胞来阻止对肿瘤的血流供应，使得肿瘤坏死(Denekamp，英国放射学杂志，66，181(1993))。根据上述设想提出施用与抗体偶联的毒素、细胞生长抑制剂或同位素。这些抗体对与肿瘤相关性的血管内皮是有特异性的。其目的在于所述抗体共轭物可以内皮细胞特异性方式损害肿瘤相关性血管，并因此诱导肿瘤坏死(Burrows等人，药物治疗64，155(1994))。
所提出的更进一步的建议是通过特异性抗体方式将血栓形成物质、细胞因子或化学因子与肿瘤相关性内皮细胞结合，并通过籍此引发的血凝作用、炎症或免疫调节作用对肿瘤生长施加影响。类似的效果在通过带有转导内皮细胞之DNA的内皮细胞特异性抗体的方式将DNA导入内皮细胞，以分泌炎性物质或免疫调节物质或影响肿瘤生长的物质的方案中也观察得到(Burrows等人，药物治疗64，155(1994))。
内皮细胞表面上的膜抗原被提议作为制备具有所述特性之抗体的抗原。这些抗原包括例如endoglin、内皮唾酸蛋白、p96二体、VEGF受体、PDGF受体、尿激酶(uPA)受体及多种粘着分子(Burrows等人，药物治疗64，155(1994))。
然而，所有这些膜抗原所具有的一个特性是其至少以相对低的浓度还存在于非增生性内皮细胞上。由于即使在患肿瘤的生物体中非增生性内皮细胞的数量远远超过增生性内皮细胞，因此这并不足以保证通过施用抗体共轭物所寻求的肿瘤特异性效果的要求。2.活性化合物的描述本发明涉及一种活性化合物(即一种药物)，它可以经局部和全身施用于肿瘤患者，并在肿瘤生长部位即使不是完全地也是主要地引起内皮细胞的增生，并在相对长的一段时期内使血管生成受抑，诱导炎症形成，或直接或间接地产生细胞生长抑制物，籍此抑制肿瘤生长。
所述活性化合物的中心成分是一个由下列元件组成的DNA构建体
(在本申请全文中，DNA是包括互补DNA(cDNA)和基因组DNA序列的通用术语)。2.1激活物序列的选择激活物序列应理解为与转录因子发生相互作用的一段核苷酸序列(启动子序列或增强子序列)，所述作用在内皮细胞中或者另外在与增生的内皮细胞紧邻的细胞中产生或激活。a)在内皮细胞中激活的激活物序列CMV增强子、CMV启动子(EP0173177B1)、SV40启动子或本领域技术人员已知的任何其它启动子序列或增强子序列都可以用作激活物序列。
然而，在本发明所包括的含义范围内，优选的激活物序列包括那些来自基因的基因调节序列或元件，所述基因编码尤其是在内皮细胞中可以检测的(或者另外也在与增生的内皮细胞紧邻的细胞中也可以检测到的)蛋白质。
Burrows等人(药物治疗64，155(1994))和Plate等人(脑病理4，207(1994))已描述过上述的一些蛋白质，这些内皮细胞特异性蛋白质的具体例子有-脑特异性内皮细胞葡萄糖-1转运因子脑的内皮细胞因能很强地表达所述转运因子以将D-葡萄糖有效地经内皮细胞转入脑中而引人注意(Gerhart等人，神经科学研究杂志22，464(1989))，该启动子序列已由Murakami等人描述过(生物化学杂志267，9300(1992))。-endoglinendoglin似乎是TGFβ的非信号传递受体(Gougos等人，生物化学杂志265，8361(1990)，Cheifetz，生物化学杂志267，19027(1992)，Moren等人，BBRC 189，356(1992))。其少量地存在于正常内皮细胞上，而在增生的内皮细胞上表现为一定增强程度(Westphal等人，皮肤研究杂志100，27(1993)，Burrows等人，药物治疗65，155(1994))。Bellon等人(欧洲免疫学杂志23，2340(1993))和Ge等人(基因138，201(1994))已描述了该启动子序列。-VEGF受体有两种不同的受体(Plate等人，国际癌症杂志，59，520(1994))*VEGF受体1(flt-1)(de Vries等人，科学255，989(1992)(在胞质部分含有fms样酪氨酸激酶)*VEGF受体2(flk-1，KDR)(Terman等人，BBRC 187，1579(1992))(在胞质部分含有酪氨酸激酶)两种受体几乎无一例外地存在于内皮细胞上(Senger等人，癌转移评述12，303(1993))。-其它的内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶
*til-1或til-2(Partanen等人，分子细胞生物学12，1698(1992)，Schniirch和Risau，开发119，957(1993)，Dumont等人，致癌基因7，1471(1992))*B61受体(Eck受体)(Bartley等人，自然368，558(1994)，Pandey等人，科学268，567(1995)，van der Geer等人，细胞生物学年鉴10，251(1994))-B61B61分子表示B61受体的配体。(Holzman等人，美国Nephrol学会杂志4，466(1993)，Bartley等人，自然368，558(1994))-内皮缩血管肽，尤其是*内皮缩血管肽B(Oreilly等人，心血管药物，22，18(1993)，Benatti等人，临床研究杂志91，1149(1993)，O’Reilly等人，BBRC193，834(1993))。
该启动子序列已由Benatti等人描述过(J.Clin.Invest.91，1149(1993))。
*内皮缩血管肽1(Yanasigawa等人，自然332，411(1988)。
该启动子序列已由Wilson等人描述(分子细胞生物学10，4654(1990))。-内皮缩血管肽受体，尤其是内皮缩血管肽B受体。
