专利名称：依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂及其组合物和相关用途的制作方法
I.发明领域本发明普遍地涉及用作依赖细胞周期蛋白的激酶(cdk)抑制剂的化合物、含这类化合物的药用组合物、配制药用组合物的方法，或用这类化合物治疗癌症、或增殖性疾病或其它疾病的方法，以及用于制备这类化合物的中间体和方法。
II.发明背景生物学中的一个最重要和基本的过程是由细胞周期介导的细胞分裂。该过程确保控制产生具有特定生物功能的后代细胞。它是高度调控的现象，对多种细胞内和外部来源的细胞信号产生应答。肿瘤促进和抑制基因产物的复杂网络是该细胞信号过程的关键成分。过度表达肿瘤促进成分或随后肿瘤抑制产物的损失将导致细胞增殖和肿瘤产生失控(Pardee，Science 246603-608，1989)。依赖细胞周期蛋白的激酶在调节细胞周期机器(machinery)中起关键作用。这些复合物由以下两种成分组成催化亚单位(激酶)和调节亚单位(细胞周期蛋白)。迄今为止，已鉴别九种激酶亚单位(依赖细胞周期蛋白的激酶1-9)和几种调节亚单位(细胞周期蛋白A-H、K、N和T)。每种激酶与特异性调节配偶体联合在一起，组成活性催化部分。通过特殊的依赖细胞周期蛋白的激酶复合物调节细胞周期的每次转换通过依赖细胞周期蛋白的激酶2/细胞周期蛋白E、依赖细胞周期蛋白的激酶4/细胞周期蛋白D1和依赖细胞周期蛋白的激酶6/细胞周期蛋白D2调节G1/S；通过依赖细胞周期蛋白的激酶2/细胞周期蛋白A和依赖细胞周期蛋白的激酶/细胞周期蛋白A调节S/G2；G2/M通过依赖细胞周期蛋白的激酶/细胞周期蛋白D调节。这些激酶的协同活性引导个体细胞通过复制过程，确保每批后代的活力(Sherr，Cell 731059-1065，1993；Draetta，Trends Biochem.Sci.15378-382，1990)。
越来越多的证据表明肿瘤发展和依赖细胞周期蛋白的激酶相关的机能障碍有关。过度表达细胞周期蛋白的调节蛋白和随后的激酶活动过强与几种癌症相关(Jiang，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 909026-9030，1993；Wang，Nature 343555-557，1990)。最近发现依赖细胞周期蛋白的激酶的内源性、高度特异性蛋白抑制剂对细胞增殖具有重要影响(Kamb等，Science 264436-440，1994；Beach，Nature 336701-704，1993)。这些抑制剂包括p16INK4(依赖细胞周期蛋白的激酶4/D1抑制剂)、p21CIP1(非特异性依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂)和p27KIP1(特异性依赖细胞周期蛋白的激酶2/E抑制剂)。最近的与依赖细胞周期蛋白的激酶2/A结合的p27的晶体结构显示这些蛋白质如何通过与依赖细胞周期蛋白的激酶复合物进行多次相互作用，从而有效抑制激酶活性(Pavletich，Nature 382325-331，1996)。这些蛋白质通过与它们相应的依赖细胞周期蛋白的激酶复合物进行特异性相互作用，来帮助调节细胞周期。缺乏这些抑制剂的细胞易生长失控和形成肿瘤。这些证据导致人们积极寻找cdk家族的小分子抑制剂治疗药物。
III.发明概述本发明描述称为依赖细胞周期蛋白的激酶酶类的有效抑制剂化合物。本发明提供通过给予治疗有效量的至少一种本发明化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体治疗癌症或其它增殖性疾病或其它疾病的方法。本发明还提供通过给予治疗有效的至少一种本发明化合物和另一种抗癌或抗增殖药物的联合药物治疗癌症或其它增殖性疾病或其它疾病的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了具有式I结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体
其中R8代表取代或未取代的杂环或取代或未取代的吗啉代、取代或未取代的哌嗪基或取代或未取代的环己基；F代表(CH2)n，其中n是1-6的整数，在一些实施方案中，n是1；Q代表取代或未取代的仲氨基取代基、取代或未取代的叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，n是1。
在一些实施方案中，式I中的Q代表叔氨基取代基，例如二烷基胺。在一些实施方案中，式I中的Q代表取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。在一些实施方案中，Q代表含氮杂芳基环、叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，R8代表 其中Z是O或NR”；且R”代表H或低级烷基。
在一些实施方案中，具有式I结构的化合物不包括一种或多种下列化合物
在一些实施方案中，式I化合物包括一种或多种在表中列出的化合物。例如，式I化合物可包括一种或多种化合物B1-B20和C2。
如上所述，在一些实施方案中，合适的取代基在每次出现时可独立地包括烷基、氧代基、酰基氨基、羟基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、羟基烷基、烷氧基烷基、芳基、杂环基、环烷基或低聚(乙二醇)。在一些实施方案中，当Q代表仲氨基取代基时，合适的取代基包括烷基、烷氧基烷基、羟基烷基和羟基烷氧基烷基。本领域技术人员应当容易地认识到，所列举的取代基不是穷尽的，并且可以使用很多其它合适的取代基。
在某些实施方案中，本发明提供了具有式II结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表O、S或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基或金属抗衡离子；R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，条件是R5和R6当中只有一个代表H；R7代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝O)和C(＝S))、NR”、O、S、S(O)或S(O2)；当存在于B中时，n代表1-4的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且Q代表取代或未取代的叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，R8代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。
在一些实施方案中，R”代表H。
在一些实施方案中，R5代表MnQ。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表CH2。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表C(＝O)。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表取代的NR”。
在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的叔氨基。
在一些实施方案中，R8代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。在一些实施方案中，R”代表H。而在一些实施方案中，至少一个出现的M代表CH2、取代的NR”，或者当连接在Q上时，代表CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环。在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂环。在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的叔氨基。在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的仲氨基。
在某些实施方案中，本发明涉及具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 C1。
在某些实施方案中，本发明涉及具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 C5。
在一些实施方案中，本发明提供了纯化或合成形式的一种或多种本文所述化合物。
在某些实施方案中，本发明提供了具有式II结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表O、S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基或金属抗衡离子；R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R代表H或任选取代的低级烷基；R5代表MnJK；R6代表H、OH或MnQ；R7代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、N(R”)2或N(R’)SO2R”；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝O)和C(＝S))、NR”、O、S、S(O)或S(O2)；当存在于B中时，n代表1-7的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且
Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、仲氨基取代基、叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，R8代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。在一些实施方案中，R”代表H。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表CH2、取代的NR”、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，R8代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。
在一些实施方案中，R”代表H。
在一些实施方案中，R5代表MnQ。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，连接在Q上的M是C(＝O)。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表CH2。
在一些实施方案中，连接在Q上的M代表取代的NR”。
在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的叔氨基取代基。
在一些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，取代基在每次出现时独立地包括烷基、氧代基、酰基氨基、羟基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、羟基烷基、烷氧基烷基、芳基、杂环基、环烷基或低聚(乙二醇)。
在某些实施方案中，本发明提供了具有式II结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中
B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表O、S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基或金属抗衡离子；R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R代表H或任选取代的低级烷基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2、MnJK或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，条件是R5和R6当中只有一个代表H；R7在每次出现时独立地代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、N(R”)2或N(R’)SO2R”；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝O)和C(＝S))、NR”、O、S、S(O)、S(O2)或CH2；当存在于B中时，n代表1-7的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、仲氨基取代基、叔氨基取代基或含氮杂环；条件是不包括具有式IIa结构的化合物 其中W和Z独立地代表O或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基或金属抗衡离子；
R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，条件是R5和R6当中只有一个代表H；R7在每次出现时独立地代表H、卤素、低级烷基或低级烷氧基；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝S)和C(＝O))、NR”、O、S、S(O)、S(O2)；n代表1-5的整数；且Q代表含氮杂芳基环、叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，式IIa中的Q代表叔氨基取代基例如二烷基胺。在一些实施方案中，式IIa中的Q代表取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。在一些实施方案中，Q代表含氮杂芳基环、叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表C(＝O)、C(＝S)、S(O2)或CH2；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基、金属抗衡离子或碱土金属抗衡离子；R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R代表H或任选取代的低级烷基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2、MnJK或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，条件是R5和R6当中只有一个代表H；R7代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、N(R”)2或N(R’)SO2R”；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝S)和C(＝O))、NR”、O、S、S(O)或S(O2)；当存在于B中时，n代表1-4的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且
Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、仲氨基取代基、叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，Q代表叔氨基取代基例如二烷基胺，或取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。
在一些实施方案中，在式II中，B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表O、S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基、金属抗衡离子或碱土金属抗衡离子；R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R代表H或任选取代的低级烷基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2、MnJK或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，条件是R5和R6当中只有一个代表H；R7代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、N(R”)2或N(R’)SO2R”；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝S)和C(＝O))、NR”、O、S、S(O)或S(O2)；当存在于B中时，n代表1-4的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且Q代表取代或未取代的仲氨基取代基。
在一些实施方案中，在式II中，B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环；V代表O、S或N-CN；W代表O、S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2或NR”；R’在每次出现时独立地代表H、低级烷基、金属抗衡离子或碱土金属抗衡离子；
R”在每次出现时独立地代表H或低级烷基；R代表H或任选取代的低级烷基；R5代表MnJK，条件是R5不是CH2COOH；R6代表H、OH或MnQ；R7代表H、卤素、羟基、低级烷基或低级烷氧基；R8代表取代或未取代的烷基、链烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、N(R”)2或N(R’)SO2R”；M在每次出现时独立地代表取代或未取代的亚甲基(包括C(＝S)和C(＝O))、NR”、O、S、S(O)或S(O2)；当存在于B中时，n代表1-4的整数，当存在于R5中时，n代表0-6的整数，当存在于R6中时，n代表1-3的整数；且Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、仲氨基取代基、叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，Q是取代或未取代的含氮杂芳基环，而R8可代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。在式II中，R”可代表H。
M还可以代表CH2。在一些实施方案中，在式II中，W代表CH2，且至少一个M代表取代的NR”。
在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的仲氨基。在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的叔氨基。在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，R5代表MnQ，且Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环、叔氨基取代基或含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的叔氨基。
在一些实施方案中，在式II中，Q代表取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，在式II中，R5代表MnQ，且Q代表取代或未取代的仲氨基。
在一些实施方案中，在式II中，R5代表MnQ，且Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环。
在一些实施方案中，在式II中，R8代表取代或未取代的吗啉代、哌嗪基或环己基。
在一些实施方案中，在式II中，R”代表H。
在一些实施方案中，在式II中，W代表CH2。
在一些实施方案中，在式II中，当与Q连接时，M是CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，在式II中，当与Q连接时，M是CH2。
在一些实施方案中，在式II中，与Q连接的M是CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)。
在一些实施方案中，在式II中，V是O，M代表NH，且R8具有以下结构 其中Z代表O或NR”。
在一些实施方案中，AR代表苯基环，且所有出现的R6和R7代表H。
在某些实施方案中，本发明提供了具有式V结构的化合物或其前药、异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中
R8代表取代或未取代的杂环；Q代表取代或未取代的仲氨基取代基、叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
如上所述，在一些实施方案中，R8可代表吗啉代或哌嗪基环。
在一些实施方案在中，如上所述，Q可代表哌嗪、吗啉、哌啶、吡啶、吡咯、唑、异唑、咪唑或吡唑。
一些实施方案包括选自A34、A36、A37、A44、A46和A76-A82的化合物或其前药、异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
一些实施方案包括选自A47、A49、A51和A82的化合物或其前药、异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在一些实施方案中，W代表O、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、S、CH2或NR”。
如上所述，在一些实施方案中，W代表取代或未取代的含氮杂芳基环、叔氨基取代基或含氮杂环。
在某些实施方案中，每次出现时，合适的取代基可独立包括烷基、氧代基、酰基氨基、羟基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、羟基烷基、烷氧基烷基、芳基、杂环基、环烷基或低聚(乙二醇)。在某些实施方案中，其中Q代表仲氨基取代基，合适的取代基包括烷基、烷氧基烷基、羟基烷基和羟基烷氧基烷基。本领域技术人员将容易认识到列举的取代基并非穷尽性，可使用许多其它合适的取代基。
某些实施方案可包括包含药学上可接受的赋形剂和本文中公开的任何类型化合物的药用组合物，而某些实施方案包括治疗过度增殖性疾病的方法，该方法包括给予动物本文中公开的任何类型化合物。
在某些实施方案中，本文中公开的化合物可应用到抑制细胞增殖的方法中，这类方法包括使细胞与本文中公开类型的化合物接触；或应用到治疗病毒感染(例如由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的感染)的方法中，这类方法包括给予哺乳动物本文中公开类型的化合物。某些实施方案包括治疗或预防化学疗法或放射疗法引起的脱发的方法，这类方法包括将本文中公开类型的化合物和一种或多种化学疗法或放射疗法联合给予哺乳动物。本文中公开的化合物也可用于制备药物。
本发明化合物还可用于治疗病症例如过度增殖性病症。可将化合物对人或动物给药。本发明化合物可用于抑制细胞增殖，例如通过将增殖的细胞与化合物接触来实现所述作用。通过把化合物对哺乳动物给药，本发明化合物还可用于治疗病毒感染。
使用本发明化合物形成的药物可用作治疗或预防病症(例如过度增殖性病症)、病毒感染、化疗诱导的脱发、与依赖细胞周期蛋白的激酶活性有关的疾病等的药物。药物可用于治疗本文描述的任何病症。
使用本发明化合物的各种方法是可以利用的。例如，可采用方法来抑制依赖细胞周期蛋白的激酶，包括给需要这种治疗的宿主施用治疗有效量的任何化合物。还可以采用方法来治疗与依赖细胞周期蛋白的激酶有关的病症，包括给需要这种治疗的宿主施用治疗有效量的化合物。本发明还涉及治疗人或其它动物的方法。在一些实施方案中，可使用包含治疗有效量的一种或多种本发明化合物的组合物来治疗人或其它动物。
在某些实施方案中，本发明提供一种新的药用组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和治疗有效量的式(I)或(II)化合物或本文中公开的任何其它化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种新的治疗癌症或其它增殖性疾病或其它疾病的方法，该方法包括给予有这种治疗需要的宿主治疗有效量的式(I)或(II)化合物或本文中公开的任何其它化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种新的治疗癌症或其它增殖性疾病或其它疾病的方法，该方法包括给予有这种治疗需要的宿主治疗有效量的(a)式(I)或(II)化合物或本文中公开的任何其它化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体；和(b)至少一种选自抗癌药和抗增殖药的化合物。
如本文所述，本发明抑制剂能抑制细胞周期机器，因而可用于调节细胞周期进程，最终控制细胞生长和分化。此类化合物可用于治疗患者的与过度细胞增殖有关的疾病，例如癌症、银屑病、涉及不需要白细胞增殖的免疫疾病；可用于治疗再狭窄和其它平滑肌细胞疾病等。此类化合物还可用于抑制I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)转录(Wang等，J.Virology 757266-7279(2001)。
本文中也描述了本发明化合物可用于制备药物，该药物可用于治疗疾病例如本文中论述的那些疾病。
IV.附图简述
图1表示以下情况暴露在化合物A37中所受影响(a)通过PIFACS分析进行的HCT-116细胞的细胞周期分析；(b)诱导PARP分裂。
图2用(a)剂量反应；和(b)时程说明化合物A37对HCT-116肿瘤细胞产克隆(clongeneic)存活的不可逆作用。
图3图示化合物B16对HCT-116肿瘤细胞产克隆存活的不可逆作用，以时程表示。
图4表示与暴露于相同化合物的停滞正常(IMR90)细胞相比，暴露于化合物A37的停滞肿瘤(HCT-116)细胞的生存力下降。
图5代表用本发明各种化合物进行HCT-116异种移植肿瘤试验得到的结果。
图6表示用化合物A37进行A2780异种移植肿瘤试验得到的结果，由(a)在各种剂量下肿瘤大小的时程；和(b)试验中的显著度量(salient metrics)表表示。
图7表示用化合物A37进行PC3异种移植肿瘤试验得到的结果，由(a)在各种剂量下肿瘤大小的时程；和(b)试验中的显著度量表表示。
图8表示用化合物B16进行A2780异种移植肿瘤试验得到的结果，由(a)在各种剂量下肿瘤大小的时程；和(b)试验中的显著度量表表示。
图9表示CDK2/细胞周期蛋白E与加载CM5-抑制剂的芯片结合得到结果的实例。KD根据这些数据计算，等于8,0+/-2,8nM。
V.示例性实施方案详述本发明涉及新的依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(cdks)，尤其是但不仅仅是cdk/细胞周期蛋白复合物抑制剂。如本文中所述，本发明抑制剂能抑制细胞周期机器，因而可用于调节细胞周期进程，最终控制细胞生长和分化。此类化合物可用于治疗患者的与过度细胞增殖有关的疾病，例如治疗癌症、银屑病、涉及不需要白细胞增殖的免疫疾病；可用于治疗再狭窄和其它平滑肌细胞疾病等，更详细论述如下。
在一个实施方案中，本发明提供具有式I结构的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中R8代表取代或未取代的杂环或取代或未取代的吗啉代、取代或未取代的哌嗪基或取代或未取代的环己基；F代表(CH2)n，其中n是1-6的整数，在一些实施方案中，n是1；Q代表取代或未取代的仲氨基取代基、取代或未取代的叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，式I中的Q代表叔氨基取代基，例如二烷基胺。在一些实施方案中，式I中的Q代表取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。在一些实施方案中，Q代表含氮杂芳基环、叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环。
在一些实施方案中，R8代表
其中Z是O或NR”；且R”代表H或低级烷基。
在一些实施方案中，具有式I结构的化合物不包括一种或多种下列化合物
在一些实施方案中，式I化合物包括一种或多种在表中列出的化合物。例如，式I化合物可包括一种或多种化合物B1-B20和C2。
如上所述，在一些实施方案中，合适的取代基在每次出现时可独立地包括烷基、氧代基、酰基氨基、羟基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、羟基烷基、烷氧基烷基、芳基、杂环基、环烷基或低聚(乙二醇)。在一些实施方案中，当Q代表仲氨基取代基时，合适的取代基包括烷基、烷氧基烷基、羟基烷基和羟基烷氧基烷基。本领域技术人员应当容易地认识到，所列举的取代基不是穷尽的，并且可以使用很多其它合适的取代基。
