一种中性低温木糖苷酶CaXyl43A及其基因和应用
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性低温木糖苷酶CaXyl43A及其基因和应用。其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，本发明的木糖苷酶的具有以下性质：最适pH6.8，最适温度35℃，在0℃保持酶活，比活为181.6U/mg；具有木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和外切木聚糖酶的活性；具有一定的木糖耐受性和完全降解木寡糖生成木糖的能力；且易于工业化发酵生产。做为一种新型的广谱酶制剂,可广泛用于水产饲料、食品、造纸、能源工业等。
【专利说明】
一种中性低温木糖苷酶CaXy 143A及其基因和应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种中性低温木糖苷酶CaXy 143A 及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 木聚糖(xylan)是植物生物质的主要成分，在自然界中的含量仅次于纤维素 (Lynd et al .Microbiology and Molecular Biology Review,2002,66:506-577)，其有效利用具 有重要的意义。木聚糖的生物降解需要木聚糖酶(EC 3.2.1.8)将多聚糖切割成木寡糖，再 由木糖苷酶（EC 3.2. 1.37)进一步将木寡糖降解生成木糖（Collins et al.FEMS Microbiology Review 2005,29:3-23)。因此木糖苷酶在木聚糖降解过程中起着限速酶的 作用，可以减轻木聚糖酶的产物抑制作用（De Almeida et al .FEMS Microbiology Letters 1995,130:171-175)。多种微生物，包括细菌、古细菌、真菌等，都可以产生木糖苷 酶，且木糖苷酶多为胞内酶，因此在生物能量转化方面也起着重要的作用 (Saha.Bioresource Technology,2003,90:33-38；Jordan and Wagschal.Applied Microbiology and Biotechnology, 2010,86:1647-1658)。基于氛基酸序列和催化域的结 构，木糖苷酶划分在糖苷水解酶第3、39、43和52家族(111^?://?〇^.〇327.〇找/^17(3〇81(16-hydrolases .html)。第43家族的木糖苷酶数量多，且一般具有多种活性，因此在工业领域中 具有更广泛的应用前景。
[0003] 丝状真菌易于培养、含有多种木糖苷酶编码基因而成为木糖苷酶的理想来源。大 多数丝状真菌来源的木糖苷酶都是中温或高温酶，在环境温度或低温条件下丧失酶活。开 发中性低温的木糖苷酶在节约能源、保护环境、易于催化反应等方面具有重要的意义。
[0004] 尽管真菌来源的木糖苷酶已广泛应用于不同的工业领域，获得新型具有优良特性 的中性低温木糖苷酶仍具有重大的研究意义与应用价值。克隆和异源表达中性低温木糖苷 酶，为生物降解、饲料、食品和造纸工业提供经济有效、环境友好的候补酶，是木糖苷酶应用 于工业化生产所必需的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种能高效应用的中性低温木糖苷酶。
[0006] 本发明的再一目的是提供编码上述中性低温木糖苷酶的基因。
[0007] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组载体。
[0008] 本发明的另一目的是提供包含上述基因的重组菌株。
[0009] 本发明的另一目的是提供一种制备上述中性低温木糖苷酶的基因工程方法。
[0010] 本发明的另一目的提供上述中性低温木糖苷酶的应用。
[0011 ] 本发明从枝孢菌(Cladosporium acalyphae SL-16)中分离得到一种新的中性低 温木糖苷酶CaXyl 43A。
[0012]上述中性低温木糖苷酶CaXyl43A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] SEQ ID NO.1：
[0014] MTDPTQKDPSPIVTHLFTADPSAHVFNGKLYVYPSHDRETDIQDNDNGDQYDMNDYHVFSMPNVEGPVTDHGIALKA SDIPWVDKQLWAPDAAEKNGKYYLYFPARDKEGIFRIGVAVADQPEGPFKPDENYIPGSYSIDPASFVDDDGQAYLY FGGIWGGQLQCWRTGEFKRDAYSTMEAD⑶EPALMPRVAKLSDDMHTFSSDVQDLWNDTDGKPIHASKHDRRFFEA AffMHKYQGKYYFSYSTGDTHYLAYAI⑶SPLGPFTYQDRILEPVKGWTTHHSIAEFKGKWYLFYHDTSISGKNHLRC VKIREIVYDEQGKIKLAQPQE
