专利名称：突变的异戊烯基二磷酸合成酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的合成线性异戊二烯基二磷酸的突变体酶，异戊二烯基二磷酸是对有机体重要的化合物的前体，如甾类化合物、泛醌、多萜醇、类胡萝卜素、异戊二烯基化的蛋白质、动物激素、植物激素等或其基因等等。
在体内具有重要功能的物质中，许多物质是利用异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)作为基础生物合成的。这些化合物称为类异戊二烯、类萜或萜烯，依赖于碳原子数目分为半萜(C5)、单萜(C10)、倍半萜(C15)、双萜(C20)、双半萜(C25)、三萜(C30)、四萜(C40)等等。实际合成以甲羟戊酸途径开始，通过这个途径合成5-二磷酸甲羟戊酸，其后是活性的异戊二烯单位的异戊烯基二磷酸(IPP)的合成。
发现作为推测的前体的异戊二烯单位是IPP，所谓的活性异戊二烯单位。已知IPP的异构体二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)(在异戊烯基腺嘌呤的反应中作为底物，已知它作为细胞分裂素，而且是植物激素之一)可与IPP进行缩合反应以合成线性活性类异戊二烯，如香叶酯二磷酸(GP)、橙花基二磷酸、法呢二磷酸(FPP)、香叶酯香叶酯二磷酸(GGPP)、香叶酯法呢二磷酸(GFPP)、六异戊二烯基二磷酸(HexPP)、七异戊二烯基二磷酸(HepPP)等。
缩合反应有Z-型和E-型。GPP是E-型缩合反应的产物，橙花基二磷酸是Z-型缩合反应的产物。尽管在FPP和GGPP中所有的E-型都被认为是活性形式，Z-型缩合反应导致了在天然橡胶、多萜醇、细菌萜醇(十一萜醇)和植物中发现的不同的聚萜醇的合成。它们被认为利用存在于分子中的焦磷酸和/或碳主链的磷酸酯键能量进行缩合反应以产生作为反应副产物的焦磷酸和/或磷酸盐。
FPP或GGPP作为反应底物导致了异戊二烯基化的蛋白质合成(从FPP或GGPP合成)，这些蛋白质以G-蛋白为代表，在细胞信号转导机制、archaea的细胞膜脂类(从GGPP合成)、作为甾族化合物前体的角鲨烯(从FPP合成)、作为类胡萝卜素前体的八氢番茄红素(从GGPP合成)中起重要作用。从分别具有六和七个异戊二烯单位的HexPP和HepPP到具有10个异戊二烯单位的异戊二烯基二磷酸作为在电子传递系统中起作用的泛醌和甲萘醌(维生素K2)合成的前体。
而且，通过这些活性形式的类异戊二烯的生物合成，合成了下列生命必需的植物种类的化合物。正如刚刚提到的，合成的化合物如下使用半萜作为其合成前体的细胞分裂素和异戊烯腺苷修饰的tRNA的植物激素、作为玫瑰油香料主要组分的单萜香叶醇及其橙花醇异构体、作为杀虫剂的樟脑树提取物樟脑。倍半萜包括昆虫保幼激素，双萜包括植物激素赤霉素、昆虫的追踪(trail)信息素、作为视觉色素前体起作用的视黄醇和视黄醛、嗜盐的archaea的紫膜蛋白的结合组分以及维生素A。
而且，使用角鲨烯(一种三萜)可合成各种甾类化合物，这些化合物包括，例如，动物性激素、维生素D、作为昆虫交配激素的蜕皮素、植物激素芸苔甾内酯以及质膜组分。作为有机体的各种色素和维生素A前体的四萜的各种类胡萝卜素也是衍生自活性类异戊二烯的重要组分。如hlorophyll、脱镁叶绿素、生育酚(维生素E)和叶绿醌(维生素K1)的化合物也衍生自四萜。
将烯丙型底物DMAPP、GPP、FPP、GGPP、GFPP等与IPP连续缩合的活性类异戊二烯合成酶称为异戊二烯基二磷酸合成酶，也可基于最大反应产物的最大链长命名，例如法呢二磷酸合成酶(FPP合成酶)、香叶酯香叶酯合成酶(GGPP合成酶)等等。对酶的纯化、活性测量、基因克隆及其核苷酸测序已有报道，这些酶如得自细菌、archaea、真菌、植物和动物的法呢二磷酸合成酶、六异戊二烯基二磷酸合成酶、香叶酯香叶酯二磷酸合成酶、七异戊二烯基二磷酸合成酶、八异戊二烯基二磷酸合成酶、九异戊二烯基二磷酸合成酶(茄呢醇二磷酸合成酶)、十一异戊二烯基二磷酸合成酶等等。
这些组成在工业和生命科学领域是重要的许多种化合物合成的基础的活性类异戊二烯合成酶由于其不稳定的特征和低特异性活性，对于其工业应用很少引起人们的注意。然而，随着FPP合成酶和GGPP合成酶基因从细菌和archaea中的分离[A.Chen和D.Poulter(1993)，生物化学杂志，26811002-11007，T.Koyama等(1993)，生物化学杂志，113355-363，S.-i，Ohnuma等(1994)，生物化学杂志，26914792-14797]，它们作为酶的可利用率提高了。
如许多报告中所发表的，合成具有20至25个碳的异戊二烯基二磷酸的酶是同型二聚体，而且在体外比较容易反应。然而，合成链长超过上述长度的异戊二烯基二磷酸的酶被认为是异型二聚体，或需要其它因子如脂类等。因此，为了实现其工业应用，必需找出允许两种亚单位或其它因子的再装配的最优条件，这是一项困难的任务。
因此，需要这样一种技术，这种技术通过人工改变衍生自嗜热有机体的同型二聚体异戊二烯基二磷酸合成酶氨基酸序列(稳定且具有高的特异性活性)使同型二聚体的耐热异戊二烯基二磷酸合成酶能合成具有更长链长的异戊二烯基二磷酸。