在另一个实施方案中，本发明还提供具有式II结构的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中B代表MnR8；Ar代表芳基或杂芳基环例如苯环；V代表O、S或N-CN，优选O或S；W代表O、S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2或NR”；每次出现时，R’独立代表H、低级烷基或金属抗衡离子例如碱或碱土金属抗衡离子；每次出现时，R”独立代表H或低级烷基，优选H；R代表H或任选取代的低级烷基，优选具有选自酯、酰胺、酰基氨基或酰氧基的取代基；R5代表H、P(＝O)(OR’)2、MnJK或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，优选条件是R5和R6中的一个且只有一个代表H；每次出现时，R7独立代表H、卤素、羟基、低级烷基，例如甲基或低级烷氧基，例如甲氧基；R8代表取代或未取代的烷基、烯基、炔基、烷氧基、芳基、杂芳基、环烷基、杂环基或胺；J代表C(＝O)、C(＝S)或SO2；K代表OR’、NR”或N(R’)SO2R”；每次出现时，M独立代表取代或未取代的亚甲基(例如被低级烷基、氧代基、羟基等取代)、NR”、O、S、S(O)或S(O2)，优选NR”或CH2，或当与W或Q连接时，代表CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)；当在B中出现时，n代表0-10的整数，优选1-7或甚至1-4，在R5中出现时，代表0-6的整数，在R6中出现时，代表1-3的整数；和Q代表取代或未取代的含氮杂芳基环例如吡咯、四唑、唑、二唑、异唑、咪唑或吡唑；仲氨基取代基例如单烷基胺、芳基烷基胺、杂芳基烷基胺；叔氨基取代基例如二烷基胺；或含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪、吡啶或吡咯烷。
在某些实施方案中，当K代表N(R’)SO2R”时，R”代表低级烷基。
在某些实施方案中，当R5为MnJK时，R5不为CH2COOH。
在某些实施方案中，每次出现时，合适的取代基独立包括烷基、氧代基、羟基、烷氧基、羟基-烷氧基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、烷基卤、酰基氨基，或取代或未取代的芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、低聚(乙二醇)等。对本领域技术人员来讲芳基和杂芳基可使用任何合适的取代基包括任何上述所列那些取代基是显而易见的。
在某些实施方案中，R8代表任何以下取代基烷基、烯基、炔基、烷氧基、羟基-烷氧基、芳基、胺或杂芳基。在某些实施方案中，任何前述取代基可任选被任何所述取代基取代，或甚至被卤素、-CN、N3、NO2或卤代烷基取代。其它合适的取代基还可包括例如环己基、＝O、羰基、磺酰基、羧基、磺酸基(sulfoxyl)、酰胺、杂环、酯或醚。
在某些实施方案中，当在R5中出现并与R8连接时，M至少一次为取代的NR”。
在某些实施方案、包括任何以上实施方案中，R8具有以下形式 其中Z代表O或NR”。在某些实施方案中，R8代表吗啉代或环己基。在某些此类实施方案中，Mn为NR”，优选NH。在某些实施方案中，V为O。
在某些实施方案中，W代表CH2。在某些此类实施方案中，M至少一次为取代的NR”。
在某些实施方案中，其中R”′存在并且为取代的低级烷基，该低级烷基被1-3(优选1)个选自以下的取代基取代低级烷基、低级卤代烷基、NR8R8a、NR”C(O)R8、＝O、COR8、CO2R8、NR”CO2R8、C(O)NR8R8a、NR”C(O)NR8R8a、NR”C(S)NR8R8a、C(S)NR8R8a、NR”SO2NR8R8a、SO2NR8R8a、NR’′SO2R8a、SO2R8a、NR’′SO2R8a、被0-5个R”′取代的C3-10碳环，和含1-4个选自O、N和S的杂原子的被0-3个R8取代的5元-10元杂环，其中R8代表H、C1-4卤代烷基、NR8aR8a、NR”C(O)OR8a、NR”C(O)R8a、COR8a、CO2R8a、CONR8aR8a、NHC(O)NR8aR8a、NHC(S)NR8aR8a、SO2NR8aR8a、SO2R8a、C1-4烷基、苯基、苄基、被任选被0-3个R”′取代的C2-10烯基取代的C5-10烷基、被0-3个R取代的C2-10炔基、-(CF2)mCF3、被0-5个R”′取代的C3-10碳环，以及被0-3个R取代的含1-4个选自O、N和S的杂原子的5元至10元杂环；每次出现时，R8a独立代表选自H、低级烷基、苯基和苄基的基团。
在某些实施方案中，R”′含氨基酸残基例如缬氨酸或甘氨酸残基，例如R”′为通过酰胺或酯键被氨基酸残基取代的低级烷基残基。
在优选的实施方案中，R5W和R6在Ar上彼此相邻(邻位)，优选不和与三环母核连接的键相邻(邻位)。
在某些实施方案中，V代表S或N-CN。在某些实施方案中，Ar代表杂芳环。
在式II的某些实施方案中，W代表O、S或NR”。在某些实施方案中，R5代表H、P(＝O)(OR’)2或MnQ。在某些实施方案中，每次出现时，R7独立代表卤素、羟基、低级烷基例如甲基或低级烷氧基例如甲氧基。在某些实施方案中，当出现在R5时，n代表0-5的整数，优选1-5，更优选2-4。
在式II的某些实施方案中，W代表O、CH2、C(＝O)、C(＝S)或SO2。在某些实施方案中，R5代表MnJK或MnQ。在某些实施方案中，R6和R7代表H。在某些实施方案中，M代表C(＝O)或CH2。在某些实施方案中，优选n为1，而在其它实施方案中，n可以为0。在某些实施方案中，优选J为C(＝O)，K为OR’或N(R’)SO2R”。在某些实施方案中，N(R’)SO2R”为NHSO2R”。
在某些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂芳环。在某些实施方案中，Q代表取代或未取代的杂芳环，例如含至少两个氮原子的5元或6元环。在某些实施方案中，Q可以为取代或未取代的四唑或二唑。在某些实施方案中，Q可以为取代或未取代的吡啶、哌啶或哌嗪。
在某些实施方案中，Q代表仲氨基取代基。在某些此类实施方案中，仲氨基取代基上的取代基选自烷基、烷氧基烷基、羟基烷基和羟基烷氧基烷基。
在式II的某些实施方案中，W代表C(＝O)、SO2或C(＝S)，R6和R7代表H，R5代表MnQ，其中n代表0，Q代表取代或未取代的含氮杂芳环。在某些实施方案中，W代表CH2，R6和R7代表H，R5代表MnQ，其中n代表0，Q代表取代或未取代的含氮杂芳环。
在某些实施方案中，W代表S、O或NR”，R6和R7代表H，R5代表MnJK，其中n为1-3的整数，J为C(＝O)，K为OR’或N(R’)SO2R”。
在某些实施方案中，W代表S、O或NR”，R6和R7代表H，R5代表MnQ，其中n为1-3的整数，Q为取代或未取代的5元含氮杂环。在此类实施方案中，优选n为1。在某些实施方案中，Q含至少两个氮原子。
在某些实施方案中，W代表S、O或NR”，R6和R7代表H，R5代表MnQ，其中n代表1-3的整数，Q为取代或未取代的6元含氮杂环。在某些此类实施方案中，n为2，Mn代表CH2C(＝O)。
在某些实施方案中，W代表O、S或NR”，R6和R7代表H，R5代表MnQ，其中M为CH2，n为1-3的整数，Q为取代或未取代的含氮杂环。
在某些实施方案中，其中Q代表取代的含氮杂环，例如哌嗪、吗啉、哌啶、吡啶、噻唑、二唑、四唑、吡咯等，合适的取代基包括取代或未取代的烷基、氨基-烷基、烷氧基、芳烷基(例如苄基)、芳基(例如苯基)和杂芳基例如唑基、哌嗪基、吡啶基、吡咯基。在某些此类实施方案中，其中Q含不与M相连的氮，该氮例如被这样的取代基取代。
在某些实施方案中，本发明涉及具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 C1。
在某些实施方案中，本发明涉及具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 C5。
在式II的某些实施方案中，本发明提供具有式IIa结构的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体
其中W和Z独立代表O或NR”；每次出现时，R’独立代表H、低级烷基或金属抗衡离子，例如碱或碱土金属抗衡离子；每次出现时，R”独立代表H或低级烷基，优选H；R5代表H、P(＝O)(OR’)2或MnQ；R6代表H、OH或MnQ，优选条件是R5和R6中的一个且只有一个代表H；每次出现时，R7独立代表氢、卤素、低级烷基例如甲基、或低级烷氧基例如甲氧基；每次出现时，M独立代表取代或未取代的亚甲基(例如被低级烷基、氧代基、羟基等取代)、NR”、O、S、S(O)或S(O2)，优选CH2，或当与W或Q连接时，代表CH2、S(O2)、C(＝S)或C(＝O)；当存在于R5时，n代表1-5的整数，优选2-4，当存在于R6时，n代表1-3的整数；和Q代表含氮杂芳基环例如吡咯、唑、异唑、咪唑或吡唑、叔氨基取代基例如二烷基胺、或取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。
在某些实施方案中，Q代表叔氨基取代基例如二烷基胺。在某些实施方案中，Q代表取代或未取代的含氮杂环例如吗啉、哌啶、哌嗪或吡咯烷。在某些实施方案中，Q代表含氮杂芳环、叔氨基取代基、或取代或未取代的含氮杂环。
在某些实施方案中，具有式II结构的化合物不包括具有式IIa结构的化合物。
示例性式II和IIa化合物包括表B中所示那些化合物。
本发明还提供具有选自以下结构的化合物A3、A7至A29、A31、A33至A37、A40、A41、A44至A47、A49、A51、A56、A57、A65、A69至A82、C1、C2和C5，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在某些实施方案中，本发明提供具有结构A37的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的化合物A37代谢物的前药或药学上可接受的盐。一个优选的这种实施方案为化合物A68或C5的前药或药学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，本发明提供具有选自以下结构的化合物B1至B20、C1、C2和C5，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在一个优选的实施方案中，本发明提供具有B16或C5结构的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在另一个实施方案中，本发明提供具有B3结构的化合物，包括其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的化合物B16代谢物的前药或药学上可接受的盐。一个优选的这种实施方案为化合物B3的前药或药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本发明提供具有式V结构的化合物或其前药、异构体、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体 其中R8代表取代或未取代的杂环；和
Q代表取代或未取代的叔氨基取代基或含氮杂环。
在本发明的其它实施方案中，表C、D和E中所示化合物为示例性化合物，本发明包括其中描述化合物的异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。
在另一个实施方案中，本发明提供一种新的药用组合物，该组合物含药学上可接受的载体和治疗有效量的式I、II或IIa化合物或本文中公开的任何化合物例如C5，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在一个优选的实施方案中，这种药用组合物包含治疗有效量的选自以下的化合物A1至A82、B1至B20和C1至C5，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在另一个实施方案中，这种药用组合物包含治疗有效量的化合物A37或B16代谢物的前药或药学上可接受的盐，优选具有A68或C5结构的代谢物。
在一些实施方案中，本发明提供了一种或多种纯化或合成形式的本文所述化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供一种新的治疗癌症、或其它增殖性疾病或其它疾病包括下述任何疾病或病症的方法，该方法包括给予有需要这种治疗的宿主治疗有效量的式I、II或IIa化合物或本文中公开的任何化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在某些实施方案中，至少一种选自抗癌药物和抗增殖药物的化合物可与式I、II或IIa化合物或本文公开的任何化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体联合给药。在一个优选的实施方案中，此类治疗方法包括适当给予治疗有效量的选自以下的化合物A1至A82、B1至B20和C1至C5，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。本文中使用的术语联合给药包括这样的疗法其中两种治疗药物以单一制剂联合给药，例如以独立的制剂同时或不同时间给药，或作为治疗方案的一部分另外给予患者。
在另一个实施方案中，本发明提供一种配制药用组合物的方法，该组合物含治疗有效量的式I、II或IIa化合物或本文中公开的任何化合物，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体，和任选的药学上可接受的载体。在一个优选的实施方案中，这种药用组合物包含治疗有效量的选自以下的化合物A1至A82、B1至B20和C1至C5，或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体。在另一个实施方案中，这种药用组合物包含治疗有效量的化合物A37或B16代谢物的前药或药学上可接受的盐，优选具有A68或C5结构的代谢物。
在再一些实施方案中，本发明药用组合物用于治疗疾病，例如癌症和其它增殖性疾病或其它疾病包括下述任何疾病或病症。
在本发明的其中使用取代的基团的某些实施方案中，合适的取代基可包括例如卤素、羟基、羰基(例如酮、醛、羧基、酯、酰基)、硫代羰基(例如硫代酸酯、硫代乙酸酯、硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基(例如膦酸酯、次膦酸酯)、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、氨基-烷基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、醚、-CF3、烷基、烯基、炔基、环烷基、烷氧基、甲硅烷基、磺酰基(例如硫酸酯、磺酰氨基、氨磺酰基、磺酸酯)、杂环基、芳烷基(例如苄基)或芳族或杂芳族部分(例如苯基、唑基、哌嗪基、吡啶基、吡咯基)。此类取代基本身还可被取代或未被取代。
