专利名称：新颖的氨基糖苷类抗生素、其制造方法及其医药用途的制作方法
新颖的氨基糖苷类抗生素、其制造方法及其医药用途相关申请的交互参照本专利申请基于并要求2007年11月30日提交的在先日本专利申请号 310618/2007的优先权益，所述文献的全部内容通过引用方式完整地并入本文作为参考。
背景技术：
本发明涉及新颖的氨基糖苷类抗生素、其制造方法及其医药用途。
背景技术：
氨基糖苷类抗生素是含有氨基糖或氨基环醇的糖苷类抗生素的总称并且不包括 这样一组抗生素如大环内酯类、核苷类和蒽环类。迄今为止，已经从放线菌或细菌的培养物 发现了许多种氨基糖苷类抗生素。它们当中，链霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、核糖霉 素、妥布拉霉素等已经作为有用的化疗药广泛使用。另一方面，这些氨基糖苷类抗生素在临 床实践中的广泛使用已经导致氨基糖苷类抗生素耐受细菌出现的问题。卡那霉素(卡那霉素A、卡那霉素B和卡那霉素C)是由卡那霉素链霉菌 (Streptomyces kanamyceticus)产生的氨基糖苷类抗生素。卡那霉素具有广谱抗微生物活 性。然而，因为多种感染性细菌迅速变得耐受卡那霉素，近年来，卡那霉素的临床适用限于 某些疾病，主要是结核病。在卡那霉素中，已经基于对耐药机制的研究开发了也有效对抗耐药细菌的卡那霉 素衍生物如地贝卡星、阿米卡星和阿贝卡星。然而，耐受这些药物的细菌正在出现。在这种 情况下，期望开发有效对抗耐药细菌并可以降低肾毒性的新颖的氨基糖苷类抗生素，其中 所述的肾毒性是常见于氨基糖苷类抗生素的问题。就包含2-脱氧链霉胺作为一种构成糖的氨基糖苷类抗生素而言，已经在通过获 得2-脱氧链霉胺依赖性地产生氨基糖苷类抗生素的突变菌株、添加2-脱氧链霉胺类似 物至该突变菌株并培育混合物而产生新颖的氨基糖苷类抗生素方面进行了研究。同样 在卡那霉素方面，报道了通过获得具有2-脱氧链霉胺依赖性卡那霉素产生表型的突变 菌株、添加2-表链霉胺至该突变菌株并培育混合物而产生与卡那霉素不同的抗生素(US 3，669，838)。另外，报道了通过添加1_N_甲基-脱氧链霉胺或肌醇二胺_1，3 (2-表链霉 胺)至具有2-脱氧链霉胺依赖性卡那霉素产生表型的突变菌株并培育该混合物而产生 4-0- ( α -D-吡喃葡糖基)6-0- (3-氨基_3_脱氧-α -D-吡喃葡糖基)I-N-甲基_2_脱氧链 霉胺或4-0- ( α -D-吡喃葡糖基)6-0- (3-氨基_3_脱氧-α -D-吡喃葡糖基)2_表-链霉 胺的报道(Kojima，M.和 Satoh，A./‘Journal of Antibiotics'^ 日本)，1973，第 26 卷，第 784-786页)。另外，存在通过添加链霉胺至具有2-脱氧链霉胺依赖性卡那霉素产生表型 的突变菌株并培育该混合物而产生4-0- (6-氨基-6-脱氧-α -D-吡喃葡糖基)6-0- (3_氨 基-3-脱氧_ α -D-吡喃葡糖基)链霉胺(LL-BM27 α )和4_0_ (6_氨基_6_脱氧-α -D-吡 喃葡糖基)6-0_(a-D-吡喃葡糖基)链霉胺(LL_BM27i3)的报道(Borders，D. B.等人， "Journal ofAntibiotics”，(日本)，1982，第 35 卷，第 1107-1110 页)。这里，LL_BM27a 与2-羟基卡那霉素A同义。
通过添加所述物质和培育混合物所得到的氨基糖苷类抗生素的量是如此之小，以 至所述氨基糖苷类抗生素的工业实用性低。因此，可以说仍需要临床有用并具有强力抗微 生物活性的新颖的氨基糖苷类抗生素。发明概述本发明人现已经发现可以通过将衍生自链霉菌属(Str印tomycin)的产卡那霉素 菌株与特定的2-脱氧链霉胺类似物一起培育而产生具有强力抗微生物活性的新颖的氨基 糖苷类抗生素。本发明已经基于这种发现而形成。因此，本发明的一个目的是提供具有强力抗微生物活性的新颖的氨基糖苷类抗生 素和其制造方法。根据本发明，提供了氨基糖苷类抗生素，它们是由式⑴所代表的化合物或它们 的可药用盐或它们的溶剂合物。 其中R代表氨基或羟基。根据本发明的另一个方面，提供了用于制造由式(I)所代表化合物的方法，该方 法包括在包含链霉胺和/或肌醇的培养基中培育链霉菌属的产卡那霉素菌株以产生此化 合物。本发明的化合物具有针对引起多种感染性疾病的细菌的强力抗微生物活性并且 可以有利地用于治疗感染性疾病。另外，本发明的制造方法可以简单且稳定地供应以上化 合物。发明详述鍾本发明的菌株卡那霉素链霉菌-DOS在独立行政法人产业技术综合研究所专利生 物保藏中心(〒305-8566日本茨城县筑波市东1 丁目1番地1中央第6)的保藏号FERM BP-11052下保藏，原始保藏日期为2007年11月1日。定义如本文中所用的术语“2-羟基卡那霉素A”指在卡那霉素A的2位导入羟基的化 合物。术语“2-羟基卡那霉素”指在卡那霉素(卡那霉素A、卡那霉素B和卡那霉素C)的2 位导入羟基的一组化合物。具体而言，这组化合物包括2-羟基卡那霉素A、2-羟基卡那霉 素B和2-羟基卡那霉素C。另外，如本文中所用，“脱氧链霉胺依赖性”的产卡那霉素菌株指在产卡那霉素细 菌当中可以通过添加脱氧链霉胺而恢复产生卡那霉素的能力的突变菌株。如本文中所用的“具有功能上等同于...的活性”或“具有功能上等同的活性”的 多肽指以下多肽。