至于衍生自嗜热有机体的异戊二烯基二磷酸合成酶，目前有衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的改变的FPP合成酶和衍生自嗜酸热硫化叶菌的GGPP合成酶的例子。嗜热脂肪芽孢杆菌的FPP合成酶的突变体酶及其基因基于有机体的颜色变化通过由衍生自噬夏孢欧文氏菌的crtB(八氢番茄红素合成酶的基因)与CrtI(八氢番茄红素去饱和酶的基因，顺反异构酶)和大肠杆菌中的嗜热脂肪芽孢杆菌突变体的FPP合成酶的基因的共存产生的番茄红素选择。GGPP合成酶及它的突变体及其嗜酸热硫化叶菌的基因基于互补酿酒酵母的HexPP合成酶缺陷芽殖酵母的甘油代谢活性的活性来选择。
噬夏孢欧文氏菌的crtB和CrtI基因的共存方法不能用于筛选比突变体酶的GGPP更长的反应产物，使用HexPP合成酶缺陷芽殖酵母酿酒的互补活性的筛选方法不能用于比HexPP更长的反应产物的特异性检测。这些基因组筛选方法有能力克隆具有GGPP、GFPP和HexPP的合成活性的突变体异戊二烯基二磷酸合成酶的基因，但是不能有系统地控制用于延伸反应产物的链长的异戊二烯基二磷酸合成酶的反应产物链长度。关于这一目的的规律也是未知的。
本发明的目的是通过修饰异戊二烯基二磷酸酶的氨基酸残基建立反应产物链长系统控制的规则。更稳定或具有适合于工业应用的高特异性活性的新酶使立即获得突变体酶或其基因(基于上述规则通过修饰氨基酸残基合成具有更长链长的异戊二烯基二磷酸)成为可能。
从突变体嗜酸热硫化叶菌的GGPP合成酶的基因的核苷酸序列的信息可以清楚地知道基于异戊二烯基二磷酸合成酶的氨基酸顺序的分析在两个提出的富含天冬氨酸结构域之外，定位在氨基酸氨基末端富含天冬氨酸结构域保守序列I(DDXX(XX)D)的上游的第五个位置的氨基酸残基参与了反应产物链长的控制。
因此，本发明提供了一种突变体异戊二烯基二磷酸合成酶，其中定位在富含天冬氨酸的结构域DDXX(XX)D(在括号中的两个X可能不存在)的N-末端方向从N-末端的D开始的第五个位置的氨基酸残基被另一个氨基酸取代，其中所说的结构域存在于异戊二烯基二磷酸合成酶的保守区的第二个区域中。
本发明也提供了编码所说的酶的DNA或RNA。
本发明还提供了包含所说的DNA的重组载体，具体来说是表达载体。
本发明还提供了用上述载体转化的宿主。
本发明进一步提供了用于产生具有20个或更多碳的异戊二烯基二磷酸的方法，其特征在于上述酶和选自异戊烯基二磷酸合成酶、二甲基烯丙基二磷酸合成酶、香叶酯二磷酸合成酶、法呢二磷酸合成酶以及香叶酯香叶酯二磷酸合成酶的底物相接触。
本发明进一步提供了用于产生权利要求1至4任一中提出的酶的方法，所说的方法包括培养上述宿主，然后从培养物中收获表达产物。
附图的简要说明
图1是显示获得的19种突变体型BstFPSs(嗜热脂肪芽孢杆FPP合成酶)和野生型BstFPS(样品名为Y)的酶促活性的图表“引物DMAPP”表明DMAPP用作烯丙型底物，“引物GPP”表明GPP用作烯丙型底物，“引物FPP”表明FPP用于烯丙型底物。在命名为A到W的样品中，位置81的取代导入后氨基酸的名称用一字母密码表明。
图2显示了DMAPP用作为烯丙型底物时，突变体BstFPSs反应的脱磷酸产物的TLC展开模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突变。
图3显示了GPP用作烯丙型底物时，突变体BstFPSs反应的脱磷酸产物的TLC展开模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突变。
图4显示了EPP用作烯丙型底物时，突变体BstFPSs反应的脱磷酸产物的TLC展开模式的照片。Y81A至Y81Y代表氨基酸的取代突变。
图5是显示当DMAPP用作烯丙型底物时酶促活性和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图6是显示当GPP用作烯丙型底物时酶促活性和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图7是显示当FPP用作烯丙型底物时酶促活性和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图8是显示当DMAPP用作烯丙型底物时反应产物的平均链长和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图9是显示当FPP用作烯丙型底物时反应产物的平均链长和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图10是显示当FPP用作烯丙型底物时反应产物的平均链长和氨基酸侧链的分子量之间关系的图表。
图11是显示各种异戊二烯基二磷酸合成酶和富含天冬氨酸结构域的区域(I)至(VII)的图表，氨基酸(星号)定位在N-末端方向从其末端的第五个位置。在图中，序列代表法呢二磷酸合成酶氨基酸序列，1是衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌的氨基酸序列，2衍生自大肠杆菌，3衍生自酿酒酵母，4得自大鼠，5得自人。
