新的人线粒体基质gtp:amp磷酸转移酶、其编码序列及制备方法

专利名称：新的人线粒体基质gtp:amp磷酸转移酶、其编码序列及制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及人线粒体基质GTPAMP磷酸转移酶的cDNA序列以及该序列编码的多肽。本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法，以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。
众所周知，在生物体中，能量代谢是由磷酸核苷酸来作为中转站的，比如常见的(ATP/ADP/AMP、GTP/GDP)。它们可以把各种能量反应中产生的能量，通过核苷酸的磷酸化转移过来，贮藏于高能磷酸键中，然后可以在需要的反应中释放出来，并以核苷酸去磷酸化，或磷酸基团转移的形式完成能量转移。因而，细胞中各种磷酸核苷酸的浓度和相互间的比例，就能够代表细胞的能量水平。可以催化各种磷酸核苷酸之间相互转化的调控酶，实际上也就可以调控细胞的能量代谢。
腺苷酸激酶(Adenylate kinases，简称AK)家族就是这样的调控酶。这是一个在生物体内无处不在的蛋白，它可以在镁离子的存在下，催化从腺苷一磷酸到腺苷二磷酸的反应(J-Biochem-Tokyo.1993 Feb；113(2)200-7.)。经过多年的研究，现已将AK家族分为三个大类，分别称作AK1，AK2，AK3。其中AK1代表胞质中的ATPAMP磷酸转移酶；AK2代表线粒体内膜空间中的ATPAMP磷酸转移酶；AK3代表线粒体基质中的GTPAMP磷酸转移酶(Gene.1991 Nov 15；107(2)313-7.)。每种生物都同时具有这三种腺苷酸激酶，只是不同生物不同组织的表达量不尽相同，通常AK1水平高时AK2的水平就较低，反之亦然。而AK3的表达量则始终较高，这似乎表明AK3在这三者中是最为重要的一个(J-Biochem-Tokyo.1993Feb；113(2)200-7.)。
尽管第一个腺苷酸激酶很早就被表现，但对这个家族的研究却始终没有间断过。1984年，Wieland B等人就测定了牛肉-心脏中AK3的氨基酸序列，并讨论了AK家族中存在的广泛的相似性(Eur J Biochem 1984 Sep 3；143(2)331-339.)。1989年，Yamada M等人克隆并鉴定了牛肝中AK3的cDNA顺序(J-Biol-Chem.1989 Nov 15；264(32)19192-9.)。1991年，该小组又克隆并鉴定了该AK3的基因顺序(Gene.1991 Nov 15；107(2)313-7.)。1992年，Xu-G等人鉴定了人类AK3的cDNA顺序(Genomics.1992 Jul；13(3)537-42.)。近年来，在酵母，兔等真核生物体内又发现很多腺苷酸激酶AK的存在。(Mol-Gen-Genet.1992 Jun；233(3)363-71.& Biull-Eksp-Biol-Med.1990 Aug；110(8)148-9.)。迄今为止，所发现的腺苷酸激酶数量已不下六十个之多，但是人类的腺苷酸激酶已克隆的还很少。
然而，在本申请之前，还没有人公开或发表过本发明这种新的腺苷酸激酶家族的成员。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸，该多核苷酸编码腺苷酸激酶家族的一个新成员，本发明的腺苷酸激酶被命名为GTP3P。
本发明的另一个目的是提供一种新的人线粒体GTPAMP磷酸转移酶家族成员，该酶被命名为GTP3P蛋白。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的新的人线粒体GTPAMP磷酸转移酶的方法。
本发明还提供了GTP3P基因序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中从1-684位的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的GTP3P蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有GTP3P蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成GTP3P蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；
(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成GTP3P蛋白的重组细胞；(c)在适合表达GTP3P蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有GTP3P蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为751个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于1-684位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“GTP3P蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中1-684位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框1-684位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中1-684位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。还术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人GTP3P相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“GTP3P蛋白多肽”指具有GTP3P蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与人线粒体GTPAMP磷酸转移酶相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GTP3P蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与GTP3P DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GTP3P多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GTP3P多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括GTP3P多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GTP3P多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供GTP3P蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然GTP3P多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括GTP3P多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内GTP3P的表达。
