一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌的制作方法

本发明涉及一种表达l.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术：

蔗糖磷酸化酶(ec2.4.1.7，sucrosephosphorylase,spase)，是gh13家族中的一员，是催化转移葡萄糖苷键的特异性酶。主要催化2种类型的反应：一是将1-磷酸葡萄糖中的葡萄糖基转移至受体；二是将蔗糖中的葡萄糖基转移至受体，受体包括无机磷酸、水、含酚羟基、醇羟基及羧基的物质。当以酚羟基作为受体时转化产物为α-熊果苷。α-熊果苷作为一种国际上正在极力推广的高功效医药、化妆品添加剂，在国内外有巨大的需求，在化妆品美白祛斑领域占据重要的地位。据调研α-熊果苷的市场价值约每公斤3800元，而其原料对苯二酚的市场价值约66元每公斤，所以α-熊果苷是一种高附加值的产物，如果能够实现产业化生产将会带来非常大的经济收益。蔗糖磷酸化酶还可催化合成某些不稳定物质的衍生物，提高其稳定性。因此，蔗糖磷酸化酶在食品、化妆品及医药方面有广泛的应用价值。

蔗糖磷酸化酶属胞内酶，酶的基因主要来源于肠膜明串珠菌(leuconostocmesenteroides)、变异链球菌(streptococcusmutans)、嗜糖假单胞菌(pseudomonassaccharophila)、长双歧杆菌(bidifobacteriumlongum)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)。目前l.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶只在大肠杆菌中获得异源表达，但是大肠杆菌容易产生内毒素，不适合应用于医药、化妆品等行业。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明首次以适于食品使用的枯草芽孢杆菌为宿主菌构建了重组表达l.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶菌株，电泳结果显示蔗糖磷酸化酶获得了高水平表达，为α-熊果苷的工业化制备奠定了基础。

本发明的第一个目的是提供一种重组表达l.mesenteroides来源蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖磷酸化酶的氨基酸序列如seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以保藏编号为cctccm2016536的枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)168为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pbsmul3。

本发明的第二个目的是提供所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将编码氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因与表达载体连接，转入枯草芽孢杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述编码氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括保藏编号为cctccm2016536的枯草芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌168。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pbsmul3。

在本发明的一种实施方式中，所述重组枯草芽孢杆菌的构建方法具体如下：

1)扩增编码氨基酸序列如seqidno.1所示的蔗糖磷酸化酶的基因；

2)将克隆出的目的基因连接到pmd-18t，构建成为重组载体pmd-18t-sp，转化至e.colijm109进一步克隆，酶切后将目的基因连接到表达载体pbsmul3，命名为pbsmul3-sp。

3)将重组质粒pbsmul3-sp通过电转化进入枯草芽孢杆菌表达宿主，获得重组表达蔗糖磷酸化酶的枯草芽孢杆菌基因工程菌。

本发明的第三个目的是提供所述枯草芽孢杆菌在生产蔗糖磷酸化酶中的应用，所述应用是将所述枯草芽孢杆菌接种至发酵培养基中，于30～35℃，200～250rpm培养24～72h。

本发明的第四个目的是提供所述枯草芽孢杆菌在生产α-熊果苷中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用是将所述的枯草芽孢杆菌培养24～48h后的发酵液离心得到粗酶液；以摩尔比为1:1～8的对苯二酚和蔗糖为底物，按5000～10000u/g底物的添加量加入酶液，于30～35℃，ph6.8～7.2反应12～48h。

本发明的第五个目的是提供一种蔗糖磷酸化酶，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供所述基因工程菌在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明以食品准入的枯草芽孢杆菌为宿主构建了表达l.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶的重组枯草芽孢杆菌，酶活达162.19u/ml，应用该重组酶生产α-熊果苷，其在30℃下反应24小时，然后在40℃下用糖化酶处理3小时时底物转化率达83.6％，为α-熊果苷的工业化制备奠定了基础。

附图说明

图1重组质粒pbsmul3-sp的构建过程图；

图2pmd18t-sp双酶切验证图；从左至右，泳道1为5000marker，2-3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证；

图3pbsmul3-sp重组质粒的双酶切验证图；从左至右，泳道1为10000bpmarker，泳道2～3为蔗糖磷酸化酶连接表达载体酶切验证；

图4pbsmul3-sp重组菌摇瓶发酵sds-page电泳图，泳道1～3为13h胞外上清、13h破壁上清、13h破壁沉淀；泳道4为中分子量蛋白marker，泳道5～7为24h胞外上清、24h破壁上清、24h破壁沉淀；泳道8～10为43h胞外上清、43h破壁上清、43h破壁沉淀；

图5最高转化率的酶转化hplc色谱图。

具体实施方式

枯草芽孢杆菌bacillussubtilis(保藏编号为cctccm2016536)已在申请号为201611025858.9的专利申请中公开。

酶活的测定方法：将1ml5％的蔗糖溶液和0.9ml的50mmol/l，ph6.7的磷酸缓冲液充分混匀，在30℃预热10min，加入100ul的酶液，反应10min后加入3mldns，煮沸7min迅速冷却，加蒸馏水定容至15ml，540nm下测吸光度(以灭活的酶液为催化剂同样操作作为空白对照)。