已经提出在异戊二烯基二磷酸合成酶(在杂二聚物的情况下为一个亚单位)的氨基酸序列中有七个保守区域(Chem等，Protine Science，第3卷，600-607，1994)。也已经知道在五个保守区域中，包含富含天冬氨酸的结构域的区域II保守区域I[DDXX(XX)D](在括号中的两个X可能不存在)。尽管在区域IV也有富含天冬氨酸结构域，用于指定本发明的氨基酸序列修饰区域的富含天冬氨酸结构域存在于区域II，所说的结构域与存在于区域V的富含天冬氨酸的结构域I比较定名为富含天冬氨酸的结构域I。
对于具有以上所述的富含天冬氨酸结构域的异戊二烯基二磷酸合成酶，可以论及的有法呢二磷酸合成酶、香叶酯香叶酯二磷酸合成酶、六异戊二烯基二磷酸合成酶、七异戊二烯基二磷酸合成酶、八异戊二烯基二磷酸合成酶、九异戊二烯基二磷酸合成酶、十一异戊二烯基二磷酸合成酶等。更具体的例子包括嗜热脂肪芽孢杆菌的法呢二磷酸合成酶、大肠杆菌的法呢二磷酸合成酶、酿酒酵母的法呢二磷酸合成酶、大鼠法呢二磷酸合成酶、人法呢二磷酸合成酶、粗糙脉孢菌的香叶酯香叶酯二磷酸合成酶、酿酒酵母的六异戊二烯基二磷酸合成酶等。
通过某些这样的酶的例证的方式，在法呢二磷酸合成酶的氨基酸序列中的区域I至VII和区域II的富含天冬氨酸的结构域I(在方框中)在图11中显示。
本发明适用于具有这些富含天冬氨酸结构域I的异戊二烯基二磷酸合成酶。
按照本发明，定位在富含天冬氨酸的结构域DDXX(XX)D(在括号中两个X可能不存在)的N-末端方向从N-末端的D开始的第五个位置的氨基酸残基被另一个氨基酸取代，其中所说的结构域存在于异戊二烯基二磷酸合成酶的保守区的第二个区域中。这种氨基酸在图11中通过星号指出。取代之后的氨基酸可以是任何不同于原来氨基酸的天然产生的氨基酸。对这样的一个例子提到一种具有这样的氨基酸序列的酶，其中在SEQ ID No1中位置81的酪氨酸被一种天然产生的氨基酸替代。
许多本发明的突变体异戊二烯基二磷酸合成酶与天然异戊二烯基二磷酸相比可合成具有更长链长的异戊二烯基二磷酸。例如，一些可合成具有15个碳的法呢二磷酸的法呢二磷酸合成酶，当修饰进突变体酶时可合成具有30个碳的六异戊二烯基二磷酸。
已经知道即使酶原来的氨基酸序列通过一种或几种氨基酸的添加、缺失和/或取代时，酶可以保留它原来的酶促活性。因此，本发明有意包括除在SEQID No1中提出的氨基酸序列的肽之外，那些包含通过一个或几个(例如多达5或多达10)氨基酸的取代、缺失和/或添加修饰的氨基酸序列并可完成它原来功能的酶。
本发明也提供了编码上述各种突变体酶的基因、包含这些基因的载体(具体来说是表达载体)以及用所说的载体转化的宿主。本发明的基因(DNA)易于获得，例如，可通过使用位点特异性诱变或其它常规方法如PCR等把突变导入编码在SEQ ID No1中提出的天然氨基酸序列的DNA。
而且，一旦确定了合乎需要的酶的氨基酸序列，就可以确定其适当的核苷酸序列，DNA就可按照DNA合成的常规方法化学合成。
本发明还提供了包含如上所述的一种DNA的表达载体、用所说的表达载体转化的宿主以及使用这些宿主产生本发明的酶或肽的方法。
表达载体包含复制起点、表达调节序列等，但是它们与宿主不同。对宿主来说，可以是原核生物，例如，细菌(如大肠杆菌和芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌)以及真核生物，例如，真菌(如酵母，例如酵母属种类，如酿酒酵母，丝状真菌，例如曲霉属，如米曲霉和黑曲霉)、动物细胞(例如，蚕的培养细胞、高等动物的培养细胞如CHO细胞)等等。而且，植物可以用作宿主。
如在实施例中所示，按照本发明在培养用本发明的DNA转化的宿主期间，长链异戊二烯基二磷酸如GGPP、GFPP、Hexpp等可在培养基上积累，可以通过回收以产生它们各自的二磷酸。进而，按照本发明，长链异戊二烯基二磷酸也可以通过使按照本发明产生的突变体异戊二烯基二磷酸合成酶与底物异戊烯基二磷酸和烯丙型底物如法呢二磷酸接触产生。
大肠杆菌用作宿主时，已知宿主在DNA转录mRNA以及从mRNA翻译蛋白质阶段有基因的调节功能。作为调节mRNA合成的启动子序列，已知除了天然产生的序列之外(例如，lac、trp、bla、lpp、PL、PR、ter、T3、T7等等)，还有它们的突变体(例如，lacUV5)、天然产生的启动子在其中人工融合的序列(如tac、trc等等)，它们可用于本发明。
已经知道，核糖体结合位点的序列(GAGG及其类似的序列)和起始密码子之间的距离作为调节从mRNA合成蛋白质的能力的序列是重要的。也已经知道，指导3’端转录终止完成的终止子(例如，Pharmacia市售的包含rrnPT1 T2的载本)通过重组体影响蛋白质合成的效率。
对于可用于本发明的重组载体制备的载体，可以提到不同的依赖于特定应用衍生的载体。例如，可以提到pBR322、pBR327、pKK223-3、pKK233-3、pTrc99以及同时具有衍生自pMB1的复制子的类似物；pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396以及改变可提高拷贝数量的类似物；或pACYC177、PACYC184以及衍生自p15A的复制子；进而，衍生自pSC101、ColE1、R1、F因子等等的质粒。进而，也可以使用可使纯化更容易的融合蛋白质表达载体(如PGEX-2T、pGEX-3X、pMal-cZ)。用作本发明的起始材料的基因的一个例子在日本专利申请6-315572中描述。
