新的人蛋白激酶c抑制蛋白编码序列、其编码的多肽及制备方法

专利名称：新的人蛋白激酶c抑制蛋白编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及一种新的II型人蛋白激酶C抑制蛋白人PKCI-2的编码序列，该序列编码的蛋白是人体中天然存在的HIT家族的一个新成员，是人hPKCI的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
蛋白质激酶C(protein kinase C，简称“PKC”)是一族在细胞内信号传导通路中起重要作用的丝/苏氨酸激酶。当细胞外信号分子作用于细胞膜上的酪氨酸激酶受体或G蛋白耦连受体后，激活了胞质内的磷脂酶，促使质膜上的PIP2(4，5-二磷酸磷脂酰肌醇)水解为IP3(1，4，5-三磷酸肌醇)和DAG(二脂酰甘油)。IP3动员细胞内源钙到细胞溶质，使细胞内钙离子浓度上升，DAG激活蛋白激酶C。活化的蛋白激酶C通过对靶蛋白上丝/苏氨酸残基的磷酸化改变靶蛋白的生物活性，进而引起细胞应答。PKC活化和细胞应答之间的中间步骤尚不清楚。已有的证据表明，PKC可通过抑制GAP(GTPase activatingprotein)来提高ras蛋白活性(Berry，Eur.J.Biochem(1990)189，205)。PKC途径也可活化另一丝/苏氨酸激酶Raf进而影响蛋白激酶级联反应中的MAP激酶、RSK活性从而活化靶基因(Siegel，J.N.，J.Biol.Chem.(1990)265，18472)。PKC也可通过影响转录因子如c-Jun，NF-kB的活性来促进基因的转录(Boyle W.J.，Cell(1991)64，573；Silvia，S，Pharmac.Ther.(1991)51，71)。
蛋白激酶C抑制蛋白(protein kinase C inhibitor，简称PKCI)属于HIT(histidine triad)蛋白家族。此家族的成员具有保守的由三个组氨酸构成的基序(his-x-his-x-his)(Seraphin B.，DNA Sequence(1992)3，177；Robinson K，Biochem.J.(1994)662)。根据氨基酸序列比较，此蛋白家族又可分为两个亚族。其中一个在C端相对较为保守，且其哺乳动物同源蛋白之间的氨基酸顺序同一性大于94％。已经发现的此亚族的成员包括人(Homo sapien)hPKCI(Brzoska PM，1996，登录号U51004)，牛(Bos taurus)PKCI-1(Pearson JD，1990，登录号U9405)，小鼠(Mus musculus)PKCI-1(Kelein MG，未发表序列，登录号U60001)，玉米(Zea mays)ZBP14(Simpson GG，1994登录号Z29643)等。另一亚族以人FHIT为代表(Ohta M，1996，登录号U46922)，此外还包括裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)二核苷酸5′，5-P1，P4四磷酸(Ap4A)不对称水解酶(Huang Y.Biochem.J.(1995)312，925)等。此亚族内部的氨基酸序列同一性在50％左右，而在两个亚族间的同一性只有20％左右。两个亚族共有一个大约100个氨基酸的核心区，在靠近C端和N端的区域则有较大变异(Lima CD，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，5357)。
第一亚族的最初成员牛PKCI-1是作为一热稳定的钙结合蛋白从牛脑中分离的，在体外有较强的PKC抑制活性，被认为是最有可能的体内PKC抑制因子(Mcdonald JR，Biochem.J(1985)232，559-567；Mcdonald JR，Biochem.J(1987)242，659-705)。Rane等将此蛋白导入鸡胚感觉神经元，发现细胞内的钙流被阻断，为牛PKCI-1在体内的PKC抑制作用提供了证据(Rane SG，Neuron(1989)3(2)，239)。然而在一项对内源的热稳定和热不稳定蛋白在总PKC活性抑制中的作用相对大小的研究中，Fraser推测牛PKCI-1可能并不是PKC在体内的生理调节因子(Fraser ED，FEBS Lett(1991)294(3)，285)。Simpson等在1994年从玉米中分离了一个与牛PKCI同源的基因的cDNA(Simpson CG，Biochimica et Biophysica Acta 1222(1994)306)，对其表达的蛋白ZBP14的功能研究表明，此蛋白只有很弱的PKC抑制活性而且其抑制作用与另一PKC抑制蛋白14-3-3具有协同效应(Robinson K，Biochem.J.(1995)307(ptl)267)。1996年，利用酵母双杂交系统，Brzoska等分离了一个人的PKCI-1 cDNA(Brzoska PM，Genomics(1996)36，151)，其表达的蛋白除了可以和PKC的调节区域发生作用外，还能与AT毛细血管扩张共济失调互补蛋白ATDC(ataxia-telangictasia group D complementation)发生作用。这提示hPKCI-1可能在电离辐射诱导的信号传导中起重要作用。(Brzoska PM，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)92，7824)。
HIT家族的第二亚族的代表成员-人类FHIT是在1996年由Ohta等利用外显子捕获方法从覆盖人染色体3P14.2缺失区的粘粒中分离得到的(Ohta M.，Cell(1996)84.587)。由于此基因在多种癌细胞株中的缺失，推测其可能是一个肿瘤抑制基因(SozziG.，Cell(1996)85，17；Virgilio L，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1996)93，9770)，然而确切的证明其肿瘤抑制功能的证据还不充分(Mao L.，Journal of the National Institute(1998)90(6)，412)。FHIT在体外具有二核苷酸5′，5-P1，P4三磷酸不对称水解酶活性(Barnes LD，Biochemistry(1996)35，11529)，Lima等也报道了hPKI的ADP水解酶的活性(Lima CD，Science(1997a)278，286)。运用晶体衍射和底物模拟方法，Lima等对FHIT和hPKCI进行了催化机制和底物特性的研究，证明了HIT家族成员是核苷酸水解酶或核苷酸转移酶(Lima CD，1997a)。尽管如此，HIT家族在体内的底物还是未知，其生物学功能还待进一步研究。
但在本发明之前，尚没有人发现本发明的新的人hPKC编码序列或多肽。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码HIT家族的一个新成员，本发明的人hPKCI同系物命名为人PKCI-2本发明的另一个目的是提供一种新的HIT家族成员蛋白，该蛋白被命名为人PKCI-2。
发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人PKCI-2蛋白的方法。
本发明还涉及这种人PKCI-2核苷酸序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列含有SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的人PKCI-2蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人PKCI-2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人PKCI-2蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人PKCI-2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人PKCI-2蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为532个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于106-492位核苷酸。