[0015] 其中，该酶基因编码329个氨基酸，N端无信号肽序列，理论分子量为37.6kDa。
[0016] 本发明的木糖苷酶CaXy143A在中性(pH 6.5-6.8)和中低温(30-40°C )范围内均具 有高活性的特性。本发明筛选到Cl ado sporium aca lyphae SL-16所产生的木糖苷酶 CaXy 143A，其最适pH值为6.8，在pH6.5~7.2的范围内维持70%以上的酶活性;最适温度为 35°C，在30-40°C间均具有80%以上的酶活力；在(TC条件下还有酶活;具有木糖苷酶、阿拉 伯呋喃糖苷酶和外切木聚糖酶的活力。这种性质的中性低温木糖苷酶还未曾有过报道。
[0017] 本发明提供了编码上述中性低温木糖苷酶CaXyl43A。具体地，该基因的基因组序 列如SEQ ID NO.2所示：
[0018] atgaccgaccctacacagaaagaccccagcccgatcgtcacccatctcttcacagctgaccccagcgctcacgtctt caatggcaagctctacgtctacccttcccacgacagggagaccgacatccaggacaacgacaatggcgaccagtatg acatgaacgactaccacgtcttctccatgcccaatgtggaaggccccgtcaccgaccacggcatcgccctcaaggca tcagatatcccatgggtggataagcagctctgggcacccgatgctgcggagaagaacggcaaatactacctctactt ccccgccagagacaaggagggtatcttcagaatcggtgttgctgtcgccgaccagcctgagggacctttcaagcccg acgagaactacatccccggcagctacagcatcgaccccgccagctttgttgacgatgacggccaggcctacctttac ttcggcggtatctggggtggtcagetgcagtgctggcggaccggcgagttcaagcgcgacgcctactcgaccatgga agccgacggcgacgaacccgctctcatgcctcgcgtggccaaactgagcgacgacatgcacaccttctccagcgacg tgcaggacctcgtcgtcaacgacaccgacggcaagccgatccacgccagcaagcacgaccgccgcttcttcgaggcc gcgtggatgcacaagtaccagggcaaatactacttctcatactccaccggcgacacccactacctcgcatacgccat tggcgactctccactcggacccttcacataccaggacagaatcttggagcctgtcaaaggctggacgacgcaccact ctattgcggagttcaagggcaagtggtacttgttctaccacgacacgagcatctcgggcaagaaccacttgcgctgc gtcaagatcagggagatcgtgtacgatgagcagggcaagatcaagttggcgcagccgcaggagtag
[0019] 本发明通过PCR的方法分离克隆了木糖苷酶基因 Caxyl43A，DNA全序列分析结果表 明，木聚糖酶Caxy 143A结构基因全长990bp，没有内含子。
[0020] 成熟蛋白理论分子量为37.6kDa。所述CaXyl43A是一种新的木糖苷酶。
[0021] 本发明还提供了包含上述中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组载体，优选为 pET30-Caxyl43A。将本发明的木糖苷酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间， 使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案， 优选为将本发明的木糖苷酶基因插入到质粒pET30(a)上的NdeI和EcoRI限制性酶切位点之 间，使该核苷酸序列位于T7启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达质粒pET30-Caxyl43A〇
[0022] 本发明还提供了包含上述中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组菌株，优选所述 菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、曲霉或木霉，优选为重组菌株PET30/ Caxyl43A〇