在多肽中，除了编码所述多肽的基因的多态性或突变之外，还可以出现氨基酸序 列方面例如通过修饰反应所产生的结构突变。然而，已知尽管存在这些突变，但是某些多肽 具有与没有突变的多肽基本上相同的生理学和生物学活性。尽管存在结构上的不同但在功 能上没有大的不同的多肽称为“具有功能上等同的活性”的多肽。由式(I)代表的化合物或它们的可药用盐或它们的溶剂合物由本发明式(I)代表的化合物的一个特征是已经在卡那霉素B或C的2位导入羟 基。具有该结构的化合物具有范围从革兰氏阳性细菌至包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)在内的革兰氏阴性细菌的广的抗微生物谱并且具有强力抗微生物活性。根据本发明的一个实施方案，在由式(I)代表的化合物中，R代表氨基。该化合物 (下文中称作“羟基卡那霉素B”)具有由式(1)代表的结构。 根据本发明的另一个实施方案，在由式(I)代表的化合物中，R代表羟基。该化合 物(下文中称作“2-羟基卡那霉素C”)具有由式(2)代表的结构。 由式(I)代表的化合物可以作为盐存在。此类盐包括例如可药用盐。其具体例 子包括氢商酸盐如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐或氢碘酸盐；无机酸盐如硫酸盐、磷酸盐、高 氯酸盐或碳酸盐；羧酸如乙酸、三氯乙酸、三氟乙酸、羟乙酸、乳酸、柠檬酸、酒石酸、草酸、苯 甲酸、扁桃酸、丁酸、马来酸、丙酸、甲酸或苹果酸的盐；氨基酸如藻酸、天冬氨酸或谷氨酸的 盐；或磺酸如甲磺酸或对甲苯磺酸的盐。优选氢商酸盐如盐酸盐和无机酸盐如硫酸盐。由式(I)代表的化合物或其可药用盐可以作为它们的溶剂合物存在。优选的溶剂 合物包括水合物、甲醇合物或乙醇合物。牛产菌株由式(I)代表的化合物可以通过多种方法制造。例如，如上所述，可以通过在包含 链霉胺和/或肌醇的培养基中培育链霉菌属的产卡那霉素菌株制造由式(I)代表的化合 物。此类适合的生产菌株的例子包括脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株。更优选其中催化2-脱氧链霉胺生物合成中来自葡萄糖-6-磷酸的第一反应的2-脱氧青蟹肌糖合酶已 经失活的链霉菌属菌株。令人惊讶的是当此类菌株与脱氧链霉胺类似物一起培育时，可以 选择性地产生本发明的化合物，而不产生卡那霉素。因此，根据本发明的又一个方面，提供了能够产生由式(I)所代表化合物的链霉 菌属的产卡那霉素菌株，其中2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活。可以例如通过处理从链霉菌属衍生的产卡那霉素菌(包括卡那霉素链霉菌)例如 通过人工突变方法(包括紫外线(UV)辐射或亚硝基胍(NTG))获得突变性生产菌株。可 以例如通过获得脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株、随后通过常规方法(Kudo. F.等人， "Journal of Antibiotics”(日本)，1999，第52卷，第81-88页)测量每个突变菌株中胞 内2-脱氧青蟹肌糖合酶的活性并且选择无酶活性的突变菌株而证实获得了所需的突变菌 株。就其中2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活的产卡那霉素菌株而言，已经阐明了编码 2_脱氧青蟹肌糖合酶的基因(日本专利申请公开号173537/2004)。因此，也可以通过基因 重组技术获得所需的突变菌株。例如，可以通过破坏编码2-脱氧青蟹肌糖合酶的基因获得 所需的突变菌株。另外，可以通过制备具有引起2-脱氧青蟹肌糖合酶无活性的氨基酸置 换的突变基因并将该突变基因经基因置换作用置换染色体上的野生型基因而获得突变菌 株。该基因可以由放线菌(Actinomyces)中常用的方法(实用链霉菌遗传学(“Practical Streptomyces Genetics) "The John Innes Foundation，，(英国)，Norwick, 2000 年，第 311-338页)破坏或置换。通过引用的方式并入该文献的公开内容。例如，可以提到其中在SEQ ID No. 1所代表合酶的氨基酸序列第136位置处的天 冬氨酸被天冬酰胺置换的突变作为失活2-脱氧青蟹肌糖合酶的突变的一个例子。因此，可 以通过整合编码具有该突变的多肽的基因或编码功能上等同于所述多肽的类似物的基因 至菌株中获得能产生由式(I)所代表化合物的菌株。