专利名称：用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶，以及用其检测氨基糖苷类抗生素的方法。
背景技术：
自1940年青霉素发现以来，数以千计的抗生素被开发用以传染性疾病的临床治疗，挽救了无数人的生命。但是随着抗生素广泛而大量地使用，许多细菌已经对它的对手产生了耐药性，很多药物不再像以前那样有效，甚至产生毒副作用。2010年8月11日，世界著名医学期刊《柳叶刀》刊文报道，带有一种特殊基因NDM-I (新德里一号金属酶)的肠杆菌科细菌，对绝大多数常用抗生素耐药[Kumarasamy K K，et al.，The Lancet Infectious Diseases,2010,9,597-602, French G L, International Journal of Antimicrobial Agents，2010，36，S3-S7]。该报道立即引起广泛关注，媒体称之为“超级细菌”。随着全球感染人数的不断增加，引起人们对其全球蔓延趋势的担忧甚至恐慌。其实耐药型的细菌并非新事物，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性，在这场特殊博弈中， 人类是超级细菌的幕后推手。抗生素的滥用是一个全球性的问题，特别是中国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。据2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测结果显示，全国医院抗菌药物年使用率高达74%。而在美英等发达国家，医院的抗生素使用率仅为22% 25%。中国的住院患者中，抗生素的使用率则高达70%，其中外科患者几乎人人都用抗生素，比例高达97%。我国每年因药物不良反应死亡20万人，其中因滥用抗生素死亡人数就达8万人 [Andreas H，et al.，The Lancet，2009，373，30]。除了医疗卫生，动植物养殖，食品以及水质、环境中抗生素的滥用也日益严重，其影响不容小觑，特别是动物源性食品中抗生素严重超标，长期食用有抗食品，可在体内积累，抗生素的负作用会使身体器官受损，破坏体内的正常菌群，致使消费者的耐药性在不知不觉中增强，等于在人体内埋下“隐形炸弹”，将来一旦患病，很可能无药可医[Broughton E I，et al.，Food Policy，2010，35，471-478]。瑞典传染病控制研究所的安德里亚斯·赫迪尼(Andreas Heddini)警告说，如果滥用抗生素的势头不能得到有效遏制，人类很可能重返前抗生素时代。世界卫生组织已成立了慎用抗生素联盟，其成员包括90多个国家，各国采取严厉的手段限制使用抗生素。我国主管部门也加强了对抗生素使用的监管，例如，国家药监局规定在零售药店销售必须凭执业医师处方才能销售抗生素类处方药，对食品、水质环境中抗生素类药品所占的比例限定标准；加强药物、食品中抗生素的检测。这些措施在促进抗生素合理使用方面发挥了一定的作用。目前食品、环境中常用的抗生素检测方法为高效液相色谱、串联质谱方法，这些方法比较标准，具有分离能力强和较高的灵敏度，但是都要用到大型昂贵仪器，如色谱仪、质谱仪，且耗时长，技术流程较为复杂，需要专业人员操作，对现场检测，初选来说，很不现实 [Holzgrabe U， et al. ， Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2011，56,271-279]。还有较快速的方法，如酶联免疫法以及微生物检测法，对实验条件要求也比较高，且试剂易受污染，准确度和专属性不高，时间性强等特点，也不理想[Makvandi-Nejad S, et al. , Journal of Immunological Methods, 2010，360，103-118]。因此，一种实时快速、便捷灵敏的抗生素检测方法和便携设备亟待开发，这对于食品安全、环境卫生监管等尤为迫切，将在遏制抗生素滥用方面发挥重要的作用。氨基糖苷类磷酸修饰酶(APH(3’ )-111)是细菌产生的一种钝化酶，共价修饰抗生素的某些特定基团，干扰抗生素和核糖体的结合，从而使抗生素失去药效。它修饰的底物具有广谱性，多达数十种，是一个很好的模型蛋白[Wright G D, Current Opinion in Chmeical Biology,2003,7,563-569, Wieninger S A, Journal of Molecular Biology, 2011，409，450-465]。
发明内容
发明目的本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种用于检测和定量分析抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶。本发明的另一目的在于提供利用这种用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶制备的用于检测抗生素的试剂盒。本发明的再一目的在于提供利用用于检测抗生素的试剂盒进行抗生素的检测和分析的方法，该方法具有检测速度快，操作便捷，灵敏度高的特点，可以满足食品、水质和环境中残留抗生素检测工作的要求。技术方案本发明所述的用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶，是在氨基糖苷类磷酸修饰酶的147-170肽段的巯基上，标记有含有或者修饰巯基的荧光基团作为荧光探针，用于检测卡那霉素、新霉素类抗生素等氨基糖苷类抗生素。