ii.定义本文中使用的以下术语和表达具有指定的含义。本发明化合物可含有不对称取代的碳原子，因此可分离为旋光形式或外消旋体。如何制备旋光体为本领域所熟知，例如通过拆分外消旋体或用旋光性原料合成。除了特别指出的特定立体化学或异构体性式外，将包括结构的所有手性、非对映体、外消旋体和所有几何异构体。所有用于制备本发明化合物的方法和其中制备的中间体视为本发明的一部分。
本发明将包括所有出现在本发明化合物上的原子同位素。同位素包括那些具有相同原子序数但不同质量数的原子。在一般的非限定性实例中，氢的同位素包括氚和氘。碳的同位素包括12C和14C。
术语“烷基”将包括具有明确数目碳原子的支链和直链饱和脂族烃基。烷基的实例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和仲戊基。此外，该术语包括未取代和取代的烷基，后者指烷基部分具有一个或多个被但不限于以下基团置换的氢取代基卤素、羟基、羰基、烷氧基、酯、醚、氰基、磷酰基、氨基、亚氨基、酰氨基、巯基、烷硫基、硫代酸酯、磺酰基、硝基、杂环基(heterocyclo)、芳基或杂芳基。本领域技术人员也将理解适当时，取代部分本身也可被取代。术语“低级烷基”指那些具有1至6个碳原子的烷基，优选1至4个碳原子，术语“低级烷氧基”指与氧原子连接的这类低级烷基。在某些实施方案中，优选烷基取代基为低级烷基取代基。
本文中使用的术语“卤代”或“卤素”指氟、氯、溴和碘。
术语“芳基”将表示芳族部分例如但不限于苯基、茚满基或萘基。
术语“环烷基”和“双环烷基”将表示任何稳定的环系统，它可以饱和或部分不饱和。这种基团的实例包括但不限于环丙基、环戊基、环己基、降冰片烷基、双环[22]壬烷、金刚烷基或四氢萘基(1，2，3，4-四氢化萘)。
本文中使用的“碳环”或“碳环基”将表示任何稳定的3元至7元单环或双环、或7元至13元双环或三环，其中任何环可以为饱和、部分不饱和或芳族。此类碳环的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、金刚烷基、环辛基、[3.0]双环辛烷、[4.0]双环壬烷、[4.0]双环癸烷(萘烷)、[2.2]双环辛烷、芴基、苯基、萘基、茚满基、金刚烷基或四氢萘基(1，2，3，4-四氢化萘)。
本文中使用的术语“杂环”或“杂环系统”将表示饱和、部分不饱和或不饱和的稳定5元至7元单环或双环、或7元至10元双环杂环(芳族/杂芳基)，它由碳原子和1至4个独立选自N、O和S的杂原子组成并包括任何双环基团，其中以上定义的任何杂环与苯环稠合。氮和硫杂原子可任选被氧化。杂环可于任何杂原子或碳原子与其侧基连接形成稳定结构。如果生成的化合物稳定，本文中所述杂环可在碳或氮原子上取代。如果特指的话，杂环上的氮可任选被季铵化。在某些实施方案中，当杂环的S和O原子总数超过1时，则这些杂原子无须彼此相邻。优选杂环上的S原子总数不大于1。本文中使用的术语“芳杂环系统”将表示稳定的5元至7元单环或双环、或7元至10元双环杂环芳环，它由碳原子和1至4个独立选自N、O和S的杂原子组成。优选芳杂环上的S和O原子总数不大于1。杂环的实例包括但不限于1H-吲唑、2-吡咯烷酮基、2H16H二噻嗪基、2H-吡咯基、3H-吲哚基、4-哌啶酮基、4aH-咔唑、4H-喹嗪基、6H-1，2，5-噻二嗪基、吖啶基、吖辛因基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothiofuranyl)、苯并噻吩基(benzothiophenyl)、苯并唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉酮基(benzimidazalonyl)、咔唑基、4aH-咔唑基、P-咔啉基、苯并二氢吡喃基、苯并吡喃基、肉啉基、十氢喹啉基、2H，6H二噻嗪基、二氢呋喃并[2，3-b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚啉基(indolenyl)、二氢吲哚基、中氮茚基、吲哚基、异苯并呋喃基(isobenzofuranyl)、异苯并二氢吡喃基、异吲唑基、异二氢吲哚基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异唑基、吗啉基、1，5-二氮杂萘基、八氢异喹啉基、二唑基、1，2，3-二唑基、1，2，4-二唑基、1，2，5-二唑基、1，3，4-二唑基、唑烷基、唑基、唑烷基嘧啶基(perimidinyl)、菲啶基、菲咯啉基、吩砒嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、苯氧硫杂环己二烯基(phenoxathiinyl)、吩嗪基、2，3-二氮杂萘基、哌嗪基、哌啶基、蝶啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基(pyridinyl)、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹喔啉基、奎宁环基、咔啉基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、6H-1，2，5-噻二嗪基、1，2，3-噻二唑基、1，2，4-噻二唑基、1，2，5-噻二唑基、1，3，4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并唑基、噻吩并咪唑基、噻吩基(thiophenyl)、三嗪基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，2，5-三唑基、1，3，4-三唑基、呫吨基。优选的杂环包括但不限于吡啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、吲哚基、苯并咪唑基、1H-吲唑基、唑烷基、苯并三唑基、苯并异唑基、羟吲哚基、苯并唑啉基或靛红酰基(isatinoyl)。还包括含例如以上杂环的稠环和螺环化合物。
本文中的“药学上可接受的盐”指本文公开化合物的衍生物，其中通过制备其酸或碱盐修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基例如胺的矿物或有机酸盐；酸性残基例如羧酸的碱盐或有机盐；等。药学上可接受的盐包括例如用无毒无机或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。
例如，此类常规无毒盐包括从无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等衍生的那些盐；和用例如以下有机酸制备的盐乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、双羟萘酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酸基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。
本发明药学上可接受的盐可通过常规化学方法，用含碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，此类盐可通过使这些化合物的游离酸或碱形式在水或有机溶剂中，或在两者的混合物中与化学计算量的适当碱或酸反应制备；通常，优选非水介质如醚、EtOAc、乙醇、异丙醇或乙腈。合适盐列于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990，第1445页，其内容通过引用结合到本文中。
本文中使用的短语“药学上可接受的”指在合理的医学判断范围内，那些适用于与人和动物组织接触而无过多毒性、刺激性、变应性反应或其它问题或并发症的、与合理效益/风险比率相称的化合物、物质、组合物和/或剂型。
本文中使用的术语“前药”将包括当这种前药给予哺乳动物患者时，在体内释放本发明活性母体药物的任何共价键合的载体。因为已知前药可增加药物许多需要的性质(即溶解度、生物利用度、可制备性等)，因此本发明化合物可以前药的形式释药。因此，本发明将包括要求保护的化合物的前药、释放这类前药的方法和含这类前药的组合物。通过修饰化合物中的官能团来制备本发明的前药，用常规操作或体内将该修饰物解离为母体化合物。前药包括本发明化合物，其中羟基、氨基或巯基分别与当本发明前药给予哺乳动物患者时，其解离形成游离羟基、游离氨基或游离巯基的任何基团键合。前药的实例包括但不限于本发明化合物中醇和胺官能团的乙酸酯(盐)、甲酸酯(盐)和苯甲酸酯(盐)衍生物。
术语“纯的”或“纯化的”是指分子中基本上不存在其它有机分子，尤其是杂质例如副产物或降解产物。在一些实施方案中，“纯的”或“纯化的”化合物是组成中具有至少80％重量，更优选95-99％重量，最优选至少99.8％重量的有机化合物(例如排除可存在于化合物的药物制剂中的水、缓冲剂、赋形剂等分子)。
“取代的”将表示在使用表达“取代的”的原子上的一个或多个氢被选择的指定基团置换，条件是所指定原子的正常价没有超出，且该取代导致稳定的化合物。当取代基为酮或氧代(即＝O)基团时，则该原子上的2个氢被置换。在芳族部分不存在酮/氧代取代基。示例性取代基包括例如烷基、全氟烷基(例如三氟甲基)、卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫代酸酯、硫代乙酸酯或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰氨基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰氨基、磺酰基、碳环基、杂环基、芳烷基、杂芳烷基或芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将理解，如果适当的话，取代基例如杂环基、芳基、烷基等本身可被取代。
本发明化合物的术语“治疗有效量”表示有效抑制一类称为依赖细胞周期蛋白的激酶的酶的量，或治疗宿主的癌症或其它增殖性疾病或其它疾病症状的量。
本文中使用的术语“抗癌”或“抗增殖”药物包括但不限于六甲蜜胺、白消安、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、氮芥、美法仑、塞替哌、克拉屈滨、氟尿嘧啶、氟尿苷、吉西他滨、硫鸟嘌呤、喷司他丁、甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、阿糖胞苷、卡莫司汀、洛莫司汀、链佐星、卡铂、顺铂、奥沙利铂、异丙铂、四铂、洛铂、JM216、JM335、氟达拉滨、氨鲁米特、氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、醋酸甲地孕酮、醋酸环丙孕酮、他莫昔芬、阿那曲唑、比卡鲁胺、地塞米松、己烯雌酚、泼尼松、博来霉素、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、伊达比星、米托蒽醌、洛索蒽醌、丝裂霉素-c、普卡霉素、紫杉醇、多西他赛、托泊替康、伊立替康、9-氨基喜树碱(camptothecan)、9-硝基喜树碱、GS-211、JM 118、依托泊苷、替尼泊苷、长春碱、长春新碱、长春瑞滨、丙卡巴肼、天冬酰胺酶、培门冬酶、奥曲肽、雌莫司汀和羟基脲。
iii.剂量和制剂可通过给予本发明依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂，产生使活性药物与哺乳动物体内药物作用部位接触的任何方法治疗癌症或增殖性疾病或其它疾病。可通过任何已有的与药物联合使用的常规方法，以单独治疗药物或以各治疗药物联合的方式给予它们。本文中所述抑制剂的化学特性赋予化合物良好的溶解特性，使它们适用于以静脉制剂、局部制剂、口服制剂以及以下更详细论述的其它制剂给药。它们可以单独给药，但优选以选择给药途径和标准药学实践为基础，与选择的药用载体一起给药。在例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(Remington′s Pharmaceutical Sciences.Mack Publishing Company，Easton，Pa.，USA 1985)书中论述了合适的载体(vehicle)和它们的制剂。
在另一方面，本发明提供药学上可接受的组合物，该组合物含治疗有效量的一种或多种本发明化合物例如上述化合物和一起配制的一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)和/或稀释剂。如以下详细描述，本发明药用组合物尤其可配制成固体或液体给药形式，包括适合以下给药途径的那些形式(1)口服给药，例如顿服剂(drenches)(水或非水溶液或混悬液)、片剂、一次性大剂量注射液(boluses)、散剂、颗粒剂、舌用糊剂；(2)肠胃外给药，例如通过皮下、肌内或静脉内注射，例如无菌溶液或混悬液；(3)局部使用，例如用于皮肤的霜剂、软膏剂或喷雾剂；或(4)阴道内或直肠内，例如阴道栓剂、霜剂或发泡剂。在某些实施方案中，药用制剂可以为非热原性的，即不升高患者体温。
湿润剂、乳化剂和润滑剂，例如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣材料、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可加入组合物。
药学上可接受的抗氧化剂的实例包括(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，例如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨醇、酒石酸、磷酸等。
给药剂量自然随以下已知因素而变例如具体药物的药效学特性、其给药的模式和途径；用药者的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；协同治疗的种类；治疗的频率；和需要的效果。预期活性成分的日剂量可为约0.001至约1000毫克/千克体重，优选的剂量为约0.1至约30mg/kg。
适用于给药的组合物剂型每单位含约1mg至约100mg活性成分。在这些药用组合物中，活性成分一般按组合物总重计占约0.95％(重量)。活性成分可以固体剂型例如胶囊剂、片剂和散剂，或以液体剂型例如酏剂、糖浆和混悬剂经口给药。它也可以无菌液体剂型经肠胃外给药。
本发明制剂包括适合经口、鼻、局部(包括口颊和舌下)、直肠、阴道和/或肠胃外给药的那些制剂。可便利地提供这些制剂的单位剂型，并可通过药剂学领域任何熟知的方法制备。可与载体物质组合制备单一剂型的活性成分的量随治疗的宿主、具体的给药模式而变。可与载体物质组合制备单一剂型的活性成分的量一般为达到疗效的抑制剂的量。通常按100％计，该活性成分的量为约1％至约99％，优选约5％至约70％，最优选约10％至约30％。
