盐地碱蓬耐低磷基因及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物技术领域，更加具体地说，涉及一种盐地碱蓬耐低 磷基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 磷是生物生长发育的重要营养元素之一，是蛋白质、核酸、脂类以及各种重要的小 分子的重要组成成分，在植物新陈代谢过程中扮演着十分重要的角色。然而，磷是一种不可 再生的资源，大部分土壤有效磷含量较低，难以满足植物生长的正常需求。据报道，世界上 至少有30%~40%的作物产量受到低磷胁迫的严重抑制（Runge-MetzgerA.)。农业生产 上，主要通过施用磷肥来解决土壤磷缺乏问题，但是使用的磷肥很容易被土壤固定为作物 不易吸收的难溶性磷，难以完全满足作物对磷的需求。因此，提高植物对磷的吸收和利用 率，创制耐低磷作物品种，对于减少农业磷的施用量，维护生态安全，提高作物的产量等方 面具有重要意义。随着对植物低磷胁迫应答的分子机理研究不断深入，特别是以拟南芥为 研究对象，植物在低磷胁迫条件下的研究取得了突破性的进展。目前，对耐低磷基因的分离 是当前利用基因工程方法进行耐低磷作物培育的首要任务。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种盐地碱蓬耐低磷基因。
[0004] 本发明的第二个目的是提供一种含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。
[0005] 本发明的第三个目的是提供一种含上述重组载体的宿主细胞。
[0006] 本发明的第四个目的是提供一种盐地碱蓬耐低磷基因的应用。
[0007] 本发明的技术方案概述如下：
[0008] 一种盐地碱蓬耐低磷基因，是序列表中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。
[0009] 含上述一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。
[0010] 含有上述重组载体的宿主细胞。
[0011] 一种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用。
[0012] 本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQIDNO. 1 所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟 南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的耐低磷基因能在改良作物耐低磷能力 中应用。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明的盐地碱蓬耐低磷PHT基因克隆电泳示意图。
[0014] 图2是包含本发明的盐地碱蓬耐低磷的基因S.saPHT的表达载体示意图。
[0015] 图3是S.saPHT转基因拟南芥genomicDNAPCR筛选结果。
[0016] 图4是S.saPHT转基因拟南芥T3纯合体半定量PCR结果。
[0017] 图5是S.saPHT转基因拟南芥T3纯合体耐低磷根系实验效果。
[0018] 图6是S.saPHT转基因拟南芥耐低磷实验根系生长情况。
【具体实施方式】
[0019] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0020] 下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
[0021] 实施例1
[0022] 一种盐地碱蓬耐低磷基因的获得
[0023] 使用的植物碱蓬（盐地碱蓬）来源为天津市滨海新区北塘口东海路。
[0024] 首先，以此为原料获取本发明的耐低磷基因（即盐地碱蓬PHT基因的克隆）。
[0025] 取五周新鲜盐地碱蓬植株，使用植物RNeasyPlantMiniKit(Transgene Code#EP101_01 50rxns)提取totalRNA，并且利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS. saesisSuperMix(TransgeneCode#AE301_03lOOrxns)去除基因组DNA干扰，反转录出 cDNA〇
[0026] 根据NCBI数据库中的ArabidopsisthalianaPHT1 :n基因的序列保守区 设计简并引物PHT-5(SEQIDN0.2 所示，5' -GGGTTCTTTACGGATGCCTACGAT-3'）和 PHT-3(SEQIDNO. 3 所示，5' -TCACCGAGCCATCCGAAGAAG-3'），然后利用RACE-PCR技术 (IntrQgen，FirstChoiceRLM-RACEKitwithManual)获得盐地喊蓬PHT基因全长cDNA序 列即PHT基因，将PHT基因进行测序分析，得到完整S.saPHT基因全长为1578bp，如序列表 中SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列，即本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，见图1。
[0027] 根据盐地碱蓬耐低磷基因核苷酸序列设计上下游引物PHT_F(SEQ IDN0.4 所示，5'-TCGACGACTTCCTATCTATGGC-3'）和PHT-R(SEQIDN0.5 所 示，5' -GCCAAAACAATCCTTTCCAGT-3'），利用EasyScriptFirst-StrandcDNASynS.saesis SuperMix(TransgeneCode#AE301_03100rxns)去除基因组DNA干扰，反转录出盐地碱蓬 cDNA，反应PCR程序：42°C30min，85°C5min;4°C，①。
[0028] 利用RACE-PCR技术的具体步骤，如下：
[0029] (1)cDNA第一链的合成，用反转录试剂盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver. 3. 0,以盐 地碱蓬总RNA为模板，01igo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转 录体系如下表所示。反应条件：30°C10min，42°C30min，99°C5min和5°C5min。
[0030]
[0031] (2)盐地碱蓬耐低磷基因反转录质量PCR扩增检测，用盐地碱蓬Actin基因特异引 物进行PCR扩增，以验证反转录反应及RNA质量。PCR反应体系如下表所示。PCR反应条件： 95°C，5min;95°C30s，55°C30s，72°C50s，35cycles;72。(：，lOmin;4。(：，①。引物S.saACT-F 如序列表中SEQIDNo. 6 所示，5' -GTGGTCGTACAACGGTAITGTG-3'，引物S.saACT-R如序列 表中SEQIDNo. 7 所示，5' -GACCTCCAATCCAGACACTG-3'。
[0032]
[0033] (3)盐地碱蓬耐低磷基因片段的PCR扩增，以cDNA为模板，以SEQIDNo. 2、SEQ IDNo.3所示核苷酸为上下游引物，进行PCR反应。反应体系如下表所示。PCR反应条件： 94°C3min;94°C30s, 55°C30s，72°C60s，35cycles;72°C5min;4。(：，①。PCR结束后，取5y1 PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。
[0034]
[0035]
[0036] 对通过RACE技术扩增得到的盐地碱蓬耐低磷基因进行测序分析，得到完整的盐 地碱蓬PHT基因全长为1578bp(SEQIDNo. 1)。
[0037] (4)构建超表达载体时，在SEQIDNo. 4的5'端添加Gateway系统重组位点SEQ IDNo. 8:5' -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3' ；在SEQIDNo. 5 的 5' 端添加Gateway 系统重组位点SEQIDNo. 9:5' -GGGGACCACTITGTACAAGAAAGCTGGGT-3' 分别得到：
[0038]SEQIDNo.10:5'-