根据本发明的优选实施方案，能够产生由式(I)所代表化合物的产卡那霉素菌株 是其中已经整合了编码多肽的基因的菌株，所述多肽选自以下多肽(a)至(c)(a)由SEQ ID No. 1所代表的氨基酸序列中具有第136位置处的天冬氨酸改变成 天冬酰胺的突变的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中所定义氨基酸序列中置换、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸的氨 基酸序列组成的多肽，所述多肽具有功能上等同于(a)中所定义多肽的活性；和(c)由与(a)中所定义氨基酸序列具有80%或更多同源性的氨基酸序列组成的多 肽，所述多肽具有功能上等同于(a)中所定义多肽的活性。可以提到卡那霉素链霉菌-DOS作为与(a)对应的合适的产卡那霉素菌株的例子。在(b)中，“一个或多个氨基酸”优选地是1至40个氨基酸，更优选是1至8个氨 基酸，仍更优选是1至4个氨基酸。在(d)中，同源性优选地不小于90%，更优选地不小于95%。另外，当考虑稳定产生由式⑴代表的化合物时，优选地，(b)或(C)中所述的多 肽具有在(a)中所述氨基酸序列第136位置或与第136位置对应的位置处的天冬氨酸已经 改变成天冬酰胺的突变。突变在(a)至(c)中所述氨基酸序列中的存在或不存在和序列同 源性的确定可以由本领域普通技术人员通过常规方法比较SEQ ID No. 1所代表的氨基酸序列与(a)至(c)中的氨基酸序列恰当地确定。(b)或(c)中所述多肽与(a)中所述多肽之间的功能等同性可以根据Kudo，F.等 人，“Journal of Antibiotics”(日本)，1999，第52卷，第81-88页中描述的上述方法，通 过测量这两种多肽的2-脱氧青蟹肌糖合酶活性并比较测量结果而证实。另外，可以通过实 施例2或试验例1中描述的方法，通过测量产卡那霉素菌株的脱氧链霉胺依赖性或抗微生 物活性而间接证实这种功能等同性，其中所述的产卡那霉素菌株具有整合至其中的编码所 述多肽的基因。制造方法如上所述，可以通过在包含选自链霉胺和肌醇的2-脱氧链霉胺类似物的培养基 中培育从链霉菌属衍生的产卡那霉素菌株而产生由本发明式(I)代表的化合物。当考虑选择性产生由式(I)代表的化合物时，如上所述，从链霉菌属衍生的产卡 那霉素菌株优选地是其中2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活的产卡那霉素菌株。然而，也可以 使用其中2-脱氧青蟹肌糖合酶未失活的产卡那霉素菌株。2-脱氧青蟹肌糖合酶未失活的 合适菌株的例子包括卡那霉素链霉菌。此外，在本发明的制造方法中，可以通过考虑所需构思的化合物的类型恰当地确 定产卡那霉素菌株和添加至培养基的2-脱氧链霉胺类似物的组合。根据本发明的一个实施方案，产卡那霉素菌株是2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活 的菌株，并且培养基包含链霉胺。根据该实施方案，由式(I)代表的化合物可以连同2-羟 基卡那霉素A—起产生。这是有利的，因为可以同时产生2-羟基卡那霉素(2-羟基卡那霉 素A至C)。进一步地，根据本发明的另一个实施方案，产卡那霉素菌株是2-脱氧青蟹肌糖 合酶已经失活的菌株，并且培养基包含肌醇。根据该实施方案，可以选择性地产生2-羟基 卡那霉素C，它是由其中R代表羟基的式(I)代表的化合物。链霉胺或肌醇的添加量可以根据培育条件恰当地变动，不过优选地是100至 50，000 μ g/ml，更优选地是 1，000 至 10，000 μ g/ml。可以恰当地添加常规物质作为本发明制造方法中培养基的成分。除了链霉胺和肌醇之外的本文中可用培养基成分还包括例如，碳源如葡萄糖、蔗 糖、淀粉糖浆、糊精、淀粉、甘油、糖浆，动物油或植物油；和氮源如大豆粕、小麦胚芽、玉米 浆、棉籽粕、肉膏、聚胨、麦芽提取物、酵母提取物、硫酸铵、硝酸钠和脲。另外，根据需要，添 加钠、钾、钙、镁、钴、氯、磷酸(例如，磷酸氢二钾)、硫酸(例如，硫酸镁)和可以产生其他离 子的无机盐也是有效的。此外，根据需要，也可以添加多种维生素如硫胺素(例如，盐酸硫 胺素)、谷氨酸(例如，谷氨酸钠)、氨基酸如天冬酰胺(例如，DL-天冬酰胺)、微量营养物 如核苷酸和选择药物如抗生素。此外，可以恰当地添加辅助细菌生长并促进2-羟基卡那霉 素B和2-羟基卡那霉素C产生的有机物和无机物。培养基的pH优选地是大约pH 5. 5至pH 9。培育可以通过固体培养法、振摇培养法、通气搅拌培养法或有氧条件下的深度好 气培养法实施。在这些方法中，优选深度好气培养法。例如，15°C至40°C适合作为培养温度。然而，在许多情况下，在约25°C至35°C的温 度培育细菌。所产生的由式(I)代表的化合物的量根据所用的培养基、培养条件和培养方法变动，但是例如在2日至15日达到最大量。优选地，当培养基中由式(I)代表的化合物的量达到最大时，停止培养。