(Webb等人，分子药物学47，730(1995)，Haendler等人，心血管药物20，1(1992))。-甘露糖-6-磷酸受体(Perales等人，欧洲生物化学杂志226，225(1994)。
该启动子序列已被描述过(Ludwig等人，基因142，311(1994)，Oshima等人，生物化学杂志263，2553(1988)和Pohlmann等人，PNAS美国84，5575(1987))。-von Willebrand因子该启动子序列已被描述过(Jahroudi and Lynch分子细胞生物学，14，999(1994)，Ferreira等人，生物化学杂志293，641(1993)和Aird等人，PNAS美国92，4567(1995))。-IL-1α和IL-1βIL-1由激活的内皮细胞产生(Warner等人，免疫学杂志139，1911(1987))。
该启动子序列已被描述过(Hangen等人，分子心脏学2，68(1986)，Turner等人，免疫学杂志143，3556(1989)，Fenton等人，免疫学杂志138，3972(1987)，Bensi等人，细胞生长系统，1，491(1990)，Hiscott等人，分子细胞生物学13，6231(1993)和Mori等人，血液84，1688(1994))。-IL-1受体该启动子序列已被描述过(Ye等人，PNAS美国90，2295(1993))。-血管细胞粘着分子(VCAM-1)VCAM-1在内皮细胞中的表达受下列因子激活脂多糖，TNF-α(Neish等人，分子细胞生物学15，2558(1995))，IL-4(lademarco等人，临床研究杂志95，264(1995))，IL-1(Marni等人，临床研究杂志92，1866(1993))。
VCAM-1的启动子序列已被描述过(Neish等人，分子细胞生物学15，2558(1995)，Ahmad等人，生物化学杂志270，8976(1995)，Neish等人，实验医学杂志176，1583(1992)，lademarco等人，生物化学杂志267，16323(1992)和Cybulsky等人，PNAS美国88，7859(1991))。-合成的激活物序列作为天然内皮细胞特异性启动子的另一种选择，还可以使用合成的激活物序列，其由用于结合转录因子的寡聚体化结合位点组成，在内皮细胞中具有优先的或选择活性。这类转录因子的一个例子是转录因子GATA-2，其在内皮缩血管肽1基因中的结合位点是5’-TTATCT-3’(Lee等人，生物化学266，16188(1991)，Dorfmann等人，生物化学杂志267，1279(1992)和Wilson等人，分子细胞生物学10，4854(1990))。b)在与激活的内皮细胞紧邻的细胞中激活的激活物序列在内皮细胞增生的情况下，邻接细胞可以通过处于开放状态的紧密连接而接近血液大分子。由于功能和结构上的关系，激活的内皮细胞之邻接细胞也是本发明意义上的靶细胞。-VEGFVEGF由与增生的内皮细胞紧邻的各种细胞(如平滑肌细胞和肿瘤细胞)产生，尤其是在低氧条件下(Ferrara等人，内分泌评论13，18(1992)，Berse等人，细胞分子生物学3，211(1992)，Finkenzeller等人，BBRC 208，432(1995)，Tischer等人，BBRC 165，1198(1989)，Leung等人，科学246，1306(1989))。VEGF基因的基因调节序列是*VEGF基因的启动子序列(5’侧翼区)(Michenko等人，细胞分子生物学研究40，35(1994)，Tischer等人，生物化学杂志266，11947(1991))或*VEGF基因的增强子序列(3’侧翼区)(Michenko等人，细胞分子生物学研究40，35(1994))或*c-Src基因(Mukhopadhyay等人，自然375，577(1995)，Bonham等人，致癌基因8，1973)，Parker等人，分子细胞生物学5，831(1985)，Anderson等人，分子细胞生物学5，1122(1985))或
*V-Src基因(Mukhodpadhyay等人，自然375，577(1995)，Anderson等人，分子细胞生物学5，1122(1985)，Gibbs等人，病毒学53，19(1985))-类固醇激素爱体及其启动子元件(Truss和Beato，内分泌评论14，459(1993))，尤其是*鼠乳腺肿瘤病毒启动子该启动子在大多数细胞中由类固醇激活，例如，由糖皮质激素(Parks，等人，细胞8，87(1976)或由黄体制剂(Cato等人，欧洲分子生物学组织杂志5，2237(1986))激活。MMTV长末端重复区的启动子区cDNA序列被描述过(Chalepakis等人，细胞53，371(1988)和Truss及Beato内分泌学评论14，459(1993))。2.2受体组件的选择作为一个例子，细胞周期调节的启动子组件可以理解为核苷酸序列CDE-CHR-Inr(参见下文)。该启动子组件的基本功能是抑制细胞周期G0/G1期激活物序列的功能，并在S/G2期继而在增生的细胞中引起细胞周期特异性的表达。
启动子组件CDE-CHR-Inr是在对人cdc 25c启动子的G2特异性表达的详细研究过程中发现的。最开始的突破点是发现了负责在细胞周期G1期关闭启动子的阻遏物元件(细胞周期依赖性元件，CDE)(Lucibello等人，欧洲生物学组织杂志14，132(1995))。借助基因组二甲基硫酸(DMS)足迹法和功能分析(图1和图2)，有可能证明CDE以G1特异性方式结合阻遏物(CDE结合因子，CDF)，并籍此在非增生(G0)细胞中对转录产生抑制作用。在其阻遏功能中，位于基础启动子区的CDE依赖于上游激活序列(UAS)。由此得出结论，CDE结合因子以细胞周期依赖性方式在非增生细胞中和处于细胞周期的G1期细胞中抑制5’结合激活物蛋白的转录激活作用(图3)。