制备这些制剂或组合物的方法包括将本发明化合物与载体和任选一种或多种助剂混合的步骤。一般而言，此类制剂通过将本发明抑制剂与液体载体或粉碎的固体载体或两者均匀并充分混合，然后如需要使产品成形而制备。
适合经口给药的本发明制剂可以是以下形式胶囊剂、扁囊剂、丸剂、片剂、锭剂(使用矫味基质，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芪胶)、散剂、颗粒剂或水或非水液体的溶液剂或混悬剂，或水包油或油包水液体乳剂，或酏剂或糖浆剂，或软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或漱口剂等，各自含预定量的本发明化合物作为活性成分。本发明抑制剂也可以一次性大剂量浓注射剂(bolus)、干药糖剂或贴剂给药。
在用于经口给药的本发明固体剂型(胶囊剂、片剂、丸剂、糖锭剂、散剂、颗粒剂等)中，活性成分与一种或多种药学上可接受的载体例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或以下任何载体混合(1)填充剂或补充剂例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合剂例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；(3)保湿剂，例如甘油；(4)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；(5)溶液阻滞剂例如石蜡；(6)吸收促进剂例如季铵化合物；(7)润湿剂例如鲸蜡醇和甘油单硬脂酸酯；(8)吸收剂例如高岭土和皂土粘土；(9)润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠及其混合物；和(10)着色剂。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况中，这类药用组合物还可包含缓冲剂。使用此类赋形剂如乳糖以及高分子量聚乙二醇等的同类固体组合物还可用作填充软和硬明胶胶囊的填充剂。
片剂可通过任选与一种或多种助剂一起压制或模制。压制片可用粘合剂(例如明胶或羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如淀粉羟乙酸钠或交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂制备。模制片可通过在合适的机器中模制经惰性液体稀释剂润湿的抑制剂粉末混合物而制备。
可任选将本发明片剂和其它药用组合物的固体剂型例如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂刻痕或用包衣材料和壳例如肠溶包衣材料和药物制剂领域熟知的其它包衣材料制备。它们可以是使用例如提供需要释放曲线的各种比例的羟丙基甲基纤维素、其它聚合物骨架材料、脂质体和/或微球体，来提供缓慢或控制释放其中活性成分的剂型。它们可通过例如经截留细菌的滤器过滤，或通过将消毒剂加入无菌固体组合物中灭菌，可将该无菌固体组合物在临用前溶于无菌水或某些其它无菌注射用介质。这些组合物也可任选含不透明剂，并可为它们只在或优先在胃肠道的某些部分任选以延滞方式释放活性成分的组合物。可使用的植入组合物实例包括高分子物质和蜡。如果合适，活性成分还可以和一种或多种上述赋形剂一起为微囊形式。
经口给药的本发明化合物的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳、溶液、混悬液、糖浆和酏剂。除活性成分之外，液体剂型可含本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄基酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油(尤其是棉子油、花生油、玉米油、胚芽(germ)油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇、脱水山梨醇的脂肪酸酯及其混合物。
除惰性稀释剂之外，口服组合物还可包括助剂例如湿润剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除本发明活性抑制剂外，混悬液可含有悬浮剂例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、皂土、琼脂、黄芪胶及其混合物。
可提供用于直肠或阴道给药的本发明药用组合物的栓剂制剂，该剂型可通过将一种或多种本发明化合物与一种或多种合适的无刺激性赋形剂或载体包括例如可可脂、聚乙二醇、栓剂蜡或水杨酸盐(酯)混合制备，它在室温下是固体，但体温下是液体，因此在直肠或阴道腔熔化释放活性抑制剂。
适用于阴道给药的本发明制剂包括含本领域中已知合适载体的阴道栓剂、棉塞、霜剂、凝胶剂、糊剂、发泡剂或喷雾剂制剂。
用于局部或透皮给予本发明化合物的剂型包括散剂、喷雾剂、软膏剂、糊剂、霜剂、洗剂、凝胶剂、溶液剂、贴剂和吸入剂。在无菌条件下，可将活性化合物与药学上可接受的载体和可能需要的任何防腐剂、缓冲剂或推进剂混合。
除活性异戊烯基转移酶抑制剂外，软膏、糊剂、霜剂和凝胶剂可含有赋形剂，例如动物和植物脂肪、油、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、皂土、硅酸、滑石粉和氧化锌或其混合物。
除本发明化合物外，散剂和喷雾剂可含有赋形剂例如乳糖、滑石粉、硅酸、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这些物质的混合物。喷雾剂还可含有常用推进剂，例如含氯氟烃和挥发性的未取代烃例如丁烷和丙烷。
透皮贴剂还具有提供控制本发明化合物向体内释放的优点。可通过将本发明抑制剂溶于或分散于适当的介质中制备此类剂型。还可用吸收促进剂增加透过皮肤的药物流量。可通过提供速率控制膜，或将本发明化合物分散在聚合物骨架或凝胶中来控制这种流量的速度。
眼用制剂、眼软膏剂、散剂、溶液剂等也包括在本发明的范围内。
适用于肠胃外给药的本发明药用组合物包含一种或多种本发明抑制剂和组合应用的一种或多种药学上可接受的无菌等渗水或非水溶液、分散体、混悬液或乳液，或在临用前可重新组成为无菌注射溶液或分散体的无菌粉末，该组合物可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂、使制剂与预定接受者的血液等渗的溶质、或悬浮剂或增稠剂。
可用于本发明药用组合物的合适水和非水载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油、注射用有机酯例如油酸乙酯。例如通过使用包衣材料例如卵磷脂、通过维持分散体中必需粒径和通过使用表面活性剂可保持适当的流动性，这些组合物还可含有助剂例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。可加入各种抗菌剂和抗真菌剂例如尼泊金酯、三氯叔丁醇、苯酚山梨酸等确保防止微生物作用。可能还需要将等渗剂例如糖、氯化钠等包括在组合物中。此外，可通过加入延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶使注射药物形式的吸收延长。
在某些情况中，为延长抑制剂的疗效，需要减缓皮下或肌内注射抑制剂的吸收。这可通过使用具有较差水溶性的结晶或无定形物质的液体混悬液实现。因而，抑制剂的吸收速度取决于其溶解速度，而溶解速度又取决于结晶大小和结晶形式。或者，通过将抑制剂溶于或悬浮于油载体中实现使肠胃外给药的抑制剂形式延迟吸收。
通过在可生物降解的聚合物例如在聚交酯-聚乙醇酸交酯中形成主题抑制剂的微囊包封骨架来制备注射用长效制剂形式。根据药物与聚合物的比例和具体使用聚合物的性质，可控制药物释放的速度。其它可生物降解聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酐)。还可通过在脂质体或与身体组织相容的微乳中捕集药物来制备长效注射制剂。
当本发明化合物作为药物给予人和动物时，可单独给予它们，或作为含例如0.1-99.5％(更优选0.5-90％)活性成分和组合使用的药学上可接受载体的药用组合物给予它们。
本发明制剂可经口、肠胃外、局部或直肠给予。它们自然要通过适用于每种给药途径的形式给予。例如，它们以片剂或胶囊剂的形式给予；通过注射剂、吸入剂、眼洗剂、软膏剂、栓剂等给予；通过注射、输注或吸入给予；通过洗剂或软膏剂局部给予；和通过栓剂通过直肠给予。优选经口给药。
本文中使用的短语“肠胃外给药”和“肠胃外给予”表示非肠内给药和局部给药的模式，通常通过注射，非限定性包括静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。
本文中使用的短语“全身给药”、“全身给予”、“外周给药”和“外周给予”表示给予不直接进入中枢神经系统的化合物、药物或其它物质，例如皮下给药，以便它进入患者全身，因而经历代谢和其它类似过程。
不管选择的给药途径，本主题方法中使用的CDK抑制剂可按合适的水合形式使用，和/或本发明药用组合物可通过本领域技术人员已知的常规方法将其配制成药学上可接受的剂型。
明胶胶囊剂含活性成分和载体粉末例如乳糖、淀粉、纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸等。可用类似稀释剂制备压制片。可将片剂和胶囊剂制成在数小时内提供连续释放药物的缓释产品。可以给压制片包糖衣或薄膜衣以掩盖任何不愉快的味道和使片剂与空气隔绝，或包肠衣以便片剂在胃肠道中选择性崩解。也可以将类似固体组合物用作填充软和硬明胶胶囊的填充剂；在这种关系中，优选的物质还包括乳糖和高分子量聚乙二醇。优选的制剂是油例如橄榄油、Miglyol或Capmul溶液或混悬液的软明胶胶囊剂。可适当加入抗氧化剂以防止长期降解。
经口给药的液体剂型可含有着色剂和矫味剂以增加患者的依从性。一般而言，水、合适的油、盐水、乙醇、葡萄糖水溶液和有关的糖溶液、二元醇例如丙二醇或聚乙二醇或这些物质的混合物是肠胃外用溶液的合适载体。
可将以上公开化合物用生理缓冲液或灭菌水配制成其游离形式活性成分或其盐的无菌溶液以用于静脉内给药。如需要可使用含糖载体液体(例如林格氏乳酸盐或其它葡萄糖溶液)，条件是总含糖量不引起不需要的乳酸酸中毒水平。静脉内给药可通过一次性大剂量浓注(优选每日几次)或通过在持续的时间内连续输注进行。优选的一次性大剂量浓注或输注的总剂量基本上根据患者的身体条件而变化；一般而言，它们通常为约25mg/kg至约250mg/kg。
优选肠胃外给药的溶液含活性成分的水溶性盐、合适的稳定剂以及酌情含缓冲物质。单独或组合应用的抗氧化剂例如亚硫酸氢钠、亚硫酸钠或抗坏血酸是合适的稳定剂。还使用柠檬酸及其盐以及EDTA钠。此外，肠胃外用溶液可含有防腐剂，例如苯扎氯铵、尼泊金甲酯或尼泊金丙酯、三氯叔丁醇。在本领域标准参考教材Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Easton，PA，1990中有对合适药用载体的描述，其内容通过引用结合至本文中。
使用表A、B和/或C的化合物的制剂、溶液以及其它制剂可按照PCT申请WO 03/033499和/或WO 04/092139中描述的方法制得，其中的教导引入本文以供参考。
iv.治疗应用由于cdks一般在调节细胞增殖中起关键作用，本文中公开的化合物可用作可逆细胞抑制剂，可用于治疗特征为异常细胞增殖的任何疾病过程例如过度增殖性疾病，包括癌症、良性前列腺增生、家族腺瘤病性息肉病、神经纤维瘤病、银屑病、真菌感染、内毒素性修克、肥大性疤痕形成、炎性肠病、移植排斥、与动脉粥样硬化有关的血管平滑肌细胞增殖、银屑病、肺纤维化、关节炎、肾小球肾炎、血管成形术或血管手术后再狭窄和其它手术后狭窄及再狭窄。见例如美国专利号6,114,365和6,107,305。
预期本文中公开的化合物可有效治疗增殖性或过度增殖性疾病例如癌症、自身免疫性疾病、病毒性疾病、真菌疾病、神经变性疾病和心血管疾病。
更具体地讲，本文中公开的化合物可有效治疗各种癌症包括(但不限于)以下癌症癌，包括膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肾癌、肝癌、包括小细胞肺癌的肺癌、食道癌、胆囊癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、宫颈癌、甲状腺癌、前列腺癌和包括鳞状上皮细胞癌的皮肤癌；造血系统淋巴性肿瘤，包括白血病、急性淋巴细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、毛状细胞淋巴瘤和Burkett氏淋巴瘤；造血系统骨髓性肿瘤，包括急性和慢性骨髓性白血病、骨髓增生异常综合征和前髓细胞性白血病；源自间质的肿瘤，包括纤维肉瘤和横纹肌肉瘤；中枢和外周神经系统肿瘤，包括星形细胞瘤、成神经细胞瘤、神经胶质瘤和神经鞘瘤；和其它肿瘤，包括黑色素瘤、精原细胞瘤、畸胎癌、骨肉瘤、xenoderoma pigmentosum、keratoctanthoma、甲状腺滤泡性癌和卡波西肉瘤。
由于新近发现cdk5参与τ蛋白磷酸化(J.Biochem，117，741-749(1995))，提示本文中公开的化合物还可有效治疗早老性痴呆。
本文中公开的化合物可诱导或抑制细胞凋亡。在多种人疾病中，细胞凋亡应答异常。作为细胞凋亡调节剂的本文所述化合物可有效治疗癌症(包括但不限于上述那些种类)、病毒感染(包括但不限于疱疹病毒、痘病毒、埃-巴二氏(Epstein-Barr)病毒、辛培斯(Sindbis)病毒和腺病毒)、预防AIDS在感染HIV个体中发展、自身免疫性疾病(包括但不限于全身性红斑狼疮、自身免疫介导的肾小球肾炎、类风湿性关节炎、银屑病、炎性肠病和自身免疫性糖尿病)、神经变性疾病(包括但不限于早老性痴呆、与AIDS有关的痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、色素性视网膜炎、脊髓性肌萎缩和小脑变性)、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血、与心肌梗塞有关的缺血性损伤、中风和再灌注损伤、心律失常、动脉粥样硬化、毒素引发或酒精相关性肝病、血液病(包括但不限于慢性贫血和再生障碍性贫血)、骨骼系统变性疾病(包括但不限于骨质疏松症和关节炎)阿司匹林过敏性鼻窦炎、囊性纤维化、多发性硬化、肾病和癌性痛。
作为cdks抑制剂的本文中公开的化合物可调节细胞RNA和DNA合成的水平。因此，这些药物可有效治疗病毒感染(包括但不限于HIV、人乳头状瘤病毒、疱疹病毒、痘病毒、埃-巴二氏病毒、Sindbis病毒和腺病毒)。
本文中公开的化合物还可有效化学预防癌症。化学预防定义为通过阻断引发致突变事件，或通过阻断已受到损害的恶化前细胞发展或抑制肿瘤复发来抑制侵袭性癌症发展。
本文中公开的化合物还可有效抑制肿瘤血管生成和转移。
