斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因及其编码的蛋白的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因及其编码的蛋白，属于生 物基因技术领域。
【背景技术】
[0002] 细胞周期调控是一个精确调控的过程。在细胞分裂过程中真核生物的细胞周期可 以概括为两个大的阶段：细胞分裂间期（即Gl时期、S时期和G2时期）和细胞分裂期（即 M时期），在细胞分裂时期，需要许多周期蛋白参与调控以保证其精确性。
[0003] 细胞周期蛋白依赖性激酶2 (cyclin-dependent kinase 2，Q)K2)是细胞周期调 控重要的因子之一，参与调控G1/S的转变和S期的进程。正常情况下除Gl后期和S期外， ⑶Κ2在细胞核和细胞质中等量分布。Gl后期大量⑶Κ2进入细胞核直接与cyclinE亚基结 合，形成Cyclin E/Q3K2复合物，可促进视网膜母细胞瘤蛋白（retinoblastoma protein， pRB)的磷酸化，释放转录因子E2F，促进细胞周期G1/S期的转变。Cyclin E/⑶K2推动细胞 进入S期后即被蛋白酶水解，解离出来的CDK2将与CyclinA结合并作用于其下游底物以促 进S期的顺利完成，实现对细胞周期的准确调控，进而可以实现对卵巢发育的调控。
[0004] 长期以来，斑节对虾亲虾的人工繁育问题一直都是限制斑节对虾养殖产业发展的 技术瓶颈。在实际生产过程中，亲虾的性腺成熟参差不齐，难以集中育苗的问题是对虾养殖 过程中一个非常重要的限制因素。眼柄切除手术作为促进亲虾性腺同步成熟的常用方法， 对亲虾本身存在非常大破坏性，不利于可持续养殖，加大了养殖成本。因此出于寻求一种新 的对虾繁育方法的需求，对对虾卵巢发育机理及其分子调控机理进行研宄势在必行。
【发明内容】
[0005] 针对上述问题，本发明的目的在于以实验室高通量测序获得的EST序列为基础设 计的PCR扩增引物，并通过RACE技术克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因的 全表达序列；通过斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因设计荧光定量PCR引物，对细 胞周期蛋白依赖性激酶2基因在斑节对虾卵巢各个发育时相的分布情况及在不同组织中 的分布情况进行研宄分析；根据斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因设计原核表达引 物，在体外通过大肠杆菌为载体成功获得重组的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2。
[0006] 本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因，该基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0007] 该基因的制备方法依次包括下述步骤：
[0008] 1、总RNA的提取
[0009] 取健康斑节对虾，解剖，取肌肉、卵巢、肝胰腺、脑、心脏、精巢、淋巴等组织，并分别 将组织于ImL Trizol (Invitrogen，日本）中勾衆，按Trizol试剂盒使用手册提取斑节对虫下 总RNA并用DEPC水悬浮，电泳观察所提取RNA的完整性，并置于-80 °C保存。
[0010] 2、CDNA第一链的合成
[0011] 取上述斑节对虾总RNA 2 μ L与反转录引物（5' -GGCCACGCGACTAGTAC (T) 16-3') lyL(10pmol/L)混合在反转录酶（M-MLV，Promega，USA)的作用下合成cDNA-链，反应条 件：42°C 60min，7(TC 15min。
[0012] 3、引物设计依据，引物合成的方法
[0013] 根据已有的细胞周期蛋白依赖性激酶2的EST序列设计引物：Pm-⑶K2cDNA全长 扩增及表达所用的引物
[0014]
【主权项】
1. 斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因，其特征在于，所述的基因序列如SEQ ID NO: 1所示。
2. 权利要求1所述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因编码的蛋白，其特征在 于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3. 含权利要求1或2所述基因的重组质粒。
4. 根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组载体为将权利要求1或2所 述基因插入pET21a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
5. 含有权利要求1或2所述基因的重组菌。
6. 根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求4所述重组质 粒转化大肠杆菌BL21得到的。
7. 权利1或2所述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2在斑节对虾不同组织、时期 的分布和表达。
8. 权利1或2所述的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2在大肠杆菌中体外重组表 达。
【专利摘要】本发明公开了斑节对虾细胞周 期蛋白依赖性激酶2基因及其编码的蛋白，本发明提供的斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2基因不仅为研究斑节对虾细胞周期蛋白依赖性激酶2在卵巢发育中的作 用奠定基础，而且可以为斑节对虾养殖过程中所出现的性腺发育参差不齐的情况从分子层面提供理论基础；其技术要点，该基因序列如SEQ?ID?NO:1所 示；编码蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示；属于生物基因技术领域。
【IPC分类】C12N15-70, C12N1-21, C12N9-12, C12N15-54
【公开号】CN104561058
【申请号】CN201510083773
【发明人】邱丽华, 傅明骏, 赵超, 戴文婷, 江世贵, 周发林
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年2月13日