进而，除质粒之外，病毒载体如λ噬菌体或M13噬菌体或转座子可用于基因的导入。关于通过pHY300PLK(Takara Shuzo)把基因导入非大肠杆菌的微生物、把基因导入芽孢杆菌属有机体是已知的。这些载体在《分子克隆》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社)，《克隆载体》(P.H.Pouwels，B.E.Enger，Valk，和W.J.Brammar，Elsevier)以及许多制造厂商的目录中描述。
pTrc99是特别优选的，因为它除了氨苄青霉素抗性基因的可选择性标记之外，还具有启动子、调节基因如Ptrc和lacIq、作为核糖体结合位点的序列AGGA、作为启动子的rrnPT1T2以及调节FPP合成酶表达的功能。
编码异戊二烯基二磷酸合成酶的DNA片段的整合(需要时，可整合具有调节所说的插入这些载体的酶的基因表达功能的DNA片段)可使用适当的限制性内切酶和连接酶通过已知的方法进行。这样构建的质粒的具体例子包括，例如，pTV118N-Bst FPS。
作为用于通过这样的重组载体整合的微生物，可以使用大肠杆菌和芽孢杆菌属的微生物。这样的转化也可以使用在《分子克隆》(J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，冷泉港实验室出版社)和《DNA克隆》，I至III卷(D.M.Clover ed.，IRL出版社)中描述的CaCl2方法和原生质体方法进行。
为了产生本发明的突变体酶，培养如上转化的宿主，然后所说的培养物经受盐析、用有机溶剂沉淀、凝胶色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱等以回收和纯化所说的酶。
本发明也提供了利用本发明的酶产生异戊二烯基二磷酸方法。按照这种方法，本发明的酶在培养基(尤其是含水的培养基)中反应，然后从反应培养基回收所需的异戊二烯基二磷酸。作为酶，不仅可使用纯化的酶，而且可以使用半纯化到不同阶段的粗制酶或培养的微生物的生物量的混合物。另外，也可以使用按照常规方法从所说的酶、粗制酶或包含酶的产物制备的固化酶。
作为底物，可以使用具有比所需的异戊二烯基二磷酸的碳数目少5至20(优选的是5)碳的异戊二烯基二磷酸和异戊烯基二磷酸。作为反应培养基，可以使用水或含水的缓冲液，例如Tris缓冲液或磷酸缓冲液等等。
通过使用本发明获得的异戊二烯基二磷酸合成酶反应产物链长调节系统，可使用易于操作的同型二聚物突变体异戊二烯基二磷酸合成酶合成具有更长链长的异戊二烯基二磷酸(其合成迄今为止仅能用杂二聚物型酶进行)。进而，通过使用上述系统修饰定位在具有杂二聚物型异戊二烯基二磷酸合成酶的富含天冬氨酸的结构域的相应亚单位的富含天冬氨酸的结构域I的上游五个氨基酸中的氨基酸残基，就可以期望产生合成具有更长链长的异戊二烯基二磷酸的突变体酶。
在本发明的权利要求和说明书中，氨基酸残基用一字母密码或三字母密码表示A；Ala；丙氨酸C；Cys；半胱氨酸D；Asp；天冬氨酸E；Glu；谷氨酸F；Phe；苯丙氨酸G；Gly；甘氨酸H；His；组氨酸I；Ile；异亮氨酸K；Lys；赖氨酸L；Leu；亮氨酸M；Met；甲硫氨酸N；Asn；天冬酰胺P；Prl；脯氨酸Q；Gin；谷氨酰胺R；Arg；精氨酸S；Ser；丝氨酸T；Thr；苏氨酸V；Val；缬氨酸W；Trp；色氨酸y；Tyr；酪氨酸氨基酸取代以顺序“取代之前的氨基酸残基”、“氨基酸残基的编号”，“取代之后的氨基酸残基”表示。例如，在位置81的酪氨酸残基被甲硫氨酸残基取代的突变表示为Y81M。
实施例现在参考特定的实施例来解释本发明，但是它们不应该理解为以任何方式限制本发明。
实施例1构建包含FPP合成酶的基因的质粒衍生自嗜热脂肪芽孢杆菌的FPP合成酶的基因(下文作为BstFPS)亚克隆进质粒载体pTV118N(可从Takara Shuzo买到)的NcoI-HindIII位点，质粒DNA定名为pTV118N-BstFPS。BstFPS基因可从大肠杆菌JM109(于1991年9月26日在国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术局，Ibalaki，日本进行了国际保藏，保藏号为FERM BP-3581获得。BstFPS基因的全核苷酸序列也在日本专利申请3(1991-253788，T.Koyama等，(1993)生物化学杂志，113355-363，或在遗传信息数据库如GenBank以保藏号D13293发表。因为嗜热脂肪芽孢杆菌也可从各种微生物保藏处如ATCC等得到，BstFPS区域基因的DNA可通过常规的基因克隆方法获得。