[0023] 本发明还提供了一种制备中性低温木糖苷酶CaXyl43A的方法，包括以下步骤：
[0024] 1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0025] 2)培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；以及
[0026] 3)回收并纯化所表达的木糖苷酶CaXyl43A。
[0027] 其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆 菌细胞(Escherichia coli)BL21，得到重组菌株pET30/Caxyl43A。
[0028] 本发明还提供了上述中性低温木糖苷酶CaXyl43A的应用。
[0029] 本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，获得中性低温木糖苷酶 的菌物资源，提供一种性质优良的、适合于在饲料、食品、工业中应用新的中性低温木糖苷 酶。本发明的木糖苷酶最适pH为6.8，在pH6.5~7.2都有较高的酶活性;在中性范围内pH稳 定性好;比活力为181.6U/mg;具有宽泛的底物特异性。其中性低温的特点，可降低木糖苷酶 在工业生产上的能源成本。其宽泛的底物特异性可以提高降解效率，增加木聚糖的利用率。 还可以在常温条件下，将生物质降解的木寡糖转化为有价值的可发酵的木糖。因此，本木糖 苷酶在多个产业可以与木聚糖酶协同作用，完全降解木聚糖。
【附图说明】
[0030] 图1在大肠菌中表达的重组木糖苷酶的SDS-PAGE分析，其中，1:纯化的重组木糖苷 酶;M:低分子量蛋白质Marker。
[0031] 图2重组木糖苷酶的最适pH。
[0032] 图3重组木糖苷酶的pH稳定性。
[0033]图4重组木糖苷酶的最适温度。
[0034]图5重组木糖苷酶的热稳定性。
[0035]图6重组木糖苷酶的木糖耐受性。
【具体实施方式】
[0036] 试验材料和试剂
[0037] 1、菌株及载体:本发明从枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16。大肠杆菌表达 载体pET30(a)及菌株BL21。
[0038] 2、酶类及其它生化试剂：内切酶购自TaKaRa公司，连接酶购自Invitrogen公司。对 硝基苯基-β-D-木糖（pNPX)、对硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖（pNPAf)和榉木木聚糖购自 Sigma公司，其它都为国产试剂(均可从普通生化试剂公司购买得到）。
[0039] 3、培养基：
[0040] (I )Cladosporium acalyphae SL-16培养基为马铃薯汁培养基：1000 mL马铃薯汁， IOg葡萄糖，25g琼脂，ρΗ5·0。
[0041 ] (2)大肠杆菌培养基LB(1 %蛋白胨、0.5 %酵母提取物、1 % NaCl，pH7.0)。
[0042]说明：以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书 进行。
[0043] 实施例1 枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16产酶特性
[0044] 将枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16经马铃薯汁培养基培养后，制成孢子悬 液，接种于鼓皮液体培养基中（Luo et al .Enzyme Microbial Technology,2009,45:126-133)，15°(：培养7(1，以111^的对硝基苯基-|3-0-木糖为底物，在？!16.0和30°(：条件下反应10min，以分光光度计法确定其具有木糖苷酶活性。
[0045] 实施例2枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶编码基因 Caxyl43A的 克隆
[0046] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16基因组DNA:
[0047]将液体培养3天的菌丝体用无菌滤纸过滤放入研钵中，加入2mL提取液，研磨5min， 然后将研磨液置于50mL离心管中，65°C水浴锅裂解20min，每隔IOmin混匀一次，在4°C下 1000 Orpm离心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于 室温静置5min后，4 °C下1000 Orpm离心10min。弃上清，沉淀用70 %的乙醇洗涤两次，真空干 燥，加入适量TE溶解，置于-20 °C备用。