随后从培 养物回收并纯化该化合物。为了从培养物收获本发明的化合物，可以使用利用该化合物特性的常规分离方 法。分离方法可以是例如溶剂提取法、离子交换树脂法、吸附或分配柱层析、凝胶过滤法、透 析法、沉淀法和结晶法，单独地或以适宜组合使用。例如，过滤培养物以产生滤液。随后将 滤液吸附在阳离子交换树脂如Amberlite IRC-50或Amberlite FPC3500上，并用氨水实施 洗脱。洗脱物进一步用阳离子交换树脂如Dowex 50W或Amberlite CG-50纯化并且根据需 要通过采用Dowex 1的离子排阻层析法或通过采用HP20ss的吸附层析法纯化，因此可以分 离由式(I)代表的每种2-羟基卡那霉素。皿本发明的化合物具有强力抗微生物活性并且用作药物施用至动物，包括人。因此， 根据本发明的又一方面，提供了包含由式(I)所代表化合物或其可药用盐或其溶剂合物的 药物组合物。该组合物优选地用作抗微生物剂。根据本发明的另一个方面，提供了由式(I)所代表的化合物或其可药用盐或它们 的溶剂合物在制造药物组合物中的用途。仍根据本发明的另一个方面，提供了由式(I)所 代表的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物在制造抗微生物剂中的用途。当本发明的化合物用作药物组合物时，可以根据不同的施用形式或使用形式由常 规方法制剂该药物组合物。用于经口施用的制剂包括片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、液 体剂、混悬剂、糖浆剂和舌下剂。用于肠胃外施用的制剂包括注射剂、经皮吸收剂、吸入剂或 栓剂。在制剂中恰当地使用药物添加剂如表面活性剂、赋形剂、稳定剂、湿润剂、崩解剂、溶 解助剂、张力调节剂、缓冲剂、着色剂和着香剂。可药用载体可以用作药物组合物的载体。可以根据施用途径和施用方法恰当地确 定载体的类型和组成。例如，本文中可用的液体载体包括水、醇、大豆油、和芝麻油。固体载 体的例子包括糖类如麦芽糖和蔗糖、氨基酸类如赖氨酸、多糖类如环糊精、有机酸盐如硬脂 酸镁、和纤维素衍生物如羟丙基纤维素。具有抗微生物活性的本发明化合物优选地用于治疗或预防感染性疾病。因此，根 据本发明的又一方面，提供了用于治疗或预防感染性疾病的方法，包括施用有效量的由式 (I)代表的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物至动物，包括人。如本文中所用的术语 “治疗”意指改善已建立的疾病状态，并且如本文中所用的术语“预防”意指防止疾病状态在 将来建立。本发明的化合物可以应用至引起多种感染性疾病的细菌。引起感染性疾病的细 菌包括例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、肠球菌属(Entercoccus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、铜绿假单 胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌属 (Salmonella)或不动杆菌属(Acinetobacte)。优选金黄色葡萄球菌、大肠杆菌或铜绿假单 胞菌。当由式(I)代表的化合物是2-羟基卡那霉素B时，引起感染性疾病的细菌优选地 是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌属、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属，更优选地是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌属、大肠杆菌、 枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属，仍更优选地是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属。当由式(I)代表的化合物是2-羟基卡那霉素C时，引起感染性疾病的细菌优选地 是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属，更 优选地是表皮葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属，仍更优选地 是表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、沙门氏菌属或不动杆菌属。本发明化合物的有效量可以由医师考虑具体条件例如患者的年龄、体重、疾病的 类型和严重性和施用途径恰当地确定。当该化合物经口地施用至人时，例如，该化合物可以 例如以每位成人每日0. 01至1000mg/kg的剂量施用。另一方面，当该化合物静脉内施用时， 此化合物可以以每位成人每日0. 001至100mg/kg的剂量施用。