本发明的多核苷酸可以是RNA形式和DNA形式，DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA，DNA可以是双链或单链，如果是单链，可以是编码链或非编码链在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“人PKCI-2蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中106-492位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框106-492位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中106-492位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人PKCI-2相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“人PKCI-2蛋白多肽”指具有人PKCI-2蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人高效淋巴细胞趋化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括人PKCI-2蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与人PKCI-2 DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗人PKCI-2多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含人PKCI-2多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还提供了人PKCI-2多肽的可溶性片段。通常，该片段具有人PKCI-2多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供人PKCI-2蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然人PKCI-2多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还可以包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括人PKCI-2多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内人PKCI-2的表达。
本发明还包括一种可用作探针或引物的核酸分子。探针分子通常具有人PKCI-2多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码人PKCI-2的核酸分子。
本发明还包括检测人PKCI-2核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于人PKCI-2多肽的编码序列，可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对人PKCI-2DNA或是其片段编码的多肽具有特异性抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人PKCI-2基因产物或片段。较佳地，指那些能与人PKCI-2基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人PKCI-2蛋白的分子，也包括那些并不影响人PKCI-2蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人PKCI-2基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人PKCI-2基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人PKCI-2或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断人PKCI-2功能的抗体以及不影响人PKCI-2功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人PKCI-2基因产物的片段或功能区，通过免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人PKCI-2基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人PKCI-2核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为532个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于106-492位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，以寡核苷酸A15′-AAGATGGCGGCACGTGGTGCTG-3′(SEQ ID NO1)为正向引物，A25′-AAGCATCCAGAGTCTGGTTGTCC-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR，获得532bp的目的片段。鉴定测序后得到SEQ ID NO3的全长cDNA序列。
本发明提供的多核苷酸与小鼠PKCI高度同源，并且本发明提供的多核苷酸编码的蛋白与人hPKCI蛋白、牛PKCI-1蛋白、小鼠PKCI蛋白、玉米ZBP14蛋白的序列也分别有较高的同源度。又由于本发明多核苷酸编码的蛋白与上述其同系物共有his-x-his-x-his的保守基序，因此本发明提供的多核苷酸人PKCI-2所编码的蛋白可归入HIT蛋白家族。鉴于此，本发明提供了一个HIT蛋白家族的新成员，并提供了对此家族研究的新途径。
本发明的人PKCI-2蛋白在人体内的同源蛋白人hPKCI蛋白具有与PKC调节区域相互作用的活性，因此可以推测本发明的人PKCI-2蛋白可能具有调节体内PKC生理活性的作用。鉴于PKC在涉及到细胞生长，分化的细胞信号传导过程中起重要作用(Nishizuka Y，Science(1986)233，305；Nishizuka Y，Nature(1988)334，661)，PKC的不正常活化在多种疾病中都有涉及(Bradshaw D，Agents Actions(1993)38，135)。本发明除了提供一种对PKC在细胞中的功能进行研究方法之外，还提供了对多种PKC不正常活化所引起的疾病进行研究的新途径以及对此类疾病进行治疗的新方法。
特别地，最近的研究表明PKC在阿片受体的异源脱敏中发挥重要作用，而受体脱敏被认为是阿片类药物的耐受和成瘾的具体分子机制。(Zhang L，J.Biol.Chem，(1996)271(19)，11449)因此本发明的蛋白的与PKC相互作用的活性提供了对阿片类药物的耐受和成瘾分子机制研究的新途径。
由于本发明提供的多核苷酸编码的蛋白与人PKCI蛋白有62％的序列同一性而人hPKCI具有与ATDC的相互作用的活性，本发明提供对遗传病毛细血管扩张共济失调AT及与之相关的电离辐射诱导的信号传导通路进行研究的新途径。
在附图中，


图1为本发明的人PKCI-2与人PKCI的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人PKCI-2与小鼠PKCI的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图3为本发明的人PKCI-2与人PKCI蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