[0048] 设计合成特异引物 Caxyl43A_F/Caxyl43A_F:
[0049] Caxy143A-F：5'-atgaccgaccctacacagaaagacc-3'；
[0050] Caxy143A-R：5'-ctactcctgcggctgcgccaacttg-3'；
[0051 ] 以枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参 数为：94°C变性5min;然后94°C变性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸60sec，30个循环后72 °C保温lOmin。得到一约990bp片段，将该片段回收后与pEASY-T3载体相连送三博生物技术 有限公司测序。
[0052] 实施例3枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶基因的RT-PCR分析
[0053] 提取枝抱菌Cladosporium acalyphae SL-16的总RNA，利用反转录酶得到cDNA的 一条链，然后以引物Caxy 143A-E-F/Caxyl43A-E-F扩增该单链cDNA，获得木聚糖酶的cDNA序 列，扩增得到产物回收后送三博生物技术有限公司测序。
[0054] Caxy143A-E-F：5'-atgaccgaccctacacagaaagacc-3'；
[0055] Caxyl43A-E-R：5'-ggggaattcctagtggtggtggtggtggtgctcctgcggctgcgccaacttg-3，；
[0056] 通过比较木糖苷酶的基因组序列和cDNA序列后发现该基因没有内含子，编码329 个氨基酸和一个终止密码子，无信号肽序列，分离克隆得到的编码木糖苷酶的基因为新基 因。
[0057]实施例4重组木糖苷酶的制备。
[0058] 将表达载体pET30(a)进行双酶切（Nedl+EcoRI)，同时将编码木糖苷酶的基因 Caxyl43A双酶切(Nedl+EcoRI)，切出编码木糖苷酶的基因片段与表达载体pET30(a)连接， 获得含有枝孢菌Cladosporium acalyphae SL-16木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组质粒 pET30-Caxyl43A并转化大肠杆菌BL21，获得重组大肠杆菌菌株pET30/Caxyl43A。
[0059] 取含有重组质粒的BL21菌株，接种于IOOmL LB培养液中，16°C150rpm振荡培养12h 后，加入0.6% IPTG诱导IOh，收集细胞，超声波破碎，离心收集上清液。测定木糖苷酶的活 力。重组木糖苷酶的表达量为0.86U/mL。SDS-PAGE结果（图1)表明，重组木糖苷酶在大肠杆 菌中得到了表达。所表达的木糖苷酶经过纯化之后，其蛋白质的含量达到总蛋白的15%以 上。
[0060] 实施例5重组木糖苷酶的活性分析
[0061] 分光光度计法（Shao et al .Applied and Environmental Microbiology ,2011， 77:719-726):具体方法如下：在pH6.8,35°C条件下，ImL的反应体系包括IOOyL适当的稀释 酶液，900yL ImM的对硝基苯基-β-D-木糖，反应10min，冷却后405nm测定OD值。1个酶活单位 (U)定义为在给定的条件下每分钟释放出Iymol对硝基苯的酶量。
[0062]实施例6重组木糖苷酶CaXyl43A的性质测定
[0063] 1、重组木糖苷酶CaXy 143A的最适pH和pH稳定性的测定方法如下：
[0064] 将实施例4纯化的重组木糖苷酶在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适pH。底 物对硝基苯基-β-D-木糖用不同pH的0.1m 〇l/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中30°C下进行木 糖苷酶活力测定。结果（图2)表明，CaXy 143A的最适pH为6.8，在pH6.5~7.2的范围内，酶活 性均维持在最大酶活性的60%以上。木糖苷酶于上述各种不同pH的缓冲液中30°C处理 6〇min，再在 PH6.8缓冲液体系中35 °C下测定酶活性，以研究酶的pH耐性。结果（图3)表明木 糖苷酶在pH 5.0-8.0之间均很稳定，在此pH范围内处理60min后剩余酶活性在70 %以上，这 说明此酶pH稳定性较好。
[0065] 2、木糖苷酶的最适温度及热稳定性测定方法如下：
[0066]木糖苷酶的最适温度的测定为在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液(pH6.8)缓冲液体系 及不同温度下进行酶促反应。耐温性测定为木糖苷酶在不同温度下处理不同时间，再在 pH6.8、35°C下进行酶活性测定。酶反应最适温度测定结果（图4)表明其最适温度为35°C。酶 的热稳定性性试验表明（图5 )，重组酶在30 °C时稳定性良好。40 °C下保温60min，丧失80 %的 酶活。