实施例2导入突变的寡核苷酸的合成为了导入FPP合成酶基因的突变，设计和合成了下列寡核苷酸引物DNA(Y81X)5’GAT CCA TAC GNN NTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No2)引物DNA(Y81N)5’GAT CCA TAC GAA CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No3)引物DNA(Y81I)5’GAT CCA TAC GAT TTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No4)引物DNA(Y81M)5’GAT CCA TAC GAT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No5)引物DNA(Y81F)5’GAT CCA TAC GTT CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No6)引物DNA(Y81P)5’GAT CCA TAC GCC CTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No7)引物DNA(Y81V)5’GAT CCA TAC GGT GTC TTT GAT TCA TGA TGA TTT G3’(SEQID No8)设计它们以重新导入限制性内切酶BspHI(5’TCATGA3’)的裂解位点并在编码BstFPS的位置81的氨基酸残基的密码子中导入突变。因为密码子的简并性，导入BspHI裂解位点不改变由BstFPS基因编码的氨基酸序列。这用于通过BspHI消化后的琼脂糖凝胶电泳检测取代突变的质粒，因为导入通过取代BstFPS基因位置81的氨基酸残基的突变同时产生了一个新的BspHI裂解位点。
这些引物DNA在37℃下于下述反应培养基中经受30分钟的磷酸化，其后在70℃下变性10分钟10pmol/μl引物DNA2μl10×kination缓冲液 1μl10mM ATP 1μlH2O 5μlT4多核苷酸激酶 1μl其中10×kination缓冲液是1000mM Tris-HCl(pH8.0)，100mM MgCl2以及70mM DTT。
实施例3把取代突变导入对应于BstFPS基因的位置81的氨基酸残基的密码子使用在实施例2中构建的每种引物DNA，按照Kunkel方法把取代突变导入实施例1中制备的质粒中。用从Takara Shuzo购买的Mutan-K试剂盒进行Kunkel方法。实验步骤如试剂盒插入物所述。质粒的取代突变不必用Kunkel方法进行。例如，通过利用聚合成酶链式反应(PCR)的方法可获得相同的结果。
使用在Mutan-K试剂盒中的大肠杆菌CJ236作为宿主细胞，获得了单链DNA，其中在质粒pTV118N-BstFPS中的胸腺嘧啶碱基被脱氧尿嘧啶碱基取代。
这样获得的单链DNA在反应中用作模板，其中用于合成互补链的引物DNA在下列反应溶液中于65℃下处理15分钟，然后通过使链在37℃下维持15分钟退火单链DNA0.6pmol退火缓冲液 1μl引物DNA溶液(实施例2) 1μl水 加至10μl的最终体积其中退火缓冲液是200mM Tris-Cl(pH 8.0)、100mM MgCl2、500mM NaCl以及10mM DTT。
进而，加入25μl的延长(extention)缓冲液、60单位的大肠杆菌DNA连接酶以及1单位的T4 DNA聚合成酶在25℃下进行2小时的互补链合成。延长缓冲液是50mM Tris-Cl(pH 8.0)、60mM乙酸铵、5mM MgCl2、5mM DTT、1mMNAD以及0.5mM dNTP。
反应结束后，向溶液中加入3μl的0.2M EDTA(pH 8.0)，在65℃下经受5分钟的处理以停止反应。
实施例4构建具有其中把取代突变导入对应于BstFPS基因的位置81的氨基酸残基的密码子的基因的重组体按照实施例3，配制的DNA溶液通过CaCl2方法用于来转化大肠杆菌DH5α。替代的方法如电穿孔得出了相同的结果。
通过CaCl2方法获得的转化体平板接种于包含氨苄青霉素和转化体可选择的标记的琼脂平板上，然后在37℃下培养过夜。
在上述获得的转化体中，选择那些在BstFPS编码区具有BspHI裂解位点的取代突变pTV118N-BstFPS质粒。在对应于选择的取代突变的pTV118N-BstFPS质粒的BstFPS基因的位置81的氨基酸残基的密码子邻近的核苷酸序列使用双脱氧方法测定。结果是，获得了包含下列19种取代突变的BstFPS基因的pTV118N-BstFPS质粒突变密码子Y81AGCTY81CTGCY81DGACY81EGAAY81FTTCY81GGGTY81HCACY81IATTY81KAAGY81LCTC
Y81M ATGY81N AACY81P CCGY81Q CAAY81R AGGY81S TCGY81T ACAY81V GTGY81W TGGY81Y(野生型) TAC实施例5突变体BstFPS的活性测量如下所述从包含在实施例4中获得的19个突变体BstFPS基因和一个野生型BstFPS基因的20个转化体制备粗制酶溶液。