实施例本发明进一步由以下实施例说明，所述实施例不意图限制本发明。在以下实施例中，LC/MS分析在以下条件下实施。LC/MS的分析条件(HPLC 部分Waters 2690)柱CapcellPak C18MG，4. 6x150mm，5 μ M(由 Shiseido 有限公司制造)。流动相Α 0. 2%五氟丙酸水溶液B 乙月青C =H2O线性梯度0分钟(A/B/C = 10/10/80) — 15 分钟(A/B/C = 10/30/60)流速0.4ml/ 分钟，温度30°C(MS 部分Waters ZQ) ESI 法离子源温度100°C去溶剂化温度380°C去溶剂化气体流速350L/小时锥形气体流速50L/小时毛细管电压3.5kV锥形电压正电压30V实施例1 构建用于导入卡那霉素链霉菌2-脱氧青蟹肌糖合酶基因(Orfll)突变 的质粒PDDOI就2-脱氧青蟹肌糖合酶(SEQ ID No. 1)而言，将第136位置处的天冬氨酸改变 成天冬酰胺以失活酶蛋白，其中所述的天冬氨酸作为对结合葡萄糖-6-磷酸底物重要的 氨基酸残基是保守的。使用pKM9(见日本专利申请公开号173537Λ004，实施例2，FERM P-19117)作为模板，通过PCR反应制备。在SEQ ID No. 2中显示所用的卡那霉素生物合成簇区域。使用以下引物，即包括Hind III或XbaI消化位点的引物和已被设计从而将从DOI 合酶基因的起始密码子起算的第136位置处的天冬氨酸(GAT)突变成天冬酰胺(AAC)的引物。Km-Mu-Hind III5，-GGGAAGCTTGACCTTGGAGGTATGTGT-3，(SEQ ID No. 3)Km-Mu-L5，-eiICAGCATGGCCACCACGGTGGT-3，(SEQ ID No. 4)(加下划线部分代表导入突变的部分)Km-Mu-R5，-TCGGTGCTCTCGCTCAAGCAG-3，(SEQ ID No. 5)Km-Mu-Xba I5，-GGGTCTAGATGCCGTCCTGGTGGTAGT-3，(SEQ ID No. 6)使用Km-Mu-Hind III (SEQ ID No. 3)与 Km-Mu-L(SEQ ID No. 4)引物组合和 Km-Mu-R(SEQ ID No. 5)与 Km-Mu-Xba I (SEQ ID No. 6)引物组合实施 PCR 反应。使用约 1 μ g基因组DNA、0. 3 μ M每种引物和(由Τ0Υ0Β0有限责任公司制造的)K0D plus DNA聚 合酶在94°C /2分钟(94°C /15秒、50°C /30秒和68°C /1. 5分钟)x25个循环的条件下实 施该反应。结果，分别特异性扩增出约1.5kbp DNA片段。各DNA片段由(QIAGEN K. K.制 造的)QIAquick PCR纯化试剂盒纯化。将平末端磷酸化(NIPPON GENE有限责任公司制)， 并且磷酸化的DNA片段分别用HindIII和Xba I消化，随后克隆到pUC119的Hind III和 Xba I位点中。分析所克隆DNA片段的碱基序列，从而确认了 DNA片段含有具有插入其中的 所构思天冬酰胺置换的2-脱氧青蟹肌糖合酶(Orfll)基因(SEQ ID No. 7)。用于放线菌接合转移的质粒pSET152(Bierman，M.等人，“Gene”(荷兰)，1992， 第116卷，第43-49页)用Sph I消化并以T4 DNA聚合酶平端化。随后连接(由TAKARA SHUZO Co. ,LTD.制造的)Hind III 接头以构建 pSET153。来自 pSET153 的约 2. 8kbp Hind III-Xba I片段与含有经历过氨基酸置换的基因的约3kbp Hind III-Xba I片段连接，以获 得具有接合转移能力的用于导入orfll基因突变的质粒pDDOI。实施例2 通过用于导入orfll基因突变的质粒pDDOI创建不产生脱氧链霉胺的 碰作为产卡那霉素细菌的卡那霉素链霉菌涂布在MS琼脂培养基(2% S大豆粉、2% 甘露醇、2%琼脂)上并在28°C培育3日。在培育后，用3ml的20%甘油刮取菌丝并收集菌 丝以制备宿主的菌丝液。另一方面，携带质粒pDDOI的大肠杆菌ET12567/pUZ8002菌株接种到含25 μ g/ml 氯霉素、25 μ g/ml卡那霉素和50 μ g/ml阿泊拉霉素的IOOmlLB液体培养基(1 % Difco细 菌用胰蛋白胨、0.5% Difco酵母提取物、0.5% NaCl、和0. 葡萄糖)中并在37°C培育过 夜以制备预培养物。将此培养物接种至与预培养相同的液体培养基中，从而预培养物的终 浓度是1%，随后在37°C培育约4小时。将培养物用LB液体培养基洗涤2次并最终重悬于 IOml的LB液体培养基终以制备大肠杆菌液。宿主的菌丝液(500μ 1)如上制备并与500μ 1大肠杆菌液混合在一起以用于收 获。随后将收获的细菌添加MgCl2至终浓度10mM，涂布在的MS琼脂培养基上。在28°C培 育20小时后，铺上含有Img阿泊拉霉素和1. 5mg萘啶酮酸的Iml灭菌水，并且培养在28°C 继续培养5日以获得耐受阿泊拉霉素的菌株。