上述结论通过下面进一步的实验得到证实，将非细胞周期调节的病毒早期SV40增强子与cdc25最小的启动子(含有CDE和位于3’端的起始位点)融合将对所得嵌合启动子产生明确的细胞周期调节作用(图4)。随后对cdc 25C增强子的研究表明，以细胞周期依赖性方式受到CDF调节的转录因子是NF-Y(同义词CBF，Dorn等人，细胞50，863(1987)，van Huiisduijnen等人，欧洲生物学组织杂志9，3119(1990)，Coustry等人，生物化学杂志，270，468(1995))、Sp1(Kadonage等人，TIBS 11，10，(1986))和可能是新的并与CBS7结合的一种因子(CIF)。该研究其它令人感兴趣的结果是观察到cdc25C增强子中的NF-Y与至少一种另外的NF-Y复合物或与CIF有效地合作只能激活转录。NF-Y和Sp1两者都属于富含谷氨酰胺的一类激活物，能提供有关阻遏机理的重要信息(例如与特定的基础转录因子或TAF的相互作用或干扰)。
对cdc 25C、细胞周期蛋白A和cdc2的启动子序列进行比较，证明在数个区域存在同源性(图5)。不仅仅CDE在所有3个启动子中都是保守的(所存在的趋异不具有功能相关性)，而且邻近的Yc盒也是保守的。正如所预料的，所有这些区域都抑制在体的蛋白质结合，而这一蛋白质结合过程在是CDE情况下为细胞周期依赖性的。另外，有可能证明所有3个启动子通过CDE突变而去调节(表1)。在对cdc 25C、细胞周期蛋白质A和cdc2序列进行比较时发现，在CDE紧接3’的区域也存在明显的相似性(细胞周期基因同源性区，CHR)(图5)。尽管该区在功能上与CDE同样重要(表1)，但在在体的DMS足迹法实验中尚未观察到。对此有一个可能的解释是该因子与所述DNA小沟之间的相互作用。电泳迁移率移位测定(EMSA)实验的结果表明，CDE和CHR一起结合蛋白质复合物CDF。这些观测结果表明，富含谷氨酰胺的激活物通过CDF介导的阻遏作用是经常存在的细胞周期调节的转录作用的机理。
但是，很显然，不仅CDE-CHR区对调节cdc 25C启动子具有重要性，而且还包括基础启动子(位置≤-20至≥+30，参见图1)核苷酸序列中的起始位点(位置+1)之一。包括YY-1体外结合位点在内的该区域突变(Seto和Shenk，自然354，241(1991)，Usheva和Shenk，细胞，76，1115(1994))将引起完全的去调节作用。鉴于CDE-CHR与基础启动子位置接近，因而就很可能发生CDF与基础转录复合物间的相互作用。2.3抗肿瘤物质的选择a)增生作用的抑制剂在本发明含义范围内，抗肿瘤物质应理解为能够抑制内皮细胞增生的蛋白质的DNA序列。所述DNA序列的例子包括下文所列参考文献涉及的DNA序列-成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)或其类似物p107和p120(LaThangue，细胞生物学流行观点6，443(1994))-p53蛋白(Prives等人，基因开发7，529(1993))-p21蛋白(WAF-1)(El-Deiry等人，细胞75，817(1993))-p16蛋白(Serrano等人，细胞366，704(1993)，Kamb等人，科学264，436(1994)，Nobori等人，自然368，753(1994))-其它的CdK抑制剂(Pines评述，TIBS 19，143(1995))-CADD45蛋白(Papathanasiou等人，分子细胞生物学11，1009(1991)，Smith等人，科学266，1376(1994))-bak蛋白(Farrow等人，自然374，731(1995)，Chittenden等人，自然374，733(1995)，Kiefer等人，自然374，736(1995))为了防止所述细胞周期抑制剂在细胞内迅速失活，应该优先使用具有被表达蛋白质的失活位点发生突变而并不因此损害蛋白质功能的那些基因。
成视网膜细胞瘤蛋白(pRb)及其相关的p107和p130蛋白经磷酸化作用失活。结果，所使用的pRb/p110、p107或p130 cDNA序列是有点突变的，以使被编码蛋白质的磷酸化位点用不能被磷酸化的氨基酸取代。
根据Hamel等人的描述(分子细胞生物学12，3431(1992))，当成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)氨基酸的246、350、601、605、780、786、787、800和804位被取代后其不再被磷酸化，而且，这些替代并不损害其与主要T抗原结合的活性。例如，在pRb/p110蛋白质中，用氨基酸Ala取代氨基酸Thr-256、Ser-601、Ser-605、Ser-780、Ser-786、Ser-787和Ser-800，用氨基酸Arg取代氨基酸Thr-350和用氨基酸Glu取代氨基酸Ser-804。
p107蛋白或p130蛋白的DNA序列以类似的方式进行突变。
p53蛋白是通过C末端392位丝氨酸的脱磷酸化的方式经与特定蛋白质(如MDM2)结合或经p53的寡聚而在细胞内失活(Schikawa等人，Leukemia和Lymphoma 11，21(1993)和Brown，肿瘤学年刊4，623(1993))。结果，优先使用的p53 cDNA序列是通过去掉392位丝氨酸而将C端截平。