[0067] 3、木糖苷酶的1值测定方法如下：
[0068] 用不同浓度的对硝基苯基-β-D-木糖为底物，在柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 (pH6.0)缓冲液体系中，20 °C和35 °C下测定酶活性，计算出其在20 °C和35 °C下的Km、Vmax、kcat 和kcat/Km值。经测定，此木糖苷酶在35 °C下以对硝基苯基-β-D-木糖为底物的km值为2.73mg/ mL，最大反应速度Vmax为272.4ymol/min · mg，kcat值为 175.2/s和kcat/Km值为67.4ml/mg · s; 在20°C下以对硝基苯基-β-D-木糖为底物的km值为0.69mg/mL，最大反应速度V max*58.1μ mol/min · mg，kcat值为37.4/s和kcat/Km值为54.1ml/mg · s
[0069] 4、不同金属离子化学试剂对CaXyl43A酶活的影响测定如下：
[0070] 在酶促反应体系中加入不同浓度的不同的金属离子及化学试剂，研究其对酶活性 的影响，各种物质终浓度为5mmo 1/L。在35 °C、pH6.8条件下测定酶活性。结果(表1)表明，部 分离子和化学试剂在浓度为5mmol时对重组木糖苷酶的活力有明显影响，包括Ni 2+、C〇2+、Mn2 +、Cu2+、Pb2+、Zn2+、Ag.、SDS 和 EDTA。
[0071] 表1.各种化学试剂对木糖苷酶CaXyl43A活力的影响
[0074] 5、CaXyl43A的底物特异性
[0075] 在酶促反应体系中加入不同的底物，研究CaXy 143A的酶活性。在35 °C、pH6.8条件 下测定酶活性。结果(表2)表明，CaXyl43A同时具有木糖苷酶、阿拉伯呋喃糖苷酶和外切木 聚糖酶的活性。
[0076] 表2.CaXyl43A的底物特异性
[0078] 6、CaXyl43A的木糖耐受性
[0079] 在酶促反应体系中加入0-400mM的木糖和4mM或5mM的对硝基苯基-β-D-木糖，研究 CaXy 143A的木糖耐受性。在35°C、pH6.8条件下测定酶活性。结果（图6)表明，CaXy143A的木 糖耐受性Ki值为44.3mM。
[0080] 7、CaXyl43A木糖苷酶降解木寡糖的产物分析如下：
[〇〇811 在500yL 5mM的木寡糖(木二糖至木六糖）中加入IOOyL纯化的酶液，最适温度下保 温12h。用无水乙醇将酶蛋白沉淀，上清液用2500色谱仪，利用高效阴离子交换色谱-脉冲安 培(HPAEC-PAD)检测方法，进行产物中糖种类的分析。分析结果表明：CaXyl43A可以完全降 解木寡糖，生成唯一的产物:木单糖。
【主权项】
1. 一种中性低温木糖苷酶CaXyl43A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. -种中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A，其特征在于，编码权利要求1所述的中性低温 木糖苷酶CaXyl43A。3. 如权利要求2所述的中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A，其特征在于，其碱基序列如 SEQIDN0.2**。4. 包含权利要求3所述中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组载体。5. 包含权利要求2所述中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组载体pET30-Caxyl43A。6. 包含权利要求2所述中性低温木糖苷酶基因 Caxyl43A的重组菌株。7. 如权利要求6的重组菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌、乳 酉支杆囷、曲霉或木霉。8. -种制备中性低温木糖苷酶CaXyl43A的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株； 2) 培养重组菌株，诱导重组木糖苷酶表达；以及 3) 回收并纯化所表达的木糖苷酶CaXy 143A。9. 权利要求1所述中性低温木糖苷酶CaXyl43A的应用。
【文档编号】C12N15/56GK105861471SQ201610342316
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】姚斌, 马锐, 柏映国, 黄火清, 罗会颖, 苏小运, 王亚茹, 王苑, 师霞
【申请人】中国农业科学院饲料研究所