本文中公开的化合物还可用于预防通常伴随许多传统化学疗法方案出现的脱发。例如，本发明CDK抑制剂可用于抑制毛囊中的细胞增殖，因此，使它们免受以增殖细胞为目标的细胞毒药物的攻击。
本文中公开的化合物还可用作以下其它蛋白激酶的抑制剂例如蛋白激酶C、her2、raf1、MEK1、MAP激酶、EGF受体、PDGF受体、IGF受体、PI3激酶、Wee l激酶、Src、Abl，因此可有效治疗与其它蛋白激酶有关的疾病。
本发明化合物也可与已知抗癌治疗例如放射疗法或与以下细胞抑制剂或细胞毒药物联合使用(同时或序贯给予)例如但不限于DNA作用药物例如顺铂或多柔比星；拓扑异构酶II抑制剂例如依托泊苷；拓扑异构酶I抑制剂例如CPT-11或托泊替康；微管蛋白作用药物例如紫杉醇、多西他赛或epothilones；激素药物例如他莫昔芬；胸苷酸合成酶抑制剂例如5-氟尿嘧啶；和抗代谢药例如甲氨蝶呤。在此类联合药物中，本发明的化合物和制剂可有效预防或减少脱发发生率，它通常是由放射疗法或化学疗法引起。
如果配成固定剂量，此类组合产品在下述剂量范围内使用本发明化合物和其它活性药物或在其批准的剂量范围内治疗。例如，发现cdc2抑制剂olomucine协同已知的细胞毒药物诱导细胞凋亡(J.Cell Sci.，108，2897(1995))。当组合制剂不合适时，还可序贯给予本文中所述化合物和已知抗癌药物或细胞毒药物。本发明不受给药顺序的限定；可在给予已知抗癌药物或细胞毒药物之前或之后给予本文中所述化合物。例如，依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂flavopiridol的细胞毒活性受与抗癌药物的给药顺序影响。Cancer Research，57，3375(1997)。
本文描述的所有实施方案适用于本发明的所有不同方面。在适当时，任何所描述的实施方案可以与一种或多种其它这样的实施方案自由地合并。本发明化合物的各个实施方案、适于用这样的化合物治疗的病症的各个实施方案以及使用本发明化合物的治疗方法的各个实施方案可以自由地彼此合并。
本文中更详细地描述了本发明的具体实施方案。然而，这些是举例说明性的实施方案，并且应当不解释为在任何方面的限制。
等同方案本领域技术人员应当认识到或者能够仅使用常规实验来确定本文所述的本发明具体实施方案的很多等同方案。这样的等同方案包括在权利要求书的范围内。本领域技术人员还应当认识到，本文所述权利要求的实施方案或特征的所有组合都在本发明范围内。
v.合成可用下述方法和合成有机化学领域的已知合成方法，或本领域技术人员认识到的其衍生方法合成本发明化合物。优选的方法包括但不限于下述那些方法。下文引用的各参考文献通过引用结合到本文中。
制备本文中公开的一些化合物的关键中间体是吡唑氨基腈、氨基羧酰胺和氨基酯。这些中间体的制备方法已在化学文献中发表，在流程A(A.O.Abdelhamid等，J.Heterocycl.Chem.1984，21，1049)、B(C.C.Cheng和R.K.Robins，J.Org.Chem.1956，21，1240)、C(P.Schmidt和J.Druey，Helv.Chem.Acta 1956，39，986)中概述了几种方法。还可参阅Tominaga等，J.Heterocycl.Chem.1990，27，775和PCT申请号WO 00/21926和WO 99/54308。多种肼和醛原料有市售，或可通过标准有机转化方法制备。以下使用的取代基Ar表示芳环，被取代形成(conform)或转化为本文公开的一些化合物的相应的芳基取代基。也可通过在碱的存在下，用CH2(CN)2处理PrCOCl，用PCl5处理生成的化合物，然后使产物与ArNHNH2反应来制备一些化合物。
流程A
流程B 流程C 如流程D中所示，可将氨基腈II转化为本发明吡唑并[3，4-d]嘧啶。总之，任选在合适的溶剂例如二氯甲烷存在下，通过用合适的碱例如三乙胺处理将氨基羧酰胺酰化，随后用式ArCH2COX酰卤优选酰氯处理，得到羧酰氨基腈V。或者，通过在合适的碱和偶合试剂存在下，在合适的溶剂中，使氨基腈II与通式ArCH2CO2H的羧酸偶合可制备羧酰氨基腈V。已经对胺和羧酸的偶合作了综述(Klausnew和Bodansky，Synthesis 1972，453-463)，本领域技术人员可认识到有多种实现该偶合的试剂。
流程D 可通过在约0℃至最高达100℃，在合适的碱优选金属氢氧化物或醇化物碱存在下，在溶剂优选水、醇或水-醇混合物中，用过量过氧化氢处理，可完成将羧酰氨基腈V至本发明化合物的转化。
或者，可通过在浓、强酸优选85％H3PO4中，加热优选约1小时，将羧酰氨基腈V转化为本发明化合物。流程E表示制备本发明化合物的另一种方法。在合适的溶剂优选低级链烷醇中，优选在溶剂的沸点下，用过量的其中R为例如低级烷基的式ArCH2CO2R的酯和过量的碱优选金属低级醇化物处理氨基酰亚胺III，得到本发明化合物。许多芳基乙酸酯有市售，或可通过在酸催化剂例如H2SO4或p-TsOH存在下，回流下用过量的醇ROH，优选用乙醇或甲醇作溶剂使市售芳基乙酸酯化一步制备。或者，优选在溶剂例如CH2Cl2中并采用催化剂例如DMAP，可使用偶合试例如DCC。
流程E 苯乙酸可通过酸或碱水解芳基乙腈制备，而芳基乙腈可通过优选在溶剂例如DMF、MeOH、EtOH、水、DMSO或其混合物中，用CN-处理芳基卤化物制备。芳基乙酸酯的更多实例可在Arndt-Eistert(Meier和Zeller，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1975，14，32)或有关同系化反应条件下用芳基羧酸制备。
可通过与过量的式ArCH2CN腈和钠反应，将式IV氨基酯转化为本发明化合物。
流程F 优选该反应无溶剂(neat)加热进行。
吡唑并[3，4-d]嘧啶酮还可按下述方法进一步制备，得到本发明其它化合物。可在Ar基团上进行亲电芳族取代反应，引入取代基。这类反应包括但不限于硝化、酰化(Friedel-Crafts)、卤代、烷基化(Friedel-Crafts)、氯甲基化、磺化和氨甲基化(Mannich反应)。有机合成领域的技术人员熟悉进行这些反应的条件，通常涉及在催化剂的存在下，用芳基或杂芳基底物进行亲电反应。在硝化或Mannich反应的情况中，优选催化剂为可作为溶剂的质子酸，其中亲电体分别由硝石或胺和羰基组分原位生成。对于其它亲电芳族取代反应，优选的催化剂为Lewis酸，包括但不限于FeX3、AlX3和ZnX2，其中X为卤素。
可通过与亲电体包括但不限于酰卤、酸酐、异氰酸酯、氯甲酸酯、磺酰卤、烷基卤、内酯或酯反应，将以上制备的具有氨基的化合物衍生化。有机合成领域的技术人员熟悉这些加成反应的操作条件，通常涉及优选在溶液中，0℃至室温下，将亲电体加成到亲核试剂上。可能需要加入碱。应该指出，这些反应的产物还可在嘧啶酮的氮(N5)上与某些亲电体反应。与需要的苯胺基或脂族基团相比，所得官能团(酰胺、氨基甲酸酯等)对碱性水解的稳定性较差，可被解离恢复为N5上具有H的嘧啶酮。
使具有胺基的化合物与试剂例如卤代酰卤、α，β-不饱和酰卤，或卤代磺酰卤反应，得到中间体，该中间体可与亲核试剂例如伯或仲胺、二胺、醇盐、氨基醇或硫醇反应。
可通过活化和与亲核试剂包括但不限于胺和醇反应，分别得到酰胺和酯，将以上制备的具有羧基的化合物衍生化。已经对胺和羧酸与碳二亚胺的偶合反应作了综述(Klausnew和Bodansky，Synthesis1972，453-463)，本领域技术人员可认识到实现该反应可有多种其它试剂和可能对掩蔽活性官能团的保护基团有需要(Green and Wuts，″Protective Groups in Organic Synthesis″第二版，John Wiley &Sons，1991)。上述为用酸制备酯的描述。可用合适的氢化物还原剂将这些酰胺和酯还原为胺和醇。
可优选在碱的存在下，通过用光气或光气等同物活化，转化为亲电性物质(TetrahedronAsymmetry 1995，61，745；J.Org.Chem.1994，59，1937)，然后与亲核试剂包括但不限于胺、醇和磺酰胺反应，分别得到脲、氨基甲酸酯和磺酰脲，将以上制备的具有氨基的化合物衍生化。有机合成领域的技术人员熟悉这些反应的操作条件和与处理光气和光气等同物有关的危险，因此应采取所有适当的防护措施。
制备本发明化合物可能需要的其它转化包括还原酮、醛、酯、酸、酰胺或使用铝和氢硼化物试剂的还原氨基化(J.Seyden-Penne，“Reductions by the Alumino and Borohydrides in OrganicSynthesis”VCH Publishers，Inc.，1991)和氧化以下基团，包括但不限于醇、醛、烯、硫醚、亚砜和杂芳基(Milos Hudlicky，″Oxidationsin Organic Chemistry″American Chemical Society，1990)。
可通过催化氢化或通过溶解金属还原完成还原官能团例如烯、炔、氮、硝基或氰基。可通过用亲核试剂包括但不限于CN-、胺、醇盐、硫醇或负碳离子置换，完成进一步制备含与本发明化合物亲电结合部位的中间体。本发明其它化合物还可通过用合适的硼酸或锡烷偶合芳基卤或三氟甲磺酸酯制备(Stille，J.K.，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1986，25，508；Suzuki，A.Pure Appl.Chem.1985，57，1749)。通过与亲核试剂反应，得到仲醇，可将以上制备的具有羰基的化合物进一步衍生化。此类亲核试剂包括但不限于格氏试剂(Grignardreagent)、烷基锂、烯基锂和炔基锂试剂，以及烯丙基锡烷、硅烷等。还可通过重排例如Beckmann(Gawley，Org.React.1988，35，1)或其它重排进一步制备按上述制备的化合物。
以上制备的化合物还可通过直接金属化制备有机镁或有机锂物质完成制备(Beak和Meyers，Acc.Chem.Res.1986，19，356-363；Beak和Snieckus，Acc.Chem.Res.1982，15，306-312；Katritzky，Lam和Sengupta，Prog Heterocycl.Chem.1989，11，1-29)或通过锂-卤素交换用芳基卤完成制备(Parham和Bradsher，Acc.Chem.Res.1982，15，300-305)。
在流程1中提供制备本文中公开的式II、IIa化合物和某些其它化合物的方法，并可用于制备本发明化合物。取代基Z、R5、R6和R7代表式II中描述的取代基，或代表用标准有机转化方法可转化为那些取代基的取代基。P代表合适的保护基团。保护基团的实例包括羧酸酯、醇的甲硅烷基醚、醛的缩醛和酮的缩酮。已有对保护基团化学领域的综述(Greene，T.W.；Wuts，P.G.M.Protective Groups in OrganicSynthesis，第2版；WileyNew York，1991)。用催化氢化将硝基邻苯二甲酸二甲酯的硝基还原为胺。用乙酸酐和吡啶碱将该苯胺酰化。在提高温度下，合适的溶剂中，用强碱处理得到的乙酰胺2和苯乙酮的混合物，得到需要的三酮3。本领域技术人员已知如Kilgore等，Industrial and Engineering Chemistry 34494-497，1946中所述制备三酮的其它方法。在提高温度下，合适的溶剂中，用肼处理该三酮，得到茚并[1，2-c]吡唑啉酮环系统。
本领域技术人员已知如Lemke等，J.Heterocyclic Chem.191335-1340，1982；Mosher和Soeder，J.Heterocyclic Chem.8855-59，1971；Hrnciar和Svanygova，Collect.Czech.Chem.Commun.592734-40，1994中所述制备茚并[1，2-c]吡唑啉酮的其它方法。通过在合适的溶剂中，用强酸加热，使酰胺去酰基化，得到苯胺4。该苯胺在标准条件下、合适的溶剂中，用酰氯酰化，得到需要的产物5。
流程1 制备本发明化合物的另一种方法见流程2。用本领域技术人员已知的方法，可用强酸使三酮3中间体脱酰基化，再用合适的酰氯酰化。随后用前述流程1中相同条件，可将三酮6转化为茚并[1，2-c]吡唑啉酮环系统。
流程2 制备流程2中三酮6的另一种方法按Rotberg和Oshkaya，Zh.Organ.Khim.884-87，1972；Zh.Organ.Khim.92548 2550，1973中所述，用1，3-二酮6a与3-硝基邻苯二甲酸酐缩合。当无市售时，本领域技术人员可通过将必需的甲基酮乙酰化或三氟乙酰化，容易地制备1，3-二酮。可用多种方法包括催化氢化、在酸性条件下用锌或铁处理、或用其它还原剂例如连二亚硫酸钠或氯化亚锡处理，完成使得到的硝基衍生物还原为苯胺6b。随后可通过酰化，然后按前述流程2用肼处理，使苯胺6c转化为本发明的茚并[1，2-c]吡唑啉酮。
制备茚并[1，2-c]吡唑啉酮环系统的另一种方法见流程3。不加溶剂，使二甲基肼与3-乙酰基吡啶反应，得到腙7。按流程1中所述类似方式处理该产物，得到需要的中间体8。
流程3 或者，可用活化的酰化N-氨基吗啉或哌嗪环例如氨基甲酸硝基苯基酯处理6b。本领域技术人员已知按Rappoport，J.Org.Chem.492948-2953，1984中所述制备类似中间体的其它方法。通过与流程1中所述类似方式的顺序处理该中间体。
尽管前述流程描述了其中W为氧的通用合成路线，按照该通用路线内容，本领域技术人员能够预想和实施合成其中W不为氧的本发明其它化合物。例如，其中W选自S、S(O2)、C(＝O)、C(＝S)、CH2和NR”。
在随后描述示例性实施方案的过程中，本发明的其它特征将显而易见，提供这些示例性实施方案为举例说明本发明，本发明不受其限定。
v.实施例表A、B和C的化合物可如PCT申请WO 03/033499和/或WO04/092139所示来合成，其教导引入本文以供参考。
测定方案和结果通过一种或多种测定包括以下更详细描述的那些测定方法证明本发明化合物的生物活性和效用测定1.用碘化丙锭和BrdU测定本发明化合物对细胞周期进程的抑制(结果见图1和表2)。
测定2.暴露于本发明化合物的NCI系列(panel)代表的源自各种人肿瘤的宽范围的60种细胞系生存力下降(结果见表3)。
测定3.在产克隆细胞存活测定中，本发明化合物对细胞的不可逆作用(结果见表3、图2和图3)。
测定4.用钙黄绿素(Calcein)AM测定评估暴露于本发明化合物的HCT-116和IMR90细胞生存力下降(结果见表3和6)。
测定5.暴露于本发明化合物的停滞肿瘤细胞的生存力受抑制，而停滞正常细胞则不受抑制(结果见表4和图4)。
测定6.本发明化合物在某些激酶生物化学测定中的抑制活性(结果见表5和6)。
测定7.化合物在异种移植肿瘤模型中的活性(结果见图5、6、7和8)。
测定8.化合物与某些靶蛋白的亲和力(结果见图9)。
测定9.本发明化合物的抗病毒活性(结果见表7)。
测定1用碘化丙锭和BrdU分析细胞周期在细胞周期的G1、S和G2/M期细胞百分率通过用碘化丙锭给DNA染色来测定，并通过流式细胞仪用2N或4N DNA补体定量测定细胞数。用该方法评价对应于暴露于Cdk抑制剂的细胞周期的细胞分布改变。