b)血管生成抑制剂抗肿瘤药物进一步可理解为编码可抑制血管生成之蛋白质的DNA序列。这些蛋白质(有关的DNA序列参考所引用的文献)的具体例子有-纤溶酶原激活物抑制剂1(PAl-1)(Reilly等人，生物化学杂志265，9570(1990)，Bosma等人，生物化学杂志253，9219(1988))-PAl-2(Steven等人，欧洲生物化学杂志196，431(1991))-PAl-3(Meijers等人，生物化学杂志266，15028(1991))-血管抑制素(O’Reilly等人，细胞79，315(1994)，Bicknell等人，癌生物学研讨会3，399(1992))-干扰素(Dorr，药物45，177(1993)，今日药物22，597(1986)，US4518584，US4588585)，*IFNα(Henco等人，分子生物学杂志185，227(1985)，Pestka等人，生物化学年鉴56，727(1987)，Weissmann等人，伦敦皇家学会哲学学报B299，7(1982)，Goeddel等人，自然290，20(1981))
*IFNβ(Sen等人，生物化学杂志267，5017(1992)，Mark等人，欧洲专利192811，欧洲专利234599，美国专利4588585)*IFNγ(Gray等人，自然295，503(1982)，Yip等人，PNAS美国79，1820(1982)，Rinderknecht等人，生物化学杂志259，6790(1984))-血小板因子4(Mc Manus等人，免疫学杂志123，2835(1979)；Brindley等人，临床研究杂志72，1218(1983)；Deuel美国国家学术科学汇编78，4584，1981))-IL-12(Voest等人，国家癌症研究所87，581(1995)，Wolf等人，免疫学杂志146，3074(1991)，Gubler等人，PNAS美国88，4143(1991)，Kobayashi等人，实验医学杂志170，827(1989)，Gabler等人，PNAS 88，4143(1991)，Gately等人，免疫学杂志147，874(1991)，Schoenhaut等人，免疫学杂志148，3433(1992)，Wolf等人，免疫学杂志146，3074(1991))-TIMP-1(Kolkenbrock等人，欧洲生物化学杂志198，775(1991)，Faucher等人，病理生物学37，199(1989))-TIMP-2(Kolkenbrock等人，欧洲生物化学杂志198，775(1991))-TIMP-3(Wick等人，生物化学杂志269，18953(1994))-白血病抑制因子(LIF)(Pepper等人，细胞科学杂志108，73(1995)，Gough等人，Ciba基金会座谈会，167，24(1992)，PNAS美国85，5971(1988)，Stahl等人，生物化学杂志265，8833(1990)，Rathjan等人，细胞62，1105(1990))
c)细胞生长抑制蛋白和细胞毒性蛋白然而，抗肿瘤物质还可以理解为编码一种直接或间接显示对肿瘤具有细胞生长抑制作用之蛋白质的DNA序列。这些蛋白质尤其包括-穿孔素(Lin等人，今日免疫学16，194(1995))-粒酶(Smyth等人，今日免疫学16，202(1995))-IL-2(Fletscher等人，淋巴细胞活素研究6，45(1987)，Matsui等人，淋巴细胞活素12，1(1985)，Tanaguchi等人，自然302，305(1983))-IL-4(Lee等人，PNAS 83，2061(1986)；Paul，血液77，1859(1991)，Yokota等人，PNAS美国83，5894(1986)，van Leuven等人，血液73，1142(1989)，Arai等人，免疫学杂志42，274(1989))-IL-12(Kobayashi等人，实验医学杂志170，827(1989)，Gabler等人，PNAS 88，4143(1991)，Gately等人，免疫学杂志147，874(1991)，Schoenhaut等人，免疫学杂志148，3433(1992)，Wolf等人，免疫学杂志146，3074(1991))-干扰素，例如*IFN-α(Henco等人，分子生物学185，227(1985)，Pestka等人，生物化学年鉴56，727(1987)，Weissmann等人，伦敦皇家学会哲学学报B299，7(1982)，Goeddel等人，自然290，20(1981))*IFNβ(Sen等人，生物化学杂志267，5017(1992)，Mark等人欧洲专利192811，欧洲专利234599，美国专利4588585)
*IFNγ(Gray等人，自然295，503(1982)，Yip等人，PNAS美国79，1820(1982)，Rinderknecht等人，生物化学杂志259，6790(1984))-TNF(Porter TiBTech 9，158(1991)；Sidhu等人，药物治疗57，79(1993))，尤其是*TNFα(Beutler等人，自然320，584(1986)，Kriegler等人，细胞53，45(1988))*TNFβ(Gray等人，自然312，721(1984)，Li等人，免疫学杂志138，4496(1987)，Aggarwal等人，生物化学杂志260，2334(1985))-制瘤素M(Brown等人，免疫学杂志147，2175(1991)；Grove等人，生物化学杂志266，18194(1991)；Hamilton等人，生物化学、生物物理通讯180，652(1991)，Malik等人，分子细胞生物学9，2847(1989)，Kallstad等人，生物化学杂志266，8940(1991))d)炎症诱导剂抗肿瘤物质进一步可以理解为编码在适当的时候除了抗肿瘤作用外还刺激形成炎症，籍此消除肿瘤细胞之蛋白质的DNA序列。这些蛋白质的具体例子有-RANTES(MCP-2)(Schall等人，免疫学杂志141，1018(1988)，细胞61，361(1990))-单核细胞趋化和活化因子(MCAF)(Zachariae等人，实验医学杂志171，2177(1990)；Rollins等人，血液78，1112(1991)；Mukaida等人，免疫学杂志146，1212(1991)；Sica等人，免疫学杂志144，3034(1990))-IL-8