本发明还包括一种可用作探针的核酸分子，该分子通常具有GTP3P多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码GTP3P的核酸分子。
本发明还包括检测GTP3P核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于GTP3P多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对GTP3P DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于GTP3P基因产物或片段。较佳地，指那些能与GTP3P基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制GTP3P蛋白的分子，也包括那些并不影响GTP3P蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的GTP3P基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的GTP3P基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达GTP3P或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断GTP3P功能的抗体以及不影响GTP3P功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用GTP3P基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与GTP3P基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
本发明的人GTP3P核苷酸序列全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按已知方法制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆人载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。当然，通过先合成多个小片段，然后再进行连接而获得序列很长的片段。
在本发明中，GTP3P的cDNA核苷酸序列是如此获得的以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物5′-ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGC-3′和反向引物5′-GCAGCTTCTAAATGCAAGGACTAG-3’，进行PCR，获得751bp的目的片段。经鉴定测序后得到SEQ ID NO.3的全长cDNA序列。
通过同源检索发现，本发明的GTP3P cDNA序列与已发表并确认为腺苷酸激酶(AK)的基因序列高度同源，并且本发明涉及的蛋白具有短链醇脱氢酶家族高度保守的氨基酸序列。进一步的研究表明，本发明与已被发表并确认为牛AK3基因具有高度同源性，而已知牛AK3属于腺苷酸激酶家族的AK3大类。因此，GTP3P基因也属于AK家族的AK3亚类，是牛AK3基因的一个同源基因，并具有相似的功能。
AK家族在生物体中起着维持磷酸核苷酸组成稳定的作用，而在磷酸核苷酸中，最重要的就是腺苷酸(ATP、ADP、AMP)，因此AK家族可以比其它的核苷酸激酶更有效的调节能量代谢。事实上，能量代谢水平上的变化对生物的影响是巨大的，近年来在哺乳动物中发现的大量腺苷酸激酶，它们在不同组织中发挥着作用。它们中的任何一个产生了某种缺陷，就会立即导致整个生物体的能量代谢紊乱，严重的将可能导致多发性神经纤维瘤，还有溶血性贫血(Genomics.1992Jul；13(3)537-42.)。无论在生理上还是病理上，AK家族都已成为人们专注的对象。本发明的GTP3P可以研究有关病症，并为诊断和治疗有关病症提供了有力的武器。
在附图中，

图1为本发明的人GTP3P与牛AK3的核酸序列的同源比较图。其中，相同的核苷酸用“|”标出。
图2为本发明的人GTP3P蛋白与牛AK3蛋白的氨基酸序列的同源比较图。其中，相同的氨基酸在两个序列之间用氨基酸单字符标出，相似的氨基酸用“+”标出。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1GTP3P的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λ gt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGC-3′(SEQ ID NO.1)为正向引物，寡核苷酸A25′-GCAGCTTCTAAATGCAAGGACTAG-3’(SEQ ID NO.2)为反向引物，进行PCR。A1/A2的PCR条件为93℃ 4分钟，随之以93℃ 1分钟、68℃ 1分钟和72℃ 1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，发现目的片断长度为751bp。
2.PCR产物的测序将用A1、A2扩增得到的产物与pGEM-T载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共751bp，详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于1-684位核苷酸。根据得到的全长cDNA序列推导出GTP3P的氨基酸序列，共227个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO.4。
实施例2同源比较和结构研究用GTP3P的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中用BLAST进行核酸和蛋白同源检索。结果发现它与已被发表并确认为腺苷酸激酶(AK)的基因间存在高度同源的序列，并且本发明涉及的蛋白具有腺苷酸激酶家族高度保守的氨基酸序列。进一步的检索表明，其在核酸和蛋白水平上与已被公布的牛AK3基因(核酸和蛋白检索号分别为gb|M25757和sp|P08760)存在同源性，其中它们的核酸序列的CDS间有约85％同一性(又称相同性)(图1)，而其蛋白序列间更有91％同一性，94％相似性(图2)，因此该基因被确认为牛AK3基因的同源基因。
此外，由于牛AK3已被鉴定为腺苷酸激酶家族成员，且GTP3P的蛋白质序列中具有AK家族的严格保守的标志性序列，特别是在GTP3P的氨基酸序列中存在由12个氨基酸组成的被认为是腺苷酸激酶家族(AK)共有的特征性序列——(L/I/V/M/F/Y/W)(L/I/V/M/F/Y/W)(L/I/V/M/F/Y/W)DG(FYI)PRX3(NQ)。。在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是WLLDGFPRTLPQ(SEQ ID NO.4中82-93位)。因此，这进一步证实了本发明的GTP3P属于腺苷酸激酶家族，并且具有腺苷酸激酶家族的相关功能。
牛AK3编码的蛋白已被证实能够在镁离子的存在下催化GTP与AMP之间的磷酸基团转移反应，本发明所涉及的蛋白由于在结构上与牛AK3十分相似，从蛋白质结构决定着功能特异性的生物化学原理，本发明的GTP3P也应有此功能。除此之外，由于GTP3P已被证实属于人类腺苷酸激酶家族，所以推测其还同样具有该家族所具有的一些功能是合理的。如该家族能够在一定条件下参与TCA循环中的底物水平磷酸化，和其他一些磷酸基团的转移反应，而GTP3P也应有此功能。