离心在2×LB培养基中培养过夜的转化体以收获细胞，然后把细胞悬浮进用于细胞匀浆的缓冲液(50mM Tris-Cl(pH 8.0)、10mMβ-meracptoethanol、1mM EDTA)中。通过声处理匀浆然后以10,000r.p.m在4℃下离心10分钟。上清液在55℃下处理30分钟以灭活得自大肠杆菌的异戊二烯基二磷酸合成酶的活性。进一步在相同的条件下离心，获得的上清液用作粗制酶提取物，在下列的反应溶液中于55℃下反应15分钟[1-14C]-IPP(1Ci/mol) 25nmol烯丙型底物(DMAPP或GPP或FPP) 25nmolTris-Cl(pH 8.5) 50MgCl25mMNH4Cl 50mMβ-mercaptoethanol 50mM酶溶液 50μg水 加至1ml反应结束后，加入3ml的丁醇以把反应产物提取进丁醇层。获得的1ml丁醇层加入3ml的液态闪烁器中以通过闪烁计数器测量放射性。结果在图1中显示。Y81P突变体BstFPS表现出十分低的酶促活性，可以推知是因为这样的事实仅脯氨酸氨基残基衍生自亚氨基酸，因此不能形成α-螺旋或β-折叠(sheet)的结构形式，由此显著地改变了酶自身必需的高级结构。
当加热分层使之浓缩到0.5ml时，通过清除(purging)进入其中的氮气从丁醇层其余部分蒸发溶剂。向浓缩液中加入2ml乙醇和1ml马铃薯酸性磷酸酶溶液(2mg/ml马铃薯酸性磷酸酶，0.5M醋酸钠(pH 4.7))以影响在37℃下的脱磷酸化反应。其后用3ml正戊烷提取脱磷酸化的反应产物。该提取物通过清除氮气以蒸发溶剂而浓缩，然后通过TLC(反相TLC平板LKC18(Whatman)，显色溶剂∶丙酮/水＝9/1)分析。通过生物图象分析仪BAS 2000(富士照相胶卷)分析显色的脱磷酸化反应产物以确定位置和相对放射性。所有反应产物量的比率相同，而放射性的比率变为FPP∶GGPP∶GFPP∶HexPP＝2∶3∶4∶5。当DMAPP用作烯丙型底物时，效果在图2中显示，当GPP用作烯丙型底物时效果在图3中显示，当FPP用作烯丙型底物时效果在图4中显示。
实施例6取代突变的氨基酸残基和反应产物的链长度之间的关系图1和图4显示当使用FPP作为烯丙型底物进行反应时，突变体BstFPSs把IPP转化成具有长于GGPP链长的异戊二烯基二磷酸。在这时，其中氨基酸的侧链是小分子(如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)的取代突变体具有较高的活性，但是其中氨基酸侧链是大的野生型分子(如酪氨酸和色氨酸)的取代突变体显示出较低的活性。
然后，绘出了对于位置81的氨基酸残基，酶促活性对侧链分子量的图(图5、图6和图7)。然而，排除了Y81P取代突变体酶(其中酶促功能失去)。
结果清楚地表明当侧链分子量小时，活性趋于提高(图7)。即使使用代表氨基酸残基大小的非侧链分子量的参数，如可及表面面积(即氨基酸残基暴露的表面面积的参数)[Chothia(1976)，分子生物学杂志，1951-14，B.Lee和F.M.Richads(1971)，分子生物学杂志，55379-400，S.Miller等(1987)，分子生物学杂志，196641]等时，也可观察到这样的趋势。
迄今为止，很少有报告表明在通过导入位点特异性突变(而不筛选如导入的随机突变)对FPP合成酶的催化机制的研究中改变了反应产物的链长。导入单一位点特异性突变可实现本发明获得的反应产物链长的动态控制的事实是完全没有预料到的。
从图5和6中可以看到，当DMAPP和GPP用作烯丙型底物时，在取代突变的氨基酸残基的分子量和酶促活性之间没有明显的关系。这被认为是由这样的事实造成的当FPP用作烯丙型底物时，野生型酶的反应特异性直接反映为酶促活性。使用DMAPP和GPP作为烯丙型底物的特异性是野生型酶固有的，因此只通过酶促活性参数分析趋势是困难的。
因此，反应产物链长的期望值(此值是平均链长)由下列公式获得(反应产物链长的期望值)＝(FPP的比率)×15+(GGPP的比率)×20+(GFPP的比率)×25+(HexPP的比率)×30作出了获得的反应产物链长的期望值对位置81的氨基酶侧链分子量的图。然而，排除了Y81P取代突变体酶(其中酶促功能失去)。从这些图中可以看出即使当烯丙型底物是DMAPP或GPP时，位置81的氨基酸残基的侧链分子量越小，反应产物链长的期望值越大。
使用位置81氨基酸残基的另一种性质进行类似的作图分析时，如作为疏水性参数的Hopp-Woods数值[J.E.Coligan等(1995)，蛋白质科学的当前方案，Johen Wiley和Sons公司]，当FPP用作烯丙型底物时，没有观察到关于反应产物的链长期望值或酶促活性有明显的趋势。进而，即使当使用如易于形成α螺旋结构[J.E.Coligan等(1995)，蛋白质科学的当前方案，Johen Wiley和Sons公司]或易于形成β-折叠结构[J.E.Coligan等(1995)，蛋白质科学的当前方案，Johen Wiley和Sons公司]的参数时，当FPP用作烯丙型底物时，没有观察到关于反应产物的链长期望值或酶促活性的明显关系。本发明第一次阐明负责决定反应产物链长的因素是在富含天冬氨酸的结构域I(DDXX(XX)D)的上游的第五个氨基酸残基的氨基酸残基侧链的大小。