(Lotz等人，免疫学杂志148，466(1992)；Clore等人，生物化学29，1689(1990)，Matsushima等人，实验医学杂志167，1883(1988)，Baglioni等人，临床研究杂志84，1045(1989)，国际免疫药物杂志17，103(1995)，Carre等人，临床研究杂志88，1802(1991))-巨噬细胞炎性蛋白1(MIP-1α和MIP-1β)(Broxmeyer等人，免疫学杂志147，2586(1991)；Oh等人，免疫学杂志147，2978(1991)；Graham等人，自然344，442(1990))-中性粒细胞活化蛋白2(NAP-2)(Walz，风湿性关节炎，伦敦(1991)，Chang等人，生物化学杂志269，25277(1994))-IL-3(Otsuka等人，免疫学杂志140，2288(1988)；de Vries等人，茎细胞11，72(1993)，Yang等人，血液71，958(1988)，细胞47，3(1986)，Philips等人，基因84，501(1989))-IL-5(Azuma等人，核酸研究14，9149(1986)；Yokota等人，PNAS84，7388(1987)；Campbell等人，PNAS 84，6629(1987)，Azuma等人，核酸研究14，9149(1986))-人白血病抑制因子(LIF)(Gough等人，Ciba基金会座谈会167，24(1992)，PNAS美国85，5971(1988)，Stahl等人，生物化学杂志265，8833(1990)，Rahtjan等人，细胞62，1105(1990))-IL-7(Matzuda等人，白淋巴细胞5，231(1991)，Lupton等人，免疫学杂志144，3592(1990)，Goodwin等人，PNAS美国86，302(1989)，SWatherland等人，人体遗传学82，371(1989))-IL-11
(Paul等人，美国国家学术科学汇编87，7512(1990)，Teramura等人，血液79，327(1992)，KaWashima等人，欧洲生物化学学会联合会通信283，199(1991))-IL-13(McKenzie等人，免疫学杂志150，5436(1993)，Muzio等人，血液83，1738(1994)，McKenzie等人，PNAS 90，3735(1993)，Minty等人，自然362，248(1993))-GM-CSF(Wong等人，科学228，810(1985)，Gough等人，自然309，763(1984)，Nicola等人，生物化学杂志254，5290(1979))-G-CSF(Nagata等人，欧洲分子生物学组织杂志5，575(1986)，Nagata等人，自然319，415(1986)，Souza等人，科学232，61(1986))-M-CSF(Welte等人，PNAS 82，1526(1985)，Lu等人，生物化学，生物物理档案268，81(1989)， Kawasaki等人，科学230，291(1985)，Suzu等人，生物化学杂志267，4345(1992)，Wong等人，科学235，1504(1987))可以用作本发明意义上的活性物质的还有所列细胞因子和人免疫球蛋白之间形成的融合蛋白的DNA序列。具有这种特性的DNA序列及其制备方法已在欧洲专利0464633A1中描述过。
e)激活细胞生长抑制剂前体的酶类但是，抗肿瘤物质还可以理解为可以将抗肿瘤活性化合物前体转化为抗肿瘤活性化合物之酶的DNA序列。
已有综述文献报道了能够裂解无活性的前体物质(原药)并籍此形成活性细胞生长抑制剂(药物)的酶，以及在各种情况下有关的原药和药物(Deonarain等人，英国癌症研究杂志70，786(1994)，Mullen，药物治疗63，199(1994)和Harris等人，基因治疗，1，170(1994))。
例如，将利用编码下列酶之一的DNA序列-单纯疱疹病毒胸苷激酶(Garapin等人，PNAS美国76，3755(1979)，Vile等人，癌症研究53，3860(1993)，Wagner等人，PNAS美国78，1441(1981)，Moelten等人，癌症研究46，5276(1986)，国家癌症研究所杂志82，297(1990))-带状水痘病毒胸苷激酶(Huber等人，PNAS美国88，8039(1991)，Snoeck国际抗微生物试剂杂志4，211(1994))-细菌硝基还原酶(Michael等人，FEMS微生物通信124，195(1994)，Bryant等人，生物化学杂志266，4126(1991)，Watanabe等人，核酸研究18，1059(1990))-细菌β-葡糖醛酸糖苷酶(Jefferson等人，PNAS美国，83，8447(1986)-黑麦的植物β-葡糖醛酸糖苷酶(Schulz等人，植物化学26，933(1987))-人β-葡糖醛酸糖苷酶(Bosslet等人，英国癌症研究杂志65，234(1992)，Oshima等人，PNAS美国84，685(1987))-人羧肽酶(CB)，例如*肥大细胞CB-A(Reynolds等人，临床研究杂志89，273(1992))*胰CB-B(Yamamoto等人，生物化学杂志267，2575(1992)，Catasus等人，生物化学杂志270，6651(1995))*细菌羧肽酶(Hamilton等人，细菌杂志174，1626(1992)，Osterman等人，蛋白质化学杂志11，561(1992))