图4为本发明的人PKCI-2与小鼠PKCI蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用“|”标出，相似的氨基酸用“·”标出。相似氨基酸是A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L，M，V；F，Y，W。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人PKCI-2的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-AAGATGGCGGCACGTGGTGCTG-3′(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸A25′-AAGCATCCAGAGTCTGGTTGTCC-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃ 4分钟，随之以93℃ 1分钟、68℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测得到的PCR片断，A1/A2为532bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将如上获得的PCR扩增产物A1/A2与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共532bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于106-492位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出人PKCI-2的氨基酸序列，共128个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4实施例2.人PKCI-2同源比较利用blastn及blastp程序对Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB sequences及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+SPupdate+PIR数据库进行同源检索。根据同源检索结果发现，本发明提供的多核苷酸与人PKCI基因和小鼠PKCI有50％左右的序列同一性(identity)(图1和图2)，并且本发明提供的多核苷酸编码的蛋白与人hPKCI蛋白、牛PKCI-1蛋白、小鼠PKCI蛋白、玉米ZBP14蛋白的序列同一性分别61％(图3)，62％，60％(图4)，52％。此外，与hPKCI蛋白、小鼠PKCI蛋白的相似性达到了约75％(图3和4)。
又由于本发明提供的多核苷酸编码的蛋白与上述其同系物共有his-x-his-x-his的保守基序。在本发明蛋白中对应于基序的是His Leu His Ile His(112-116位)，因此更确定了本发明提供的多核苷酸人PKCI-2所编码的蛋白属于HIT蛋白家族。鉴于此，本发明提供了一个HIT蛋白家族的新成员，并提供了对此家族研究的新途径。
本发明的人PKCI-2蛋白在人体内的同源蛋白人hPKCI蛋白具有与PKC调节区域相互作用的活性，因此可以推测本发明的人PKCI-2蛋白可能具有调节体内PKC生理活性的作用。鉴于PKC在涉及到细胞生长，分化的细胞信号传导过程中起重要作用(Nishizuka，1985，1986)，PKC的不正常活化在多种疾病中都有涉及(Bradshaw，1993)。本发明除了提供一种对PKC在细胞中的功能进行研究方法之外还提供了对多种PKC不正常活化所引起的疾病进行研究的新途径以及对此类疾病进行治疗的新方法。
特别地，最近的研究表明PKC在阿片受体的异源脱敏中发挥重要作用，而受体脱敏被认为是阿片类药物的耐受和成瘾的具体分子机制(Li Zhang，1996)。因此，本发明的蛋白的与PKC相互作用的活性提供了对阿片类药物的耐受和成瘾分子机制研究的新途径。
由于本发明提供的PKCI-2与人PKCI蛋白序列高度同源而人hPKCI具有与ATDC的相互作用的活性，本发明提供对遗传病毛细血管扩张共济失调AT及与之相关的电离辐射诱导的信号传导通路进行研究的新途径。
本发明的人PKCI-2除了可作为该家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人PKCI-2还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白，如将本发明人PKCI-2的N端与人PKCI的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
此外，针对本发明人PKCI-2的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
此外，本发明人PKCI-2核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人PKCI-2的表达水平或者抑制人PKCI-2的过度表达。本发明的人PKCI-2蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人PKCI-2缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3人PKCI-2在大肠杆菌中的表达编码人PKCI-2的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例1中的PCR扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-CCTAGTCGACATGG GAATTGAAGT GGCCA-3′(SEQ ID NO.5)。
该引物序列含有SalI限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人PKCI-2编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5′-ATCGAAGCTTTCAA CCTGGAGGCC ACTGG-3′(SEQ IDNO.6)。
该引物序列含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和人PKCI-2的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用HindIII和SalI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证人PKCI-2的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物阳性转化子的克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞至600光密度(OD600)为0.4-0.6，随后加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的人PKCI-2。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱人PKCI-2。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。首先，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出的纯化蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定出表达蛋白的分子量为14KDa。