酶活定义：将每分钟水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个单位的酶活力(u)。

产物的hplc检测：最终反应体系中的α-熊果苷的量采用hplc来确定。色谱条件为：采用hplc(高效液相色谱法)进行产物分析具体色谱条件是:agilent1200hplc色谱仪器，agilent自动进样器，agilentsb-aq5μm(4.6mm×250mm)，agilentlc-9a紫外检测器系统；流动相按照80％(体积分数)的10mm的稀磷酸-20％甲醇溶液的配方配置，流动相的流速为0.6ml·min^-1；紫外检测波长为281nm，用c-18柱和糖柱分别测定样品中α-熊果苷和单糖和多糖的含量，柱温35℃。

α-熊果苷的转苷效率d的计算公式为：

d(％)＝m1/m2*100％

其中：

d：对苯二酚转化为α-熊果苷的摩尔转化率(％)；

m1：酶转化反应中生成的α-熊果苷的摩尔数(mol)；

m2：投入到反应液中的对苯二酚的摩尔数(mol)。

实施例1：肠膜明串珠菌蔗糖磷酸化酶编码基因的克隆及表达载体的构建

按图1的流程进行表达载体的构建，根据合成的蔗糖磷酸化酶基因设计引物f、r：

f：5’-gcgaagcttaaggaggatattatggaaattcagaacaaggc-3’

r：5’-gcgggatccttaattctgggtcagattatcgc-3’

所述限制性酶切位点加下划线的字母表示。pcr体系为：20μm引物f和r各0.5μl，dntpmix4μl，5×psbuffer10μl，2.5u/μl的primestar聚合酶0.5ul，模板0.5μl，加双蒸水补齐50μl。pcr条件：94℃预变性4min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸1min50s，30个循环。将pcr产物进行胶回收、加a纯化后与克隆载体pmd-18t连接，酶切回收目的基因将其与表达载体pbsmul3进行双酶切，并于16℃连接过夜，转化e.colijm109，涂布含有氨苄(100μg/ml)抗性的lb平板，37℃培养10-12h，挑取转化子，提取重组质粒并双酶切验证。如图3所示，酶切后有两条片段，大小分别为7000bp左右(表达载体pbsmul3)和1473bp(蔗糖磷酸化酶)即连接成功。然后对验证正确的重组质粒测定dna序列，阳性克隆子即pbsmul3-sp。

实施例2：重组质粒pbsmul3-sp的转化

1)新鲜lb平板(lb固体培养基：蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l，0.2g/l琼脂粉)挑枯草芽孢杆菌bacillussubtilis(保藏编号为cctccm2016536)单菌落接种于5mllb液体培养基中，37℃，200rpm培养10h。

2)取2.5ml转接入40ml加0.5m的山梨醇lb培养基，37℃，200rpm震荡培养四个小时。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，4℃，离心5min收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液(山梨醇0.5m，甘露醇0.5m，葡萄糖10％)洗涤菌体，5000rpm，4℃，离心5min去上清，如此漂洗4次。

5)将洗涤后的菌体重悬于1ml电转培养基中，分装到1.5mlep管中，每管装300μl感受态细胞。

6)将300μl感受态细胞中加入10μl重组质粒，冰浴孵育15min，加入预冷的电转杯(2mm)中，电击一次。电转仪设置：2.4kv，25uf，200ω，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基rm(山梨醇0.5m，甘露醇0.38m，蛋白胨10g/l，酵母膏5g/l，nacl10g/l)吹吸，37℃，200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养，挑取菌落至lb卡那霉素培养基中，进行验证，酶切后表达载体和目的基因条带大小一一对应即验证正确，然后进行摇瓶发酵产酶。

实施例3:摇瓶发酵产酶

将实施例2中得到的重组枯草芽孢杆菌菌株接种于lb培养基中，在37℃下培养8h后以5％接种量转接至tb发酵培养基中，先放至37℃、200rpm恒温培养2h，再移至33℃恒温培养48h产酶。发酵结束后，离心收集上清液即为粗酶液。

lb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母膏5，nacl10。

tb培养基(g/l)：蛋白胨10，酵母粉24，甘油5，k2hpo4·3h2o16.43，kh2po42.31。

对粗酶液中的酶活进行测定，结果显示，酶活力为136u/ml。蛋白电泳结果显示在53kda处有一条与理论分子量一致的条带(图4)。

实施例4：酶转化法制备α-熊果苷

在50ml的密闭的容器中进行10ml的酶转化体系。以对苯二酚为受体分子，蔗糖作为供体进行spase转糖基反应。反应体系包括：在20mm磷酸钠缓冲液(ph7.0)中加入供受体的摩尔比例为4:1的蔗糖和hq以及7500u/g对苯二酚的spase，将其在30℃下反应24h。沸水浴中加热5min终止反应。然后在40℃下用糖化酶处理3h并进一步加热灭活，离心并通过hplc分析产物。当反应结束后转化率可达83.64％，色谱峰见图5。

实施例5

采用实施例1～3相同策略构建重组枯草芽孢杆菌，区别在于，将宿主替换为枯草芽孢杆菌168，经检测，酶活达113u/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种表达l.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>490

<212>prt

<213>肠膜明串珠菌leuconostocmesenteroides

<400>1

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151015

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