发明人经过研究发现，氨基糖苷类磷酸修饰酶对氨基糖苷类抗生素具有比较强的捕获能力，在氨基糖苷类磷酸修饰酶和抗生素底物结合过程中，酶的构象发生改变，特别是位于活性中心的肽段147-170形成的一个柔性loop随着抗生素的结合从活性中心离开，有较大的构象变化。在氨基糖苷类磷酸修饰酶(APH(3’ )-111)的147-170肽段中，有一个自由的巯基(cysl59)，这个残基一旦发生分子间氧化形成二聚体，将会大大削弱酶的活性。因此发明人将含有或者修饰巯基的荧光基团，通过巯基标记在cysl59所在的loop上，形成稳定的二硫键，不仅可以阻止酶分子间氧化形成二聚体，而且可以能够灵敏地检测抗生素，荧光探针强度的变化，可以很好的反应抗生素和酶的结合过程。本发明所述的含有或者修饰巯基的荧光基团可以选择荧光素-5-马来酰亚胺 (Fluorescein-5-maleimide)，其结构式如图 2 所示。将上述制得的用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶，制备成一个用于检测抗生素的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶、ATP和二价金属离子组成的混合溶液，混合溶液为中性，室温，弱还原环境。所述二价金属离子可以为Mg2+，Zn2+, Ca2+或Mn2+。本发明用于检测抗生素的试剂盒中，酶的浓度一般是微摩尔量级，辅因子如ATP 和金属离子是1 1. 5的比例，一般在毫摩尔量级，如ATP为ImM，则金属离子为1. 5mM。本发明所述的检测抗生素的方法，包括如下步骤
(1)在氨基糖苷类磷酸修饰酶的147-170肽段的巯基上，标记含有或者修饰巯基的荧光基团作为荧光探针，如将荧光素-5-马来酰亚胺通过巯基和磷酸修饰酶上cysl59形成稳定的二硫键；在加入抗生素样品之前，荧光探针所在的loop包埋于酶的活性中心，荧光信号比较弱，一旦和抗生素结合，荧光探针所在的柔性肽段被挤出活性中心，暴露在溶剂环境中，荧光信号将大大增强；(2)制备反应体系将步骤⑴制得的标记有荧光基团的氨基糖苷类磷酸修饰酶与ATP和二价金属离子配置成的混合溶液，混合溶液为中性，室温，弱还原环境；(3)将一系列不同浓度的已知氨基糖苷类抗生素样品分别加入步骤( 制得的反应体系，根据产生的荧光信号强度不同，制定抗生素浓度和荧光强度的标准曲线；本步骤中，通过荧光检测装置检测荧光信号强度，使用标记荧光基团的特征激发光源和发射波段， 如荧光素-5-马来酰亚胺，其中激发光源为494nm，检测波长为515nm ；(4)将待测样本溶液加入到步骤( 制得的反应体系中，记录荧光信号的变化；(5)将步骤(4)的荧光信号和步骤(3)制定的标准曲线对比，判断待测样品中氨基糖苷类抗生素的残留及定量分析。步骤(3)中，抗生素浓度与荧光强度的标准曲线公式为
权利要求
1.一种用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶，其特征在于在氨基糖苷类磷酸修饰酶的147-170肽段的巯基上，标记有含有或者修饰巯基的荧光基团作为荧光探针。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶传感器，其特征在于所述含有或者修饰巯基的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。
3.一种用于检测抗生素的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所述的用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶、ATP和二价金属离子组成的混合溶液，混合溶液为中性，室温， 弱还原环境。
4.根据权利要求3所述的用于检测抗生素的试剂盒，其特征在于所述二价金属离子为 Mg2+，Zn2+，Ca2+或 Mn2+。
5.根据权利要求3所述的用于检测抗生素的试剂盒，其特征在于所述用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶的最终浓度为100 300 μ Μ，所述ATP的最终浓度为ImM，所述二价金属离子的最终浓度为1. 5mM。
6.一种检测抗生素的方法，其特征在于包括如下步骤(1)在氨基糖苷类磷酸修饰酶的147-170肽段的巯基上，标记含有或者修饰巯基的荧光基团作为荧光探针；(2)制备反应体系将步骤(1)制得的标记有荧光基团的氨基糖苷类磷酸修饰酶与ATP 和二价金属离子配置成的混合溶液，混合溶液为中性，室温，弱还原环境；(3)将一系列不同浓度的已知氨基糖苷类抗生素样品分别加入步骤(2)制得的反应体系，根据产生的荧光信号强度不同，制定抗生素浓度和荧光强度的标准曲线；(4)将待测样本溶液加入到步骤( 制得的反应体系中，记录荧光信号的变化；(5)将步骤(4)的荧光信号和步骤C3)制定的标准曲线对比，判断待测样品中氨基糖苷类抗生素的残留及定量分析。
7.根据权利要求6所述的检测抗生素的方法，其特征在于步骤(3)中，抗生素浓度与荧光强度的标准曲线公式为
全文摘要
本发明公开一种用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶，在氨基糖苷类磷酸修饰酶的147-170肽段的巯基上，标记有含有或者修饰巯基的荧光基团作为荧光探针。本发明还公开用上述用于检测抗生素的氨基糖苷类磷酸修饰酶制备的用于检测抗生素的试剂盒以及检测方法。本发明检测方法较目前常用的色谱法、质谱法以及酶联免疫等方法，具有检测速度快，操作便捷，灵敏度高等特点，是一种极具吸引力的抗生素检测方法。
文档编号C12N9/00GK102391997SQ20111026007
公开日2012年3月28日 申请日期2011年9月5日 优先权日2011年9月5日
发明者刘全俊, 吴宏文, 孙峰, 武灵芝, 陆祖宏 申请人:东南大学