序列表SEQ ID No1序列长度894序列类型核酸链型双链拓扑结构线性分子类型基因组DNA来源有机体嗜热脂肪芽孢杆菌序列GTG GCG CAG CTT TCA GTT GAA CAG TTT CTC AAC GAG CAA AAA CAG GCG48Met Ala Gln Leu Ser Val Glu Gln Phe Leu Asn Glu Gln Lys Gln Ala5 10 15GTG GAA ACA GCG CTC TCC CGT TAT ATA GAG CGC TTA GAA GGG CCG GCG96Val Glu Thr Ala Leu Ser Arg Tyr Ile Glu Arg Leu Glu Gly Pro Ala20 25 30AAG CTG AAA AAG GCG ATG GCG TAC TCA TTG GAG GCC CGC GGC AAA CGA144Lys Leu Lys Lys Ala Met Ala Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Gly Lys Arg35 40 45ATC CGT CCG TTG CTG CTT CTG TCC ACC GTT CGG GCG CTC GGC AAA GAC192Ile Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ser Thr Val Arg Ala Leu Gly Lys Asp50 55 60CCG GCG GTC GGA TTG CCC GTC GCC TGC GCG ATT GAA ATG ATC CAT ACG240Pro Ala Val Gly Leu Pro Val Ala Cys Ala Ile Glu Met Ile His Thr65 70 75 80TAC TCT TTG ATC CAT GAT GAT TTG CCG AGC ATG GAC AAC GAT GAT TTG288Tyr Ser Leu Ile His Asp Asp Leu Pro Ser Met Asp Asn Asp Asp Leu85 90 95CGG CGC GGC AAG CCG ACG AAC CAT AAA GTG TTC GGC GAG GCG ATG GCC336Arg Arg Gly Lys Pro Thr Asn His Lys Val Phe Gly Glu Ala Met Ala100 105 110ATC TTG GCG GGG GAC GGG TTG TTG ACG TAC GCG TTT CAA TTG ATC ACC386Ile Leu Ala Gly Asp Gly Leu Leu Thr Tyr Ala Phe Gln Leu Ile Thr115 120 125GAA ATG GAC GAT GAG CGC ATC CCT CCT TCC GTC CGG CTT CGG CTC ATC 432Glu Ile Asp Asp Glu Arg Ile Pro Pro Ser Val Arg Leu Arg Leu Ile130 135 140GAA CGG CTG GCG AAA GCG GCC GGT CCG GAA GGG ATG GTC GCC GGT CAG 480Glu Arg Leu Ala Lys Ala Ala Gly Pro Glu Gly Met Val Ala Gly Gln145 150 155 160GCA GCC GAT ATG GAA GGA GAG GGG AAA ACG CTG ACG CTT TCG GAG CTC 528Ala Ala Asp Met Glu Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Leu165 170 175GAA TAC ATT CAT CGG CAT AAA ACC GGG AAA ATG CTG CAA TAC AGC GTG 576Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Gly Lys Met Leu Gln Tyr Ser Val180 185 190CAC GCC GGC GCC TTG ATC GGC GGC GCT GAT GCC CGG CAA ACG CGG GAG 624His Ala Gly Ala Leu Ile Gly Gly Ala Asp Ala Arg Gln Thr Arg Glu195 200 205CTT GAC GAA TTC GCC GCC CAT CTA GGC CTT GCC TTT CAA ATT CGC GAT 672Leu Asp Glu Phe Ala Ala His Leu Gly Leu Ala Phe Gln Ile Arg Asp210 215 220GAT ATT CTC GAT ATT GAA GGG GCA GAA GAA AAA ATC GGC AAG CCG GTC 720Asp Ile Leu Asp Ile Glu Gly Ala Glu Glu Lys Ile Gly Lys Pro Val225 230 235 240GGC AGC GAC CAA AGC AAC AAC AAA GCG ACG TAT CCA GCG TTG CTG TCG 768Gly Ser Asp Gln Ser Asn Asn Lys Ala Thr Tyr Pro Ala Leu