-细菌β-内酰胺酶(Rodrigues等人，癌症研究55，63(1995)，Hussain等人，细菌杂志164，223(1985)，Coque等人，胚胎杂志12，631(1993)-细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，PNAS美国89，33(1992)，Austin等人，分子药物学43，380(1993)，Danielson等人，分子微生物学6，1335(1992))-人过氧化氢酶或过氧化物酶(Ezurum等人，核酸研究21，1607(1993))-磷酸酶，尤其是*人碱性磷酸酶(Gum等人，癌症研究50，1085(1990))*人酸性前列腺磷酸酶(Sharieff等人，美国人体遗传学杂志49，412(1991)，Song等人，基因129，291(1993)，Tailor等人，核酸研究18，4928(1990))*5型酸性磷酸酶(基因130，201(1993))-氧化酶，尤其是*人赖氨酰氧化酶(Kimi等人，生物化学杂志270，7176(1995))*人酸性D-氨基氧化酶(Fukui等人，生物化学杂志267，18631(1992))-过氧化物酶*人谷胱甘肽过氧化物酶(Chada等人，基因组6，268(1990)，Ishida等人，核酸研究15，10051(1987))*人嗜酸性过氧化物酶(Ten等人，实验医学杂志169，1757(1989)，Sahamaki等人，生物化学杂志264，16828(1989))*人甲状腺素过氧化物酶(Kimura，PNAS美国84，5555(1987))为了促进分泌所列出的酶类，可以用改善了胞内分泌作用的异源信号序列替代各种情况下于所述DNA序列中包含的同源信号序列。
因此，例如可以用免疫球蛋白的信号序列(DNA位置≤63至≥107；Riechmann等人，自然，332，323(1988))替代β-葡糖醛酸糖苷酶的信号序列(DNA位置≤27至93；Oshima等人，PNAS 84，685(1987))。
另外，优先选择的DNA是编码那些经过点突变后较少地贮存于溶酶体中并提高了分泌能力的酶类。具有所述性质的点突变已有描述，例如，对于β-葡糖醛酸糖苷酶(Shiplex等人，生物化学杂志268，12193(1993))。2.4几种抗肿瘤物质的联合本发明进一步涉及一种活性化合物，其中结合了几种相同抗肿瘤物质(A，A)或几种不同抗肿瘤物质(A，B)的DNA序列。为了表达两种DNA序列，内部核糖体进入位点(IRES)的cDNA优选提出作为调节元件
这类IRES已被描述过(例如参见Mountford和Smith，TIG 11，179(1995)，Kaufman等人，核酸研究19，4485(1991)，Morgan等人，核酸研究20，1293(1992)，Dirks等人，基因128，247(1993)，Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988)和Sugitomo等人，生物技术12，694(1994))。
因此，脊髓灰质炎病毒IRES序列的cDNA(位置在5’UTR的≤140至≥630；Pelletier和Sonenberg，自然334，320(1988))可用于连接抗炎物质A的DNA(在3’端)和抗炎物质B的DNA(在5’端)。
根据结合的情况不同(A+A，A+B1)，所述性质的活性化合物表现出本发明意义上的相加或协同作用。2.5载体的构建用本领域技术人员熟悉的方式将新的DNA构建体制备成完整的载体。该载体可以来源于病毒或非病毒。例如，新的DNA构建体可以被插入病毒载体(这方面的信息可参见D.Jolly，癌症基因治疗1，51(1994))或还可用作质粒。病毒载体或质粒可与胶体分散体，例如与质脂体复合(Farhood等人，纽约科学院年刊716，23(1994))，或者另外也可以与聚赖氨酸/配体共轭物(Curiel等人，纽约科学院年刊716，36(1994))或与常规的辅剂配制成药物。2.6配体的选择可以给病毒性载体和非病毒性载体增加一个配体。能够与增生的内皮细胞表面结合的物质优选作为配体，例如以聚赖氨酸/配体共轭物形式。所述物质包括针对内皮细胞膜结构的抗体或抗体片段(例如参见Burrows等人，药物治疗64，155(1994)，Hughes等人，癌症研究49，6214(1989)和Maruyama等人，PNAS-美国87，5744(1990))。所述物质特别包括抗VEGF受体的抗体。
优选将鼠源单克隆抗体以人化形式加以利用。用已知的方法将所述抗体人化(Winter等人，自然349，293(1991)和Hoogenbooms等人，输血生物学译丛36，19(1993))。所述抗体片段也以本领域现有技术所述方式制备(例如参见Winter等人，自然349，293(1991)，Hoogenboom等人，输血生物学译丛36，19(1993)，Girol，分子免疫28，1379(1991)或Huston等人，国际免疫学评论10，195(1993))。