碘化丙锭细胞染色法在按照下表1的T-25烧瓶中，在测试化合物的存在下，培养3批HCT-116细胞(100,000细胞/批)。在24、48和72小时进行分析。通过胰酶消化收集粘壁细胞，在Falcon 12×75流式细胞管中与飘浮细胞合并，通过离心收获。倾去细胞沉淀中的培养基，加入100μl PI染色剂，将细胞在37℃温育20-25分钟。优选细胞计数不超过2×106-4×106/ml。然后将等体积(100μl)PI盐加入细胞中，然后将其在4℃下温育1-2小时。上Becton Dickinson FACScan流式细胞仪分析染色细胞。样品避光。图1表明当暴露于化合物A37时，细胞凋亡和核内再复制证明细胞末期停滞在G1和G2期。发现本发明的某些其它化合物包括化合物B16出现类似结果。
测定结合DNA的BrdU该方法测量当细胞经过细胞周期S期发展时，结合新合成DNA的核苷酸类似物BrdU的细胞百分比。用抑制BrdU结合来测量Cdk抑制剂对S期发展和DNA复制的影响。
BrdU标记的方法在T25瓶中接种3批HCT-116细胞(100,000细胞/批)，使其与以上测试化合物一起温育。在24、48和72小时进行分析。将BrdU加入到各个T-25瓶中，储备液自10mg/ml至10μM终浓度，在37℃下，再将细胞温育16-18小时。然后按制造商的方案(BrdU Flow kit，BD-Pharmingen目录编号2354KK)如下制备用于流式细胞仪分析的细胞从T25瓶中收获(粘壁和飘浮)细胞，然后同上直接加入Falcon 12×75流式细胞管，随后加入100μl Cytofix/Cytoperm缓冲液固定、透化(30分钟，室温)。然后用1ml Perm洗涤缓冲液洗涤细胞，将细胞沉淀再悬浮于100μl Cytoperm Plus缓冲液，在冰上温育10分钟。然后细胞再用1ml Perm洗涤缓冲液洗涤，在室温下，在100μlCytofix/Cyto Perm缓冲液中重复固化10分钟。然后细胞用1ml Perm洗涤缓冲液洗涤。下一步，用100μl DNA酶在37℃下处理细胞1小时以暴露结合的BrdU，随后用1ml Perm洗涤缓冲液进行再一次洗涤步骤。用α-BrdU-FITC抗体(50μl 1∶50的抗体Perm洗涤缓冲液稀释液)证明存在结合的BrdU。细胞避光，在室温下温育20-30分钟。温育后，用1ml Perm洗涤缓冲液洗涤细胞，再悬浮于300μl 2％FBS的PBS溶液中，上流式细胞仪分析。结果在表2中以抑制50％BrdU结合的化合物浓度(μM)列出。
测定2评价Cdk抑制剂对NCI系列人肿瘤细胞系的抑制在国立癌症研究院用60种细胞系系列对化合物进行的评价提供了大量在有关多种肿瘤种类和遗传背景中效能的信息。该系列中包括源自白血病、黑色素瘤、肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌和肾癌的细胞系。该系列的用途是提供测量化合物在许多与肿瘤转化有关的基因中发生交替的细胞中的效能，这些基因包括p53、Her2/Neu以及涉及代谢的那些基因和导致多种耐药性的那些基因。可用采用下述方案得到的这些细胞系的数据评价化合物的活性。
NCI系列测定的结果在表3中列出(NCI系列)，用两种可提供数据的度量代表(a)将IC50(μM)小于10nM除外，计算全细胞系列平均-曲线中位值(Mean-Graph Mid-point)-平均IC50，该评价中等于10nM；(b)化合物抑制阿霉素抗性细胞系(ADR-res)的活性IC50(μM)。
本发明其它化合物在NCI测定中表现出以下活性(i)化合物A37平均-曲线中位值＜50nM和抑制ADR-res细胞生长的IC50＜100μM；(ii)化合物B16平均-曲线中位值＜50nM和抑制ADR-res细胞生长的IC50＜10μM。
体外癌筛选方法使细胞在RPMI-1640 10％FCS中生长，在96孔微量滴定板上接种，接种密度为5,000至40,000细胞/孔。在37℃、5％CO2下，将板温育24小时。制备含两倍需要终浓度的化合物(跨越4个数量级(log)的5个剂量)的培养基，向盛有100μl培养基和细胞的各孔中加入100μl，得到需要的终浓度。然后再将各板温育48小时。
用测量总蛋白的磺基罗丹明(Sulforhodamine)B(SRB)试验测定化合物对细胞生存力的影响。用冷TCA固定细胞至终浓度10％，在4℃下，温育60分钟。弃去上清液，各板用水洗涤5次，晾干。向各孔中加入4％(w/v)SRB/1％乙酸溶液，在室温下将各板温育10分钟。各板用1％乙酸洗涤5次，晾干。用10mM trizma碱溶解结合的染料，在板读出器上、515nM处读取吸收值。
测定3使用HCT-116细胞进行产克隆细胞存活测定的方案用该测定方法测定暴露一定时间后导致存活力不可逆损失的化合物浓度。通常，将细胞暴露于化合物1、2或5天，然后转移至无化合物的生长培养基中。在无化合物的培养基中连续温育多日后，统计回收的集落数，估算存活细胞数。
这种对本发明各种化合物的存活测定结果在表3(产克隆)中以抑制50％集落恢复的化合物浓度(IC50)(μM)列出。图2表示化合物A37对HCT-116细胞的细胞活性不可逆抑制和这种抑制的时程关系，暴露于化合物24小时，其IC50＜50nM。在相同测定中，化合物B16显示其IC50＜100nM，而在30至60min内，IC50达到100nM(图3)。
测量暴露于化合物后细胞存活的方法将培养基(RPMI-1640、10％FCS、青霉素/链霉素)在水浴中预热至37℃。在37℃、5％CO2下，温育细胞并使其生长。通过胰酶消化回收分会合板中的细胞，用血细胞计数器计数。在15cm组织培养皿、25ml培养基中，接种1×104个细胞。每种测试化合物设置14个板，在37℃下温育过夜。用培养基将化合物稀释成7个浓度，用含测试化合物的培养基替换细胞中的培养基。每个浓度的待测化合物设置两个板和两个无化合物的对照板。同上将板温育24、48或74小时，除去培养基，用新鲜培养基代替，再将板温育7天，用PBS洗涤。集落用结晶紫溶液(0.4％结晶紫，20％乙醇)染色5分钟，用蒸馏水洗涤两次，计数。
测定4不存在血清蛋白和血清蛋白存在下，用钙黄绿素AM生存力测定评价Cdk抑制剂用钙黄绿素AM测定(分子探针)确定由细胞生存力损失测量的Cdk抑制剂的效力。钙黄绿素AM是胞内酯酶的底物，它只在活细胞中分裂，产生可用荧光板读出定量的荧光产物。该荧光信号与活细胞数成比例，因此对应暴露于Cdk抑制剂的细胞信号损失与生存力损失相关。该测定可从生存力损失中区分细胞周期停滞，其中细胞可能仍是活的，因此非常适合评价Cdk抑制剂。在这种测定中，有效细胞毒化合物可导致细胞生存力的显著损失。
在人结肠直肠癌细胞系、HCT-116、正常人成纤维细胞、IMR90中测定细胞IC50。蛋白质调节的IC50也在HCT-116中测定。
这种生存力测定的结果在表3中列出(HCT-116(生存力/蛋白质调节的)和IMR-90)。本发明其它化合物对HCT-116细胞生存力IC50(μM，非蛋白质调节的)的测定见表6。
对其它细胞系类似细胞生存力测定同上。发现本发明其它化合物的IC50(μM)为(i)化合物A37HCT-116(＜50nM)，HCT-116蛋白质调节的(＜500nM)，A2780(＜10nM)，IMR90(＜50nM)；(ii)化合物B16HCT-116(＜10nM)，HCT-116蛋白质调节的(＜500nM)，A2780(＜10nM)，IMR90(＜100nM)。钙黄绿素AM生存力测定方案。
通过胰酶消化回收分会合板中的HCT-116或IMR90细胞，将1,000或4,000个细胞分别接种在24孔皿中，在37℃、5％CO2下温育过夜。在RPMI-1640、10％FCS中培养HCT-116细胞，而在α-极限必需培养基、10％FCS中培养IMR90细胞。过夜温育使粘附后，吸出各孔中的培养基，加入含0至250nM浓度、总共跨越7个剂量的测试化合物的培养基。将板再次放入培养箱，再培养72小时(3日)。测定蛋白质调节的IC50所用培养基是RPMI-1640、10％FCS加1mg/ml酸性α-糖蛋白(Sigma G-9885)和45mg/ml人血清白蛋白(SigmaA3782)。与测试化合物一起温育72小时后，细胞用1×PBS洗涤两次，要特别注意除去所有剩余缓冲液。
将50μg钙黄绿素等份试样(分子探针目录编号C3100)溶于50μl DMSO制备5μM钙黄绿素AM溶液。钙黄绿素完全溶解后(室温下10分钟)，将其稀释到10ml PBS。将钙黄绿素/PBS(0.5ml)加入各孔。在37℃下(避光)，将板温育75分钟，在荧光板读出计上读取荧光信号(激发485/20，发射530/25)。
测定5停滞细胞测定需要依赖细胞周期蛋白的激酶(Cdk)活性促进细胞通过细胞分裂周期不同期的进程。在培养基中，正常非转化细胞增殖需要生长因子的存在，通过除去血清除去它，导致Cdk活性丧失，结果当细胞进入静止期G0时，退出细胞周期。因此，根据机械论观点但不受理论束缚，与其转化的对应细胞相比，Cdk抑制剂在停滞正常细胞中的效力应显著降低。
用本发明某些化合物在停滞正常细胞(IMR90)和停滞肿瘤细胞(HT-116)上进行的生存力测定结果在下表4中列出。图4表示化合物A37对停滞正常细胞(IMR90)和肿瘤细胞(HT-116)生存力的抑制活性增加。发现化合物A37对停滞HCT-116细胞的IC50＜50nM，而对停滞IMR90细胞的IC50＞10μM。化合物B16证实对停滞HCT-116细胞的IC50＜50nM，而对停滞IMR90细胞的IC50＞10μM。
通过血清饥饿停滞HCT-116和IMR90细胞来评价化合物效力对于每一待测化合物浓度，将HCT-116细胞一式三份，在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基、24孔皿中接种，接种密度为200或2,000个细胞/孔，在37℃、5％CO2下温育过夜。除去含2,000细胞/孔板中的培养基，细胞用无血清培养基洗涤一次，将1ml无血清培养基加入细胞中。将含血清存在下的细胞和不存在血清的细胞的板再温育6天。
对于待测的每一化合物浓度，将IMR90细胞一式三份，在含10％胎牛血清的MEM-α培养基、24孔皿中接种，接种密度为2,000或20,000个细胞/孔，在37℃、5％CO2下温育过夜。除去20,000个细胞/孔皿的培养基，细胞用无血清培养基洗涤一次，将无血清培养基加入细胞中。将含血清存在下的细胞和不存在血清的细胞的板再温育3天。
通过血清饥饿评价HCT-116和IMR90细胞的细胞周期停滞为确保除去血清后细胞确实脱离细胞周期，在各实验中测定代表通过S期的那些进程的BrdU阳性细胞的百分率。对于该实验，用只在活细胞中有活性的胞内酯酶的荧光底物SNARF-1同时评价细胞生存力。通过流式细胞仪对BrdU结合和SNARF-1分裂一起评价，在单细胞基础上，提供对停滞细胞生存力的评价。为进行该分析，用SNARF-1使细胞染色如下，然后准备上述BrdU结合测定。
将HCT-116和IMR90细胞按下述密度接种在T25瓶的含血清培养基(分别为具有10％FCS的RPMI-1640或MEM-α)中。生长24小时后，除去培养基，洗涤细胞后，加入无血清培养基。
HCT-116+FCS 5,000个细胞HCT-116-FCS 100,000个细胞IMR90+FCS 100,000个细胞IMR90-FCS 200,000个细胞使IMR90细胞再生长3天，使HCT-116细胞再生长6天，然后用BrdU脉冲处理。在室温下，将50μg SNARF-1(分子探针目录编号C1272)等份试样溶于50μl DMSO，保持10分钟，然后稀释到10mlPBS。将SNARF-1进一步稀释为1∶64,000，然后向各细胞管中加入200μl，管中细胞已在血清存在下或无血清培养，并用BrdU脉冲处理20小时。将细胞在37℃下温育30分钟，然后用3ml PBS洗涤。
然后固定这些细胞，准备按上述测量BrdU结合。在FACScan流式细胞仪上测定活(FL-2)和BrdU阳性(FL-1)细胞百分率。
评价暴露于本发明化合物后停滞HCT-116和IMR90细胞的生存力在化合物的存在、37℃5％CO2下，将细胞温育72小时(3天)如下，测定化合物对周期和停滞细胞的效力。将周期和停滞HCT-116细胞以及周期IMR90细胞暴露于5至250nM范围中的6个剂量系列。对于停滞正常细胞，剂量范围增加至50nM至25μM，补偿预期的活性减少。
用钙黄绿素AM测定评价暴露于化合物72小时对细胞生存力的影响。钙黄绿素AM是只在活细胞中有活性的胞内酯酶的荧光底物。因此该底物分裂提供测量与细胞数成比例的生存力。
通过将50μg等份试样(分子探针目录编号C3100)溶于50μlDMSO制备钙黄绿素AM储备液。在室温下，将该管温育约10分钟，确保钙黄绿素完全溶解。将钙黄绿素稀释到10ml PBS中，制备终溶液，该溶液要避光。
将细胞中的培养基吸出，然后用1ml PBS洗涤细胞两次，通过吸出彻底除去细胞中的PBS。用移液管将0.5ml钙黄绿素/PBS溶液移入各孔中。将板在37℃下温育75分钟(避光)，在荧光板读出(激发485/20，发射530/25)上读数。
测定6生化激酶抑制测定酶Cdc2/细胞周期蛋白B购自市场。Cdk2/his-细胞周期蛋白E短期用Sf9细胞表达。Cdk2/细胞周期蛋白A、cdk4/细胞周期蛋白D1和cdk6/细胞周期蛋白D2，用Sf9细胞表达。蛋白激酶A(催化亚单位，来自牛心)和蛋白激酶C(大鼠脑的混合同工酶)，购自市场。
底物组蛋白H1购自市场。GST-Rb是与Rb蛋白379-928残基N末端稠合的谷胱苷肽S-转移酶。
测定通过用TCA沉淀测定测量结合组蛋白H1的[γ-32P]三磷酸腺苷放射性来测定Cdc2/细胞周期蛋白B活性。Cdc2/细胞周期蛋白B激酶和组蛋白H1购自市场。终测定液含50mM Tris.HCl、10mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、50μM三磷酸腺苷、2μCi32P、10％二甲亚砜(来自化合物)、pH 7.5、20μg组蛋白H1、6U酶，50μL体积。加入1nM至10μM各浓度的化合物。加入酶，开始反应，在30℃下进行20min，然后加入20μL反应终止液(237mM乙二胺四乙酸二钠、105mM三磷酸腺苷，pH 8.0)终止反应。加入35μL 70％(w/v)三氯乙酸沉淀蛋白，在96孔玻璃纤维滤板(Millipore，Inc.)上捕获沉淀，用25％(w/v)三氯乙酸将其润湿。滤器用25％(w/v)三氯乙酸洗涤10次，加入100μl闪烁体(Microscint 20，PackardInstruments)后，用闪烁计数测定结合32P的量。通过用化合物存在下结合放射性的量除以对照实验中只含DMSO不含化合物下结合放射性的量来测定相对活性。计算前，所有结果减去在含50mM EDTA不含化合物实验中测得的背景放射性。将数据代入标准方程测定化合物50％抑制浓度(IC50)P＝min+(max-min)(1/(1+(IC50/[I])s))(1)其中P＝1-相对活性为相对抑制，[I]是化合物浓度，max和min分别是最大和最小相对抑制(1和0)，s是所称的Hill斜率。