Leu Ser245 250 255CTT GCC GGG GCG AAG GAA AAG TTG GCG TTC CAT ATC GAG GCG GCG CAG 816Leu Ala Gly Ala Lys Glu Lys Leu Ala Phe His Ile Glu Ala Ala Gln260 265 270CGC CAT TTA CGG AAC GCC GAC GTT GAC GGC GCC GCG CTC GCC TAT ATT 864Arg His Leu Arg Asn Ala Asp Val Asp Gly Ala Ala Leu Ala Tyr Ile275 280 285TGC GAA CTG GTC GCC GCC CGC GAC CAT TAA 894Cys Glu Leu Val Ala Ala Arg Asp His ***290 295SEQ ID No2序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG NNNTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No3序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG AACTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No4序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG ATTTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No5序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA
序列GATCCATACG ATGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No6序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG TTCTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No7序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG CCGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG34SEQ ID No8序列长度34序列类型核酸链型单链拓扑结构线性分子类型合成DNA序列GATCCATACG GTGTCTTTGA TTCATGATGA TTTG3权利要求
1.一种突变的异戊二烯基二磷酸合成酶，其中定位在富含天冬氨酸的结构域DDXX(XX)D(在括号中的两个X可能不存在)的N-末端方向从N-末端的D开始的第五个位置的氨基酸残基被另一个氨基酸取代，其中所说的结构域存在于异戊二烯基二磷酸合成酶的保守区的第二个区域中。
2.按照权利要求1的酶，其中所说的异戊二烯基二磷酸合成酶是法呢二磷酸合成酶、香叶酯香叶酯二磷酸合成酶、六异戊二烯基二磷酸合成酶、七异戊二烯基二磷酸合成酶、八异戊二烯基二磷酸合成酶、九异戊二烯基二磷酸合成酶或十一异戊二烯基二磷酸合成酶。
3.按照权利要求1或2的酶，其中所说的异戊二烯基二磷酸合成酶是耐热的酶。
4.按照权利要求1的酶，其中具有在SEQ ID No1中提出的氨基酸序列的法呢二磷酸合成酶的位置31的酪氨酸被另一种氨基酸取代。
5.按照权利要求1至4中任意一项的酶，其中所说的另一种氨基酸选自酪氨酸、色氨酸、精氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、谷氨酸和丙氨酸。
6.一种编码按照权利要求1至5中任意一项的酶的DNA。
7.一种从按照权利要求6的DNA转录的RNA。
8.一种包含按照权利要求6的DNA的重组载体。
9.一种用按照权利要求8的重组载体转化的宿主有机体。
10.一种产生按照权利要求1至8中任意一项的酶的方法，所说的方法包括培养用包含编码所说的酶的DNA的表达载体转化的宿主，然后从培养物中回收表达产物。
11.一种产生具有20或更多个碳的异戊二烯基二磷酸的方法，其特征在于按照权利要求1至5中任意一项的酶或通过按照权利要求9的方法产生的酶与选自异戊烯基(isopentenyl)二磷酸合成酶、二甲基烯丙基二磷酸、香叶酯二磷酸、法呢二磷酸、香叶酯香叶酯二磷酸的底物相接触。
全文摘要
本发明公开了突变体异戊二烯基(prenyl)二磷酸合成酶的制造或用途,其中定位在富含天冬氨酸的结构域DDXX(XX)D(在括号中的两个X可能不存在)的N－末端方向从N－末端的D开始的第五个位置的氨基酸残基被另一个氨基酸取代,其中所说的结构域存在于异戊二烯基二磷酸合成酶的保守区的第二个区域中。
文档编号C07H21/02GK1199776SQ9711717
公开日1998年11月25日 申请日期1997年7月3日 优先权日1996年7月3日
发明者成田启之, 石田千佳, 竹内由枝, 大音德, 大沼信一, 西野德三 申请人:丰田自动车株式会社