所述配体进一步包括能与内皮细胞上的膜结构或膜受体结合的所有活性物质。例如，包括在末端含有甘露糖的物质，以及能够与内皮细胞表达的受体结合的IL-1或生长因子或其片段或其组成序列，例如PDGF、bFGF、VEGF和TGFβ(Pusztain等人，病理学杂志169，191(1993))。此外，所述配体还包括与激活的和/或增生的内皮细胞结合的粘着分子。具有所述性质的粘着分子例如有SLex、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-4，这些分子都已被描述过(参见综述Augustin-Voss等人，细胞生物学杂志119，483(1992)，Pauli等人，癌转移评论，9，175(1990)和Honn等人，癌转移评论11，353(1992))。2.7活性化合物的制备(实施例)借助下列实施例将更详细地描述新活性化合物的制备方法。
a)构建嵌合启动子内皮缩血管肽1-CDE-CHR-Inr人内皮缩血管肽-1启动子(位置≤-170至≥-10)或经除去TATA盒而被截平的变异体在其3’端与人cdc 25C基因CDE-CHR-Inr组件(位置≤-20至≥+121)的5’端连接(图6)。利用本领域技术人员已知且经商业途径可以获得的酶进行有效的连接。
b)构建含活性化合物中心成分的质粒将已描述过的嵌合内皮缩血管肽-1启动子组件/转录单位以其3’端与人β-葡糖醛酸糖苷酶编码区DNA的5’端(位置≤27至≥1982，Oshima等人，PNAS美国84，685(1987))连接。该DNA还含有分泌所需的信号序列(22个N端氨基酸)。为了易于从细胞内分泌，该序列最好是由免疫球蛋白信号序列替代(位置≤63至≥107；Riechmann等人，自然332，323(1988)参见图7)。转录调控单位和编码β-葡糖醛酸糖苷酶的DNA被克隆到pUC 19/19或Bluescript衍生的质粒载体中，其可以直接或于胶体分散体系中应用于体内。另外，嵌合基团可转移至病毒载体或其它适宜载体中，并用于注射。2.8活性化合物的活性在局部施用(例如在肿瘤部位)或颅内或蛛网膜内施用，或经全身，优选经静脉内或动脉内施用后，本发明的活性化合物借助组织特异性激活物序列(UAS)和细胞周期调节的阻遏物组件的结合，能够使得主要是(即使不完全是)仅增生的内皮细胞或其邻接细胞分泌能够抑制增生作用本身或另外能诱导具有抗增生活性或细胞生长抑制作用的物质形成的物质。内此细胞增生的抑制和/或细胞生长抑制物质的释放可引起肿瘤生长的抑制。活性化合物具有良好的耐受性，因为抗肿瘤物质的形成因新活性化合物而限于肿瘤生长部位和由肿瘤引起的血管生成。
既然活性化合物由于其细胞特异性和细胞周期特异性而具有高度安全性，所以所述活性化合物可以大剂量使用，并且如果需要的话，可以数天或数周间隔性重复用于肿瘤疾病的治疗。
图1表示cdc 25C启动子区连同已在体内发现的蛋白质结合位点的核苷酸序列(基因组DMS足迹法；(实心圆点)完全性组成保护作用；○(空圈)部分性组成保护作用；*(星号)细胞周期调节的G1特异性保护作用)。CBS组成性结合位点；CDE细胞周期依赖性元件。以暗色划线的区域表示Yc盒(NF-Y结合位点)。起始位点以填黑的方形表示。
图2表示cdc 25C启动子通过cdc突变而在G0期出现的特异性去阻遏作用。
图3图解说明CDE对cdc 25C增强子的调节作用。
图4表示CDE对SV40增强子的G0/G1特异性阻遏作用。右边的数字表示G2期的诱导作用(与对照＝1相比)。
图5表示CDE-CHR区与cdc以25C、细胞周期蛋白A和cdc2启动子中位于5’端的Yc盒的同源性。
图6表示嵌合构建体，其由人内皮缩血管肽-1启动子、含CDE和CHR阻遏物元件的3’融合启动子组件以及编码作为效应子的β-葡糖醛酸糖苷酶的DNA(完整编码区，位置≤239-≥2194；Oshima等人，PNAS美国84，685(1987))不同部分组成。对于内皮缩血管肽-1基因的位置命名和对于cdc 25C所用系统分别参考Wilson等(分子生物学10，4854(1990))和Lucibello等(欧洲分子生物学组织15，132(1995))的描述。
图7中对于免疫球蛋白(HuVHCAMP)信号序列(MGWSCIILFLVATAT)的位置命名参照Riechmann等(自然，332，(1988))的描述。
另外，为了获得改善的β-葡糖醛酸糖苷酶之胞外分泌作用，插入Ig信号肽(图7B)。
表1CDE和CHR在cdc 25C、细胞周期蛋白A和cdc 2的细胞周期调节的转录中的作用表1G0生长因子wtcdc25C 0.8 13.117.5细胞周期蛋白A 0.7 27.141.7cdc21.0 41.241.2mCDE(-13)cdc25C 7.6 11.61.5细胞周期蛋白A 13.4 23.91.8cdc211.3 33.93.0mCHR(-6/-3)cdc25C 14.4 21.01.5细胞周期蛋白A 15.5 28.31.8cdc218.6 38.62.1在HIH3T3细胞中瞬时转染的结果表示为RLU/1000。mCDE突变的CDE(位置-13G→T)；mCHR突变的CHR(位置-6至-3)。
权利要求
1.一种预防或治疗肿瘤疾病的活性化合物，含有由激活物序列、启动子组件和编码抗肿瘤物质之DNA序列组成的DNA构建体。
2.如权利要求1所述的活性化合物，其中的启动子组件具有元件CDE-CHR-Inr，并含有cdc25C启动子区的位置≤-20至≥+30部分(核苷酸序列GGCTGGCGGAAGGTTTGAATGGTCAACGCCTGCGGCTGTTGATATTCTTG)、CDE表示细胞周期依赖性元件的序列2(核苷酸序列TGGCGG)、CHR表示细胞周期基因同源区(核苷酸序列GTTTGAA)和Inr表示起始位点(位置+1)的序列3以及对于抑制作用很重要的邻近序列。
3.如权利要求1所述活性化合物，其含有受转录因子调节的激活物序列(启动子序列或增强子序列)，所述转录因子在内皮细胞或在与增生的内此细胞紧邻的细胞中形成。