研究暗示，本发明的新蛋白就是一种人类线粒体基质GTPAMP磷酸转移酶，属于腺苷酸激酶家族的AK3亚类，是早先发现的人类线粒体基质GTPAMP磷酸转移酶的同功酶。其功能则与与其高度同源的牛AK3蛋白及AK家族的其它成员相似，如涉及线粒体中腺苷单磷酸酸(AMP)进一步的磷酸化反应，或与许多过程中的底物水平的磷酸化有关。牛AK3所催化的反应可以用以下方程式来表示MgGTP+AMP  MgGDP+ADP其中MgGTP代表镁离子结合的鸟苷三磷酸，MgGDP代表镁离子结合的鸟苷二磷酸(Genomics.1992 Jul；13(3)537-42.)。该反应是可逆地进行的，但主要发生的是正反应方向的转移。
我们已知道，线粒体是生物体能量代谢最主要的场所，著名的三羧酸循环(TCA)就发生在线粒体基质中，此外还有许多代谢反应都发生在线粒体基质中，可以说线粒体是能量活动最频繁的场所，而如果上述推断正确的话，本发明又是线粒体基质中参与能量转移的关键酶，其重要程度可见一斑。
此外，牛AK3的另一个重要特点是以GTP为底物，而不是常见的ATP。这一点在能量代谢中显得尤为重要，因为在线粒体基质中发生的三羧酸循环(TCA)，会产生鸟苷三磷酸(GTP)，而它并不象最常见的腺苷三磷酸(ATP)那样可以到处通用。相反，过多的GTP积累会影响细胞的正常生长，故而需要将鸟苷三磷酸中的能量转移到腺嘌呤核苷酸上。这也可能是本发明所催化的反应，它可以把糖代谢中产生的GTP能量转化为通用的能量形式，产生的ADP即可进一步用于合成代谢。
由上可知，本发明所涉及的酶极可能处于能量代谢中的关键一环，直接关系到生物的能量平衡。而生物体的能量水平，更直接操纵着生长发育的旺盛程度、神经中枢的兴奋程度、以及免疫力的强弱等一系列重要的生命现象。这样本发明实际上提供了一种从能量水平上来改善患者的机体状况，提高自身免疫力，进而进行疾病治疗的方法。通过对本发明的深入研究，一定能发现它与许多临床病例的关系，并最终为解决这些问题开拓新的思维与方法。
本发明的人GTP3P除了可作为腺苷酸激酶家族一员用于进一步的功能研究，还可用于与其他蛋白一起产生融合蛋白，比如与免疫球蛋白一起产生融合蛋白。此外，本发明人GTP3P还可以与该家族的其他成员进行融合或交换片段，以产生新的蛋白。例如将本发明人GTP3P的N端与牛AK3的N端进行交换，以产生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
针对本发明人GTP3P的抗体，用于筛选该家族的其他成员，或者用于亲和纯化相关蛋白(如该家族的其他成员)。
例如，本发明人GTP3P核酸(编码序列或反义序列)可以被引入细胞，以提高人GTP3P的表达水平或者抑制人GTP3P的过度表达。本发明的人GTP3P蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治疗或减轻因人GTP3P缺失、无功能或异常而导致的有关病症。此外，还可以用基于本发明的核酸序列或抗体进行有关的诊断或预后判断。
实施例3GTP3P在大肠杆菌中的表达在该实施例中，用对应于编码GTP3P的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得GTP3P的cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′TTGGGGATCCATGGGCGCCGGCCGCAGAC-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有BamH1限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的GTP3P编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-CGTCCTGCAGTCATGGAGTAACTGAAGCT-3’(SEQ ID NO.6)该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和GTP3P的编码序列的19个核苷酸。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI和PstI消化pQE-9载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，并测序验证GTP3P的cDNA片段已正确插入了载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)达0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的GTP3P。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱GTP3P。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后的蛋白质被结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小，测得GTP3P的分子量大小约为26kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例4GTP3P在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，用对应于编码GTP3P的cDNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物进行扩增，获得GTP3P cDNA作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5′-TTGGGGATCCATGGGCGCCGGCCGCAGAC-3′(SEQ ID NO.5)该引物含有BamHI限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是由起始密码子开始的GTP3P编码序列的19个核苷酸；
3’端引物序列为5’-CGTCCTGCAGTCATGGAGTAACTGAAGCT-3’(SEQ ID NO.6)该引物含有PstI限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和GTP3P的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen公司)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用BamHI和PstI消化pcDNA3载体以及插入片段，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5 α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，并测序验证GTP3P的cDNA片段已正确插入了载体。