用MagExtractor基因组DNA提取仪(由Τ0Υ0Β0有限责任公司制造)根据方案， 从得到的阿泊拉霉素耐药性菌株制备基因组DNA，并且通过PCR和DNA印迹分析证实pDDOI 通过同源重组插入染色体。将上述同源重组体接种到改良YEME培养基(50ml)中，随后在28°C振摇培养2日， 并且将Iml培养物进一步接种到新鲜的改良YEME培养基(50ml)以进行传代培养。该过程 重复5次。然后，将稀释至合适活细胞计数的培养液涂布到MS琼脂培养基上，随后在28°C 培育4日。将生长的菌落复制到含有20 μ g/ml阿泊拉霉素的MS琼脂培养基和无阿泊拉霉 素的MS琼脂培养基上，并选出不能在含有阿泊拉霉素的培养基上生长的18个阿泊拉霉素 敏感菌株。制备得到的阿泊拉霉素敏感菌株的基因组DNA并使用 Km33(5，-CTTCGTGAATCCCCCTT-3’ :SEQ ID No. 8)与 Km35(5，-GCCCACCGCCTCGATCA-3’ :SEQ ID No. 9)的引物组合进行PCR反应以获得约3. 5kbp扩增的DNA片段。分析这些扩增的DNA 片段的碱基序列。结果是，一个菌株是其中观察到如所设计天冬酰胺置换的突变菌株，并且 对于17个菌株而言，碱基序列保持不变。为了检验卡那霉素的生产力，将这些菌株接种到在250ml体积三角瓶中制备的 30ml 液体生长培养基(Umezawa，H 等人，“The Journal ofAntibiotics”，(日本)，1977，第 30卷，第181-188页)中，随后在28°C培育2日。然后，将Iml培养液接种在30ml液体生 产培养基(其中淀粉的量从1.2%提高至6%)，并且在26°C振摇培养7日。为分析产物， 将培养液用50% H2SO4调整至pH 2.5，置于1.5-ml Eppendorf管中并在17，400 X g和10 分钟的条件下离心，并且将上清液进行LC/MS分析。结果是，对导入orfll突变的一个菌株 没有观察卡那霉素产生，并且恢复到与亲本菌株具有相同碱基序列的17个菌株产生卡那 霉素A(保留时间8. 2分钟，m/z 485)和卡那霉素B (保留时间10. 4分钟，m/z 484)。接着，将不产生卡那霉素的菌株涂布到琼脂培养基上，其中所述琼脂培养基通过 向稀释至半浓度的上述液体培养基中添加脱氧链霉胺至200 μ g/ml浓度而制备，随后在 28°C培育7日。然后，冻结和融解此琼脂以提取产物，其中所述产物随后进行生物分析。分 析细菌是枯草芽孢杆菌ATCC6633。结果是，通过无脱氧链霉胺培育法获得的产物没有抗微 生物活性，而对于通过添加脱氧链霉胺培育法获得的产物而言，检测到表明抗微生物活性 的抑制环。因此，对通过添加脱氧链霉胺培育法获得的产物进行LC/MS分析。因此，能从该 产物中检测到卡那霉素A和卡那霉素B。因此，证实置换在orfll第136位置处的氨基酸产 生了脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株，卡那霉素链霉菌-DOS。实施例3禾Il用脱,氧省车gfl安依IM牛产卡SRg素If株的链gfl安添力时吝育实施例2中获得的脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株在26°C于上述液体生产培 养基中培育7日。在第二日和第三日，添加被调整从而具有终浓度2，000 μ g/ml的链霉胺。添加Radio Light#800至2，000L培养液，并过滤混合物。将滤液吸附于50ml体 积 Amberlite FPC3500 (NH4+型，Rohm and Haas Japan K. K.)上。用水洗涤树脂，并随后用 0. 5N氨水洗脱。将洗脱物调节至pH 6并吸附于50ml体积Dowex 50ff(NH4+型，Muromachi Technos有限责任公司)上，并且用0. 04N至0. 2N氨水洗脱，获得57. 6mg的2-羟基卡那霉 素A、32. 8mg的2-羟基卡那霉素B和513. 2mg的2-羟基卡那霉素C。这些羟基卡那霉素的 结构通过 HR-FAB/MS (JE0L JMS-700，JEOL 有限公司)和 NMR(JE0L JW-LA400，JEOL 有限公司)光谱分析确定。实施例4 利用脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株的肌醇添加培育实施例2中获得的脱氧链霉胺依赖性产卡那霉素菌株涂布到已经添加肌醇至浓 度500μ g/ml的上述琼脂培养基上，随后在28°C培育7日。然后，冻结和融解此琼脂以提取 产物，其中所述产物随后进行LC/MS分析。结果是，检测到2-羟基卡那霉素C的峰(保留 时间8. 3分钟，m/z 501)。