此外用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例4人PKCI-2在真核细胞(CHO细胞株)中的表达编码人PKCI-2的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)或实施例1中的PCR扩增产物为模板进行扩增，以合成插入片段。
5′寡核苷酸引物序列为5′-CGTAAAGCTTATGG GAATTGAAGT GGCCA-3′(SEQ ID NO.7)，该引物序列含有HindIII限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的人PKCI-2编码序列的19个核苷酸；3′端寡核苷酸引物序列为5′-ATTCGAATTCTCAA CCTGGAGGCC ACTGG-3’(SEQ ID NO.8)该引物序列含有EcoRI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和人PKCI-2的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用HindIII和EcoRI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，测序验证人PKCI-2的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定出表达蛋白的分子量为14K Da。
此外用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例5制备抗体将如上获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人PKCI-2基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人复旦大学(ii)发明名称新的人蛋白激酶C抑制蛋白编码序列、其编码的多肽及制备方法(iii)序列数目8(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1AAGATGGCGG CACGTGGTGC TG22(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2AAGCATCCAG AGTCTGGTTG TCC 23(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度532bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 AAGATGGCGG CACGTGGTGC TGGCTGCTGG GTTGCGCGCG CGCAGAAGCC GTGGCGCCCA61 CGGGGGTGCG CGGGGGGCAG GTCCGAGGAG CTGCAGGTGT GACTGATGGG AATTGAAGTG121 GCCAAGGCCC AGCAGGCAAC TCCTGGGGGA GCAGCCCCAA CCATCTTCTC CCGGATCCTG181 GACAAGAGCC TCCCAGCTGA CATTCTCTAT GAGGACCAGC AGTGTCTTGT GTTCCGTGAT241 GTGGCCCCTC AGGCTCCTGT GCACTTCCTG GTCATTCCTA AGAAGCCCAT TCCTCGGATT301 AGCCAGGCTG AAGAAGAAGA CCAGCAGCTT CTAGGACACC TACTCCTTGT GGCCAAGCAG361 ACAGCAAAGG CTGAGGGCCT GGGAGATGGA TACCGACTTG TGATCAACGA TGGGAAGCTG421 GGTGCACAAT CTGTGTATCA TCTGCACATT CATGTACTTG GGGGCCGGCA GCTCCAGTGG481 CCTCCAGGTT GAACCTGCCA ACTGATTAAA GGACACCAGA CTCTGGATGC TT(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度128氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Gly Ile Glu Val Ala Lys Ala Gln Gln Ala Thr Pro Gly Gly16 Ala Ala Pro Thr Ile Phe Ser Arg Ile Leu Asp Lys Ser Leu Pro31 Ala Asp Ile Leu Tyr Glu Asp Gln Gln Cys Leu Val Phe Arg Asp46 Val Ala Pro Gln Ala Pro Val His Phe Leu Val Ile Pro Lys Lys61 Pro Ile Pro Arg Ile Ser Gln Ala Glu Glu Glu Asp Gln Gln Leu76 Leu Gly His Leu Leu Leu Val Ala Lys Gln Thr Ala Lys Ala Glu91 Gly Leu Gly Asp Gly Tyr Arg Leu Val Ile Asn Asp Gly Lys Leu106 Gly Ala Gln Ser Val Tyr His Leu His Ile His Val Leu Gly Gly121 Arg Gln Leu Gln Trp Pro Pro Gly(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5CCTAGTCGAC ATGGGAATTG AAGTGGCCA 29(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ATCGAAGCTT TCAACCTGGA GGCCACTGG 29(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7CGTAAAGCTT ATGGGAATTG AAGTGGCCA 29(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ATTCGAATTC TCAACCTGGA GGCCACTGG 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3从核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的序列。
4.一种分离的人PKCI-2蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有人PKCI-2蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成人PKCI-2蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成人PKCI-2蛋白的重组细胞；(c)在适合表达人PKCI-2蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有人PKCI-2蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸106-492位。
12.一种能与权利要求4所述的人PKCI-2蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的Ⅱ型人蛋白激酶C抑制蛋白PKCI－2的编码序列,该序列编码的蛋白是人体中天然存在的HIT家族的一个新成员,是人h PKCI的同系物。本发明还涉及由该核苷酸序列编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K16/18GK1249341SQ98119440
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月28日 优先权日1998年9月28日
发明者余龙, 赵勇, 张民, 胡培蓉, 赵寿元 申请人:复旦大学