质粒转染CHO细胞是采用脂转染法，用Lipofectin试剂盒(GiBco Life)进行的。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mM Tris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小，测得GTP3P的分子量大小约为26kDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO.4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3和4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组蛋白用层析法进行分离后备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀人GTP3P基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(1)一般信息(i)申请人上海新黄浦复旦基因工程有限公司(ii)发明名称新的人线粒体基质GTPAMP磷酸转移酶、其编码序列及制备方法(iii)序列数目6(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)长度22碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1ATGGGCGCCG GCCGCAGACT GC 22(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ IDNO2GCAGCTTCTA AATGCAAGGA CTAG 24(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征(A)长度751bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.31 ATGGGCGCCGGCCGCAGACTGCTGCGAGCGGTGATCATGGGGGCCCCGGGCTCGGGCAAG61 GGCACCGTCTCGTCGCGCATCAGTACACACTTCGAGCTGAAGCACCTCTCCAGCGGGGAC121 CTGCTCCGGGACAACATGCTGCGGGGCACAGAAATTGGCGTGTTAGCCAAGGCTTTCATT181 GACCAAGGGAAACTCATCCCAGATGATGTCATGACTCGGCTGGCCCTTCATGAGCTGAAA241 AATCTCACCCAGTATAGCTGGCTGTTGGATGGTTTTCCAAGGACACTTCCACAGGCAGAA301 GCCCTAGATAGAGCTTATCAGATCGACACAGTGATTAACCTGAATGTGCCCTTTGAGGTC361 ATTAAACAACGCCTTACTGCTCGCTGGATTCATCCCGCCAGTGGCCGAGTCTATAACATT421 GAATTCAACCCTCCCAAAACTGTGGGCATTGATGACCTGACTGGGGAGCCTCTCATTCAG481 CGTGAGGATGATAAACCAGAGACGGTTATCAAGAGACTAAAGGCTTATGAAGACCAAACA541 AAGCCAGTCCTGGAATATTACCAGAAAAAAGGGGTGCTGGAAACATTCTCCGGAACAGAA601 ACCAACAAGATTTGTCCCTATGTATATGCTTTCCTACAAACTAAAGTTCCACAAAGAAGC661 CAGAAAGCTTCAGTTACTCCATGAGGAGAAATGTGTGTAACTATTAATAGTAAGATGGGC721 AAACCTCCTAGTCCTTGCATTTAGAAGCTGC(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)长度227个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.41 Met Gly Ala Gly Arg Arg Leu Leu Arg Ala Val Ile Met Gly Ala16 Pro Gly Ser Gly Lys Gly Thr Val Ser Ser Arg Ile Ser Thr His31 Phe Glu Leu Lys His Leu Ser Ser Gly Asp Leu Leu Arg Asp Asn46 Met Leu Arg Gly Thr Glu Ile Gly Val Leu Ala Lys Ala Phe Ile61 Asp Gln Gly Lys Leu Ile Pro Asp Asp Val Met Thr Arg Leu Ala76 Leu His Glu Leu Lys Asn Leu Thr Gln Tyr Ser Trp Leu Leu Asp91 Gly Phe Pro Arg Thr Leu Pro Gln Ala Glu Ala Leu Asp Arg Ala106 Tyr Gln Ile Asp Thr Val Ile Asn Leu Asn Val Pro Phe Glu Val121 Ile Lys Gln Arg Leu Thr Ala Arg Trp Ile His Pro Ala Ser Gly136 Arg Val Tyr Asn Ile Glu Phe Asn Pro Pro Lys Thr Val Gly Ile151 Asp Asp Leu Thr Gly Glu Pro Leu Ile Gln Arg Glu Asp Asp Lys166 Pro Glu Thr Val Ile Lys Arg Leu Lys Ala Tyr Glu Asp Gln Thr181 Lys Pro Val Leu Glu Tyr Tyr Gln Lys Lys Gly Val Leu Glu Thr196 Phe Ser Gly Thr Glu Thr Asn Lys Ile Cys Pro Tyr Val Tyr Ala211 Phe Leu Gln Thr Lys Val Pro Gln Arg Ser Gln Lys Ala Ser Val226 Thr Pro(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TTGGGGATCC ATGGGCGCCG GCCGCAGAC 29(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6CGTCCTGCAG TCATGGAGTA ACTGAAGCT 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸1-684位的序列。
4.一种分离的GTP3P蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有GTP3P蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有GTP3P蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成GTP3P蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成GTP3P蛋白的重组细胞；(c)在适合表达GTP3P蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有GTP3P蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸1-684位。
12.一种能与权利要求4所述的GTP3P蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明提供了一种新的人基因核苷酸序列。更具体地说,本发明提供人线粒体基质GTP:AMP磷酸转移酶的cDNA序列以及该序列编码的多肽。 本发明还涉及所述多核苷酸序列和所述多肽的生产方法,以及这些多核苷酸和所述多肽的用途。
文档编号C07K16/18GK1249340SQ98119439
公开日2000年4月5日 申请日期1998年9月28日 优先权日1998年9月28日
发明者余龙, 赵勇, 毕安定, 高洁, 赵寿元 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司