用谷胱苷肽琼脂糖捕获试验测定Cdk2/细胞周期蛋白E、Cdk2/细胞周期蛋白A、Cdk4/细胞周期蛋白D1和Cdk6/细胞周期蛋白D2活性。在Sf9昆虫细胞中表达酶，为异二聚体，底物(GST-Rb)是与在大肠杆菌(E.coli)中表达的Rb成视网膜细胞瘤蛋白379-928残基稠合的谷胱苷肽-S-转移酶。该测定液含50mM Tris.HCl、10mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、50μM三磷酸腺苷、2μCi[γ-33P]三磷酸腺苷、10％二甲亚砜(来自化合物)、pH 7.5、40μg GST-Rb和酶，100μL体积。加入1nM至10μM各浓度的化合物。使反应在30℃下进行15min，然后加入70μL反应终止液(237mM乙二胺四乙酸二钠、105mM三磷酸腺苷，pH 8.0)终止反应。通过使其与谷胱苷肽琼脂糖珠(Amersham)结合110min，捕获GST-Rb，悬浮液通过玻璃纤维滤器过滤。用含0.3％(w/v)吐温-20的磷酸盐缓冲盐水洗涤被截留的珠5次，加入100μl闪烁体后，用闪烁计数测定结合33P的量。通过用化合物存在下结合放射性的量除以对照实验中只含DMSO不含化合物下结合放射性的量来测定相对活性。计算前，所有结果减去在含50mM乙二胺四乙酸二钠不含化合物实验中测得的背景放射性。通过将数据代入方程(1)测得化合物的50％抑制浓度(IC50)。
用以组蛋白H1为底物的TCA沉淀试验测定蛋白激酶C和蛋白激酶A。对于蛋白激酶A，终测定液含50mM Tris、10mM MgCl2、1mM二硫苏糖醇、pH 7.5、12μM三磷酸腺苷、10％(v/v)二甲亚砜(来自化合物)、20μg组蛋白H1、2μCi[γ-32P]三磷酸腺苷、0.2U蛋白激酶A，100μl测定液。蛋白激酶C测定液含50mM Tris、10mMMgCl2、1mM二硫苏糖醇、0.8mM CaCl2、pH 7.5、5μM三磷酸腺苷、10％(v/v)二甲亚砜(来自化合物)、20μg组蛋白H1、2μCi[γ-32P]三磷酸腺苷、0.01U蛋白激酶C，50μl测定液。加入酶，开始测定，在30℃下使反应进行10min，然后加入0.4体积237mM乙二胺四乙酸二钠、105mM三磷酸腺苷、pH 8.0终止反应。加入0.5体积75％(w/v)三氯乙酸，从终止反应中沉淀蛋白，通过96孔玻璃纤维过滤装置(Millipore)过滤捕获。滤器用25％(w/v)三氯乙酸洗涤10次，加入100μl闪烁体，用闪烁计数测定结合的[32P]磷酸酯的量。通过将数据代入方程(1)测得化合物的50％抑制浓度(IC50)。
以上测定结果在表5和表6列出。
测定7异种移植肿瘤模型药物。合成本发明化合物，用生物相容载体配制以用于静脉给药。获取CPT-11(Camptosar，Pharmacia)药物，用5％葡萄糖-水(D5W)制备。所有制剂均为每周新制，将注射体积调整到体重(0.2ml/20g小鼠)。
小鼠/饲养。将得自Charles River的雌性nu/nu小鼠在安静微隔离笼中饲养，提供自由进水和经辐射的标准啮齿动物饲料(PurinaPico-Lab Rodent Diet 20)。
测定最大耐受剂量(MTD)。将8周龄小鼠配对，按5-8只动物为一组编组，用未知测试化合物进行初步毒性研究。动物用测试化合物每日静脉注射处理，连续10日，每周称重两次。经常检查任何药物相关不良反应所致小鼠的临床体征。抗癌药物在小鼠中的可接受毒性由NCI定义为平均组重量减少不超过20％，和经处理动物的毒性死亡率不超过10％。
标准方案。将单个1mm3肿瘤片断(肿瘤brie)s.c.植入无胸腺裸小鼠(6-7周龄雄或雌性)体内，或将5-10×106组织培养来源的细胞植入协腹。开始时每周监测动物肿瘤生长两次，然后当植入物接近约100mm3预定体积时，每天监测。当肿瘤生长至计算重量62-221mg时，将动物配对，编成合适的实验治疗组(8-10只动物/组)，开始用测试化合物治疗。阳性对照组按过去对照组给药。计算肿瘤重量，每周两次称量体重，经常观察动物出现的不良药物反应。方案要求肿瘤质量达到1000mg的任何动物立即安乐死亡。
通过数字式卡尺测定肿瘤的长度和宽度以测量肿瘤。肿瘤重量用下式估计肿瘤重量(mg)＝(w2xl)/2其中w＝肿瘤宽度，l＝肿瘤长度，以mm计。这些值也可用体积单位(mm3)表示。
实验性治疗可导致肿瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。PR是其中在研究期间连续三天肿瘤大小是初始(第1天)大小的50％或小于初始大小但大于0.0mg，而当连续三天无可测量的肿瘤实质时，出现CR。治愈定义为其肿瘤缩小至0mg，并保持该状态直至实验结束的动物。
细胞杀死对数(Log cell kill)(LCK)是决定初始治疗后被杀死肿瘤细胞百分率的计算结果，可用作定量测量效能
Log细胞杀死(LCK)＝(T-C)/(3.32)(Td)其中T＝治疗组小鼠大小达到1000mg所需平均时间，C＝对照组肿瘤大小达到1000mg的平均时间，Td＝在指数生长期，用对照组肿瘤半对数生长曲线的线性回归分析估计的肿瘤达两倍的时间，3.32＝群体增加1-log10单位所需加倍数。每个LCK单位代表细胞杀死1-log10单位(例如1LCK＝90％杀死，2LCK＝99％杀死等)。我们认为当化合物的LCK值＞1时，相当于＞90％肿瘤细胞杀死，它们有显著活性。
肿瘤生长抑制(TGI)是描述在一定时间内，化合物治疗抑制肿瘤生长量的计算结果。它表示为％TGI＝100(1-T/C)其中T是在指定天，化合物治疗组的平均肿瘤大小，而C是同一天载体对照组的平均肿瘤大小。
中毒死亡定义为化合物治疗而非疾病状态导致的死亡。如果最终化合物治疗后肿瘤大小未达到1000mg，动物在1周内死亡，可认为毒性所致死亡。有在该点之后的非肿瘤有关的死亡记录，但不认为是毒性死亡。
按以下惯例定义肿瘤消退如果肿瘤重量减轻至＜初始重量50％(＜50mg)，消退定义为部分(PR)。如果在实验期间，肿瘤重量减少至小于可测量的重量，消退定义为完全(CR)。治愈定义为在观察期结束时无肿瘤的动物。
结果图6表示本发明的几个化合物在HCT116异种移植肿瘤模型中获得的结果。图6表示化合物A37在A2780异种移植肿瘤模型中获得的结果。图7表示化合物A37在PC3异种移植肿瘤模型中获得的结果。图8表示化合物B16在A2780异种移植肿瘤模型中获得的结果。
测定8测量靶分子和化合物之间的亲和力为证实用于本文中提出用途的特定化合物的适用性，表征这种化合物与其已知结合配偶体(如有)的结合性质可能有用。但这不应视为限定本发明范围。
可测定化合物与它们相应的结合配偶体的亲和力，例如用BIACORETM测定系统(Biacore AB，Uppsala，SE)。产生相似定量结果的其它系统例如Affinity Sensors(Cambridge，UK)开发的那些系统对本领域技术人员而言是显而易见的。
在一个代表性方法中，分析化合物R与其已知结合配偶体CDK2/细胞周期蛋白E的结合。该分析在22℃下、BIACORE 2000 SPR-Biosensor上、含20mM HEPES(pH 7.4)、150mM NaCl、1mM DTT和0.005％吐温20(蛋白质级，Calbiochem)的电泳缓冲液中进行。将10μM化合物R溶液在pH 8.0，通过酰胺偶联化学与CM5传感蛋白芯片(研究级)的葡聚糖表面偶联。为表征化合物R与蛋白质例如CDK2/细胞周期蛋白E的结合，将纯化蛋白组分在电泳缓冲液中稀释，得到9个不同蛋白浓度，然后使各浓度相继通过该传感蛋白表面，每个浓度的通过时间为5min，随后按相同流动速度使电泳缓冲液在5min内通过该表面。在30μl/min流速下，测量在CM5-化合物R-加载芯片上的CDK2/细胞周期蛋白E复合物的缔合和解离。每次实验后，在下一个样品载样前，通过两次连续注射3M盐酸 (20秒，30μl/min)使芯片再生。
数据用Bioevaluation软件3.1版(Biacore AB，Uppsala，SE)分析。将曲线归一化至注射开始，和用对照表面得到的背景。分别测定缔合和解离速度，或全部使用Langmuir 1∶l结合模型。用以下方程计算亲和力(KD)KD＝k解离/k缔合可用其它靶蛋白例如Cdk9、Cdk4等按以上方法进行类似操作。例如，Cdk9的抑制剂可有效治疗或预防HIV和/或AIDS。
图9表示由CDK2/细胞周期蛋白E与CM5-化合物R-加载芯片结合得到的结果实例。用这些数据计算的KD等于8,0+/-2,8nM。
测定9抗病毒活性在用低代(low passage)、临床上分离的HIV-1ROJO感染的外周血单核细胞(PBMCs)中测量这些化合物对急性感染细胞的效能，评价本发明某些化合物的活性。使用这些正常人细胞可估计这些化合物的治疗指数。将两个供体的新鲜PBMCs合并，用PHA-P刺激48-72小时。然后在IL-2存在下培养细胞，通过致有丝分裂的信号引发来维持细胞分裂。按0.1的感染复数加入病毒。感染后，将细胞培养7天，然后评价效能。通过上清液中的逆转录酶活性水平测量病毒复制，细胞毒性用MTS试验测定。两次测定这些化合物抗HIV效能和细胞毒性的结果在表7中列出。
本文中引用的所有参考文献、专利和出版物通过引用整体结合到本文。
表1.
用于测定1的化合物浓度范围。
表2.
本发明某些化合物在上述BrdU结合测定中的结果。
表3本发明某些化合物在下列上述体外细胞活性测定中的结果用HCT-116细胞进行生存力和产克隆细胞存活测定，用IMR90细胞进行生存力测定，和两个抗NCI细胞系列活性的测量(抗阿霉素抗性细胞系的“平均-曲线MID值”和IC50)。
表4.
本发明某些化合物在上述停滞细胞测定中的结果(IC50，nM)。
表5.
本发明某些化合物在上述生化抑制测定中的结果(IC50，μM)
表6.
其它化合物在上述生化抑制和HCT-116生存力测定(非蛋白质调节)中的结果。
表7本发明某些化合物抗病毒活性结果。IC50通过上清液中逆转录酶水平测量的50％病毒复制抑制；TC5050％细胞毒性(MTS)；TITC50/IC50。
表A
表B
表C
表D从下表中可能的特征选择适当特征产生的本发明其它化合物。例如从以下选择中产生化合物A77无-吗啉代-芳基-OCH2(CO)-哌嗪-CH3。
表E从下表中可能的特征选择适当特征产生的本发明其它化合物。例如从以下选择中产生化合物B3无-吗啉代-芳基-CH2-哌嗪-CH2CH2OH。
权利要求
1.具有式I结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物和/或立体异构体 其中R8代表取代或未取代的杂环；F代表(CH2)n，其中n是1-6的整数；且Q代表取代或未取代的仲氨基取代基、取代或未取代的叔氨基取代基或取代或未取代的含氮杂环；条件是不包括下列化合物 A82。
2.权利要求1的化合物，其中n是1。
3.权利要求1或2的化合物，其中R8代表吗啉代或哌嗪环。
4.权利要求1-3任一项的化合物，其中Q代表取代或未取代的吡咯烷、取代或未取代的哌嗪或取代或未取代的哌啶。
5.权利要求1的化合物，其中所述化合物选自
6.权利要求1-4任一项的化合物，其中Q代表取代的仲氨基取代基、取代的叔氨基取代基或取代的含氮杂环。
7.权利要求6的化合物，其中一个或多个取代基在每次出现时独立地选自烷基、氧代基、酰基氨基、羟基、羰基、磺酰基、酯、酰胺、NR”、羟基烷基、烷氧基烷基、芳基、杂环基、环烷基或低聚(乙二醇)。
8.权利要求1-4任一项的化合物，其中R8具有以下结构 其中Z代表O或NR”，且R”代表H或低级烷基。
9.具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体
10.具有以下结构的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体
11.具有以下结构的纯化或合成的化合物或其异构体、前药、互变异构体、药学上可接受的盐、N-氧化物或立体异构体
12.药用组合物，所述组合物包含药学上可接受的赋形剂和权利要求1-11任一项的化合物。
13.治疗过度增殖性病症的方法，所述方法包括给予动物权利要求1-11任一项的化合物。
14.抑制细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求1-11任一项的化合物接触。
15.治疗病毒感染的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求1-11任一项的化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述病毒感染由人免疫缺陷病毒(HIV)引起。
17.治疗或预防化学疗法或放射疗法引起的脱发的方法，所述方法包括联合给予哺乳动物权利要求1-11任一项的化合物和一种或多种化学疗法或放射疗法。
18.治疗过度增殖性病症的方法，所述方法包括给予动物权利要求11的化合物。
19.抑制细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与权利要求11的化合物接触。
20.治疗病毒感染的方法，所述方法包括给予哺乳动物权利要求11的化合物或包含治疗有效量的所述化合物的组合物。
21.权利要求20的方法，其中所述病毒感染由人免疫缺陷病毒(HIV)引起。
22.权利要求1-11任一项的化合物在制备药物中的用途。
23.权利要求22的应用，其中所述药物是用于治疗或预防选自过度增殖性病症、病毒感染、化疗诱导的脱发以及与依赖细胞周期蛋白的激酶活性有关的疾病的病症的药物。
24.用于治疗病症的权利要求1-11任一项的化合物。
25.权利要求24的化合物，其中所述病症选自过度增殖性病症、病毒感染、化疗诱导的脱发以及与依赖细胞周期蛋白的激酶活性有关的疾病。
26.抑制依赖细胞周期蛋白的激酶的方法，所述方法包括给需要这种治疗的宿主施用有效量的权利要求1-11任一项的化合物或包含治疗有效量的所述化合物的组合物。
27.治疗与依赖细胞周期蛋白的激酶有关的病症的方法，所述方法包括给需要这种治疗的宿主施用有效量的权利要求1-11任一项的化合物或包含治疗有效量的所述化合物的组合物。
全文摘要
本发明涉及新的式(I)依赖细胞周期蛋白的激酶抑制剂(cdks)，以及尤其但不仅仅为cdk/细胞周期蛋白复合物抑制剂，其中取代基如权利要求书定义。如本文中所述，本发明抑制剂能抑制细胞周期机制，因此可用于调节细胞周期进程，最终控制细胞生长和分化。此类化合物可用于治疗个体的过度细胞增殖相关性病症。
文档编号C07F9/00GK1922180SQ200480042035
公开日2007年2月28日 申请日期2004年12月21日 优先权日2003年12月23日
发明者N·博科维奇, A·F·克卢格, C·奥尔曼, K·K·穆尔蒂, S·拉姆, 王忠国, 黄建星 申请人:Gpc生物科技公司