4.如权利要求3所述活性化合物，含有CMV启动子、CMV增强子或SV40启动子，或下列因子的启动子序列内皮细胞葡萄糖-1运输因子，endogolin，VEGF受体1或2、受体酪氨酸激酶til-1或til-2、B61受体、B61配体、内皮缩血管肽，尤其是内皮缩血管肽B或1、甘露糖-6-磷酸受体、IL-1α或IL-1β、IL-1受体、VCAM-1或vonWillebrand因子，或合成的激活物序列，其由寡聚的转录因子结合位点组成，例如结合位点为5’-TTATCT-3’的GATA-2，在内皮细胞内具有优先的或选择活性，或VEGF启动子序列或VEGF的增强子序列，或c-SRC或v-SRC的cDNA序列，能够调控VEGF基因，或小鼠乳腺肿瘤病毒的启动子序列，或甾族化合物受体的启动子序列。
5.如权利要求1-4所述的活性化合物，其中抗肿瘤物活性化合物的DNA序列编码成视网膜细胞瘤蛋白p110或p107和p130蛋白，或p53蛋白，或p21蛋白、p16蛋白或其它细胞周期蛋白依赖性激酶(cdK)抑制剂，或GADD45蛋白，或bak蛋白，或抑制血管生成的蛋白，或具有细胞生长抑制作用的蛋白，或刺激炎症形成的蛋白，或裂解细胞生长抑制剂前体从而形成细胞生长抑制剂的酶。
6.如权利要求5所述化合物，其中的成视网膜细胞瘤蛋白(pRb/p110)通过在246、350、601、605、780、786、787、800和804位上进行不丧失与主要T抗原结合活性的氨基酸取代而使之不再磷酸化，例如，用Ala取代Thr-246、Ser-601、Ser-605、Ser-780、Ser-786、Ser-787和Ser-800，用Arg取代Thr-350，用Glu取代Ser-804，或其中的p107蛋白以类似于pRb/110的方式突变，或其中的p130蛋白以类似于pRb/110的方式突变。
7.如权利要求5所述活性化合物，其中的p53蛋白通过去除Ser-392而在C端截平。
8.如权利要求1-4的活性化合物，其中的抗肿瘤物质是纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)、PAI-2、PAI-3、angiostatin、血小板因子4、TIMP-1、TIMP-2或TIMP-3。
9.如权利要求1-4的活性化合物，其中的抗肿瘤物质是穿孔素、granzyme、IL-2、IL-4、IL-12、干扰素，如IFNα、IFNβ、IFNγ、TNFα或TNFβ、制瘤素M、RANTES、MCAF、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、NAP-2、IL-3、IL-5、LIF、IL-11或IL-13。
10.如权利要求9所述活性化合物，其中的抗肿瘤物质是含免疫球蛋白Fc段的融合蛋白。
11.如权利要求1-4所述活性化合物，其中的抗肿瘤物质是一种酶，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、带状水痘病毒胸苷激酶、硝基还原酶、β-葡糖醛酸糖苷酶(尤其是人、植物或细菌性的)、羧肽酶(优选来源于假单胞菌)、内酰胺酶(优选来源于蜡状芽胞杆菌)、焦谷氨酸氨基肽酶、D-氨基肽酶、氧化过氧化物酶、磷酸酶、羟基腈裂解酶、蛋白酶、酯酶或糖苷酶。
12.如权利要求11所述活性化合物，其中因所述酶DNA序列发生点突变而使溶解体的贮备减少，其胞外分泌增加。
13.如权利要求11所述活性化合物，其中为了改善胞外分泌作用，用异源信号序列替代了所述酶的信号序列。
14.如权利要求1-13的活性化合物，含有数种相同或不同抗肿瘤物质的DNA序列，在各种情况下，两个DNA序列借助内核糖体进入位点的DNA序列彼此连接。
15.如权利要求1-13所述活性化合物，其被插入载体中。
16.如权利要求15的活性化合物，其中的载体是病毒。
17.如权利要求16所述活性化合物，其中的病毒是逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒或牛痘病毒。
18.如权利要求1-14的活性化合物，其被插入质粒中。
19.如权利要求15-18的活性化合物，其在胶体分散系统中制备。
20.如权利要求19的活性化合物，其中脂质体是胶体分散系统。
21.如权利要求20的活性化合物，其中聚赖氨酸/配体是胶体分散系统。
22.如权利要求15-21的活性化合物，其中增加了能够与内皮细胞膜结构结合的配体。
23.如权利要求22的活性化合物，其中的配体是多克隆或单克隆抗体，或其片段，通过可变区与内皮细胞的膜结构结合，是细胞因子或生长因子，或其片段或组成序列，或与平滑肌细胞上的受体结合，或是粘着分子，如SLeX、LFA-1、MAC-1、LECAM-1或VLA-4。
24.如权利要求23的活性化合物，其中内皮细胞的膜结构是指甘露糖、IL-1或生长因子如PDGF、FGF、VEGF或TGFβ的受体。
25.如权利要求1-24所述的活性化合物，是适于经静脉内、动脉内、腔内注射至组织或组织间隙或适于局部施用的药物制剂。
全文摘要
本发明描述了用于肿瘤的基因治疗的DNA序列，所述DNA的基本组成元件包括激活物序列、启动子组件和编码活性物质的基因。所述激活物序列在增生的内皮细胞或在与所述细胞邻接的细胞中以细胞特异性的方式被激活。该激活过程以细胞周期特异性方式受启动子组件的调节。所述活性物质是血管生成的抑制剂或细胞生长抑制分子或细胞毒性分子。所述DNA序列插入到病毒或非病毒载体中，所述载体已增加了与激活的内皮细胞具有亲和力的配体。
文档编号C07K14/475GK1158144SQ95195134
公开日1997年8月27日 申请日期1995年8月25日 优先权日1994年8月26日
发明者H·H·塞德拉斯克, K·伯斯莱特, R·穆勒 申请人:赫彻斯特股份公司