实施例5 在产卡那霉素细菌中的链霉胺或肌醇添加培育在产卡那霉素细菌(卡那霉素链霉菌)中，按照与实施例4中相同的方法实施添 加浓度500 μ g/ml链霉胺或肌醇的琼脂培育。产物由LC/MS分析。结果，在添加链霉胺或 添加肌醇的情况下，均检测到除卡那霉素A(保留时间8. 2分钟，m/z 485)和卡那霉素B (保 留时间10. 4分钟，m/z 484)之外，还产生了 2-羟基卡那霉素B (保留时间10. 7分钟，m/z 500)和2-羟基卡那霉素C(保留时间8. 3分钟，m/z 501)。实施例6 证实羟基卡那霉素B和C的物理化学特件确认了实施例3至5中获得的羟基卡那霉素B和C的物理化学特性并且发现它们 如下所示2"羟基卡那霉素B的物理化学特性(1)颜色和性状无色粉末(2)分子式=C18H37N5O11(3)质谱(HR-FAB/MS)测量值 500. 2563 (M+H)+，计算值 500. 2568(4)比旋光度[α ] D25 = +127. 1° (c = 1，H2O)(5)紫外吸收谱Xmax nm:末端吸收(H2O)(6)红外吸收谱 umax CnT1(KBr) :3351，2910，1585，1477，1368，1032(7) 1H-NMR 谱(400MHz, D2O) δ (ppm) :2·87(1Η，dd, Η_1)，3· 14 (1Η，dd, Η_2)， 2. 84 (1Η, dd, Η_3)，3. 40 (1Η, dd, Η_4)，3. 77 (1Η, dd, Η_5)，3. 32 (1Η, dd, Η_6)，5. 37 (1Η, d, H-I，)，2. 79 (1H, dd，H-2，)，3. 58 (1H, dd，H_3，)，3. 32 (1H, dd，H_4，)，3. 81(lH，m，H_5，)， 2. 84(lH，dd，H-6，a)，3. 06(lH，m，H_6，b)，5. 05 (1H，d，H_l”)，3. 52 (1H，dd，H_2”)，3. 02 (1H, dd, H-3”)，3. 35 (1H, dd, H_4”)，3. 93 (1H, dt, H_5”)，3. 78 (2H, br d, H_6”)[TSP = Oppm](8) 13C-NMRi普(1 OOMHz, D2O) δ (ppm) :57. 0 (d，C_l)，73. 5 (d，C_2)，55. 7 (d，C_3)， 82. 9(d，C-4)，74. 7(d，C-5)，84. 7(d，C-6)，100. 7(d，C-l，)，55. 9 (d，C_2，)，74. l(d，C_3，)， 72. 0(d, C-4，) ,73. 3(d, C_5，) ,42. l(t, C_6，), 100. 7 (d, C_l”)，72. 4 (d，C_2”)，54. 9 (d， C-3”)，69. 8(d，C-4”)，72. 7 (d，C_5”)，60. 9 (t，C_6”)[二噁烷=67. 4ppm](9)溶解性可溶于水中，并且不可溶于乙酸乙酯和氯仿中2-羟基卡那霉素C的物理化学特性(1)颜色和性状无色粉末(2)分子式=C18H36N4O12(3)质谱(HR-FAB/MS)测量值 501. 2398 (M+H)+，计算值 501. 2408(4)比旋光度[α ] D25 = +114. 3 ° (c = 1，H2O)
(5)紫外吸收谱Xmax nm:末端吸收(H2O)(6)红外吸收谱 umax CnT1(KBr) :3358，2920，1591，1457，1369，1032(7) 1H-NMR 谱(400MHz, D2O) δ (ppm) :2·88(1Η，dd, Η_1)，3· 14 (1Η，dd, Η_2)，
2.83 (1Η, dd, Η_3)，3. 39 (1Η, dd, Η_4)，3. 76 (1Η, dd, Η_5)，3. 33 (1Η, dd, Η_6)，5. 32 (1Η, d, H-I，)，2. 81(1H，dd，H-2，)，3. 60 (1H, dd，H_3，)，3. 41(1H，dd，H_4，)，3. 86 (1H, m, H_5，)，
3.76(lH，dd，H-6，a)，3. 88(lH，m，H_6，b)，5. 06 (1H，d，H_1 ”)，3. 54 (1H，dd，H_2”)，3. 04 (1H, dd, H-3”)，3. 37 (1H, dd, H_4”)，3. 94 (1H, dt, H_5”)，3. 79 (2H, br d, H_6”)[TSP = Oppm](8) 13C-NMR 谱(100MHz，D2O) δ (ppm) :57· 1 (d, C_l)，73. 5 (d, C_2)，56. O (d, C_3)， 83. 6(d，C-4)，74. 8(d，C-5)，84. 8(d，C-6)，101. l(d，C-l，)，56. l(d，C_2，)，74. 3 (d，C_3，)， 70. 6 (d, C-4，) ,73. 7(d, C_5，) ,61. 4(t, C_6，), 100. 9 (d, C_l”)，72. 4(d，C_2”)，55. 1 (d, C-3”)，69. 7(d，C-4”)，72. 8 (d，C_5”)，60. 9 (t，C_6”)[二噁烷=67. 4ppm](9)溶解性可溶于水中，并且不可溶于乙酸乙酯和氯仿中i式骀例1 2-羟某卡那霍素B和2-羟某卡那霍素C的杭微牛物活十牛通过琼脂稀释法将2-羟基卡那霉素B和2-羟基卡那霉素C的抗微生物活性测量 为最小抑菌浓度(MIC)。将已经在生长培养基中培养过夜的测试细菌调节至IO6个细胞/ ml，在含有2-羟基卡那霉素B或2-羟基卡那霉素C的Mueller-Hinton琼脂培养基(Difco Laboratories Inc.制造)中接种一个钼环的测试细菌，随后在37°C培育18至20小时。结果在表1中显示。[表1]2-羟基卡那霉素B和C的抗微生物活性
权利要求
由式(I)代表的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物，其中R代表氨基或羟基。FPA00001142650700011.tif
2.根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物，其中R代表氨基。
3.根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物，其中R代表羟基。
4.药物组合物，其包含根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物。
5.抗微生物组合物，其包含根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物。
6.链霉菌属(Sti^ptomyces)的能够产生根据权利要求1的化合物的产卡那霉素菌株， 其中2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活。
7.根据权利要求6的产卡那霉素菌株，其是2-脱氧链霉胺依赖性的。
8.根据权利要求6的产卡那霉素菌株，其中已经整合了编码多肽的基因，所述多肽选 自以下多肽(a)至(d)(a)由SEQID No. 1所代表的氨基酸序列中具有第136位置处的天冬氨酸改变成天冬 酰胺的突变的氨基酸序列组成的多肽；(b)由(a)中所定义氨基酸序列中置换、缺失、添加或插入一个或多个氨基酸的氨基酸 序列组成的多肽，所述多肽具有功能上等同于(a)中所定义多肽的活性；和(c)由与(a)中所定义氨基酸序列具有80%或更多同源性的氨基酸序列组成的多肽， 所述多肽具有功能上等同于(a)中所定义多肽的活性。
9.根据权利要求8的菌株，其中在(b)或(c)中定义的多肽保留有(a)中所定义的突变。
10.根据权利要求8的菌株，其中在(b)中的一个或多个氨基酸是1至40个氨基酸。
11.根据权利要求8的菌株，其中在(c)中的同源性是90%以上。
12.根据权利要求6的菌株，其中菌株是卡那霉素链霉菌(S.kanamyCetiCus)-D0S。
13.制造由式(I)代表的化合物的方法，⑴ 其中R代表氨基或羟基，该方法包括在包含链霉胺和/或肌醇的培养基中培育链霉菌属的产卡那霉素菌株以 产生所述化合物。
14.根据权利要求13的方法，其中产卡那霉素菌株中的2-脱氧青蟹肌糖合酶已经失活。
15.根据权利要求14的方法，其中产卡那霉素菌株是权利要求7至12中任一项所述的 菌株。
16.根据权利要求14的方法，其中培养基包含链霉胺。
17.根据权利要求16的方法，其中由式(I)代表的化合物连同2-羟基卡那霉素A—起产生。
18.根据权利要求14的方法，其中培养基包含肌醇。
19.根据权利要求18的方法，其中R代表羟基。
20.用于治疗或预防感染性疾病的方法，包括施用有效量的根据权利要求1的化合物 或其可药用盐或它们的溶剂合物至动物，包括人。
21.根据权利要求20的方法，其中感染性疾病由金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)或铜绿假单胞菌(Psudomonas aeruginosa)弓丨起。
22.根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物用于制造药物组合物的 用途。
23.根据权利要求1的化合物或其可药用盐或它们的溶剂合物用于制造抗微生物剂的用途。
全文摘要
本发明涉及新颖的氨基糖苷类抗生素、其制造方法及其医药用途。更具体地，本发明涉及由式(I)代表的化合物、其制造方法及其作为抗微生物剂的用途。其中R代表氨基或羟基。
文档编号C07H15/234GK101918577SQ20088011856
公开日2010年12月15日 申请日期2008年12月1日 优先权日2007年11月30日
发明者中根公隆, 五味修一, 太田康胜, 矢内耕二, 福岛崇惠, 谷匡人, 隅田奈绪美 申请人:明治制果株式会社