专利名称：一种新的焦磷酸合成酶编码序列、其编码的多肽及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种新的人多核苷酸，由该多核苷酸编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。更具体地说，本发明涉及牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，简称为GGPPS)家族中的一个新成员。本发明的多肽是果蝇GGPPS基因的同系物。
GGPPS是辣椒中发现的一个基因，其在植物中被研究得较多。而后，人们发现不仅在植物中有GGPPS基因，动物中也同样存在GGPPS基因，其在高等动物的脑中高表达，并与脑中蛋白的异戊二烯化作用有关。这一基因的表达失常，可能会引发早老性痴呆症等疾病。Kuntz等人首先于1992年从辣椒细胞cDNA文库中克隆得到一个GGPPS基因(Plant J 225-34，1992)。同年，Math等人也从欧氏杆菌属中分离得到了GGPPS基因(Proc Natl Acad Sci USA 1992，896761-6764)。随后，人们又从牛脑中分离得到了GGPPS基因(J.Nurochem 1995，2299-2306)，这一基因与辣椒及欧氏杆菌属中的GGPPS有较高的同源性。这三个基因被认为与蛋白的异戊二烯化过程有关。最近，果蝇GGPPS基因也被发表。但在本发明之前，没有发现或发表过人的GGPPS基因。
本发明的一个目的是提供一种新的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码与果蝇GGPPS基因同源的人的基因，本发明的人的与果蝇GGPPS同源的基因被命名为GGPPS。
本发明的另一个目的是提供一种新的与果蝇GGPPS同源的人的蛋白，命名为人GGPPS。
本发明的再一个目的是提供一种利用重组技术生产所述的GGPPS蛋白的方法。
本发明还涉及这种人GGPPS编码序列和多肽的应用。
在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有人GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸54-953位的序列。
在本发明的另一方面，提供了一种分离的GGPPS蛋白多肽，它包括具有SEQID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本发明的另一方面，提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA。
在本发明的另一方面，提供了一种所述载体转化的宿主细胞。
在本发明的另一方面，提供了一种产生具有GGPPS蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成GGPPS蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成GGPPS蛋白的重组细胞；(c)在适合表达GGPPS蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有GGPPS蛋白活性的多肽。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为1218个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO.3，其中开放读框位于54-953位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“GGPPS蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中54-953位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框54-953位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中54-953位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。更佳地，包括在高度严紧的条件下能与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与人GGPPS相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“GGPPS蛋白多肽”指具有GGPPS蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与GGPPS相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括GGPPS蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨度条件下能与GGPPS DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗GGPPS多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含GGPPS多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括GGPPS多肽的可溶性片段。通常，该片段具有GGPPS多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供GGPPS蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然GGPPS多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括GGPPS多肽编码序列的反义序列。这种反义序列可用于抑制细胞内GGPPS的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有GGPPS多肽编码序列的8-100个，较佳地15-50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码GGPPS的核酸分子。
本发明还包括检测GGPPS核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合。较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于GGPPS多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间。引物长度一般为20-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对GGPPSDNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于GGPPS基因产物或片段。较佳地，指那些能与GGPPS基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制GGPPS蛋白的分子，也包括那些并不影响GGPPS蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的GGPPS基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的GGPPS基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达GGPPS或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511.1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断GGPPS功能的抗体以及不影响GGPPS功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用GGPPS基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与GGPPS基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明的一个实施方案中，本发明的多核苷酸全长为1218个核苷酸，其详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于54-953位核苷酸。该多核苷酸是如此获得的，以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，合成正向引物A15′-GCGTGAAAAGTCGTGATATCATCG-3′、和反向引物A25′-TTGGTGGCAATGTCCTGTCACTGC-3′，进行PCR，获得1218bp(A1A2)的目的片段。测序后得到SEQ ID NO3的全长cDNA序列。
通过同源检索发现本发明的cDNA序列与已发表的果蝇的GGPPS基因同源，属于蛋白异戊二烯化酶家族，因而被确认为人的GGPPS基因。GGPPS编码的蛋白已被证实与蛋白的异戊二烯化过程有关，这是生物蛋白调控的一种手段。尤其是在高等生物中，蛋白质的翻译后调控，对于繁重的生物体内代谢调节过程起着极为重要的作用。实验发现，该同源基因在脑组织中高表达。它被认为可能与脑中的蛋白异戊二烯化作用有关。GGPPS催化蛋白异戊二烯化的作用可能与脑的正常代谢调控有关。若脑中的这一基因出现问题，很可能会导致脑无法正常指挥人体的正常工作，有资料证明其可能与老年痴呆症等疾病的发生有关(Runquist.M1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1GGPPS的cDNA序列的克隆和测定1.引物扩增以人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，用一对寡核苷酸为引物——A15′-GCGTGAAAGTCGTGATATCATCG-3′(SEQ ID NO1)为正向引物，寡核苷酸A25′-TTGGTGGCAATGTCCTGTCACTGC-3’(SEQ ID NO2)为反向引物，进行PCR。A1、A2引物对的PCR条件为93℃4分钟，随之以93℃1分钟、68℃1分钟和72℃1分钟进行35个循环，最后72℃延伸5分钟。电泳检测用A1、A2进行PCR扩增得到的产物，扩增片段的长度为1603bp的。
2.PCR产物的测序将上述步骤获得PCR扩增产物与pGEM-TTM载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM103，用QIAprep Plasmid试剂盒(QIAGEN)提取质粒，用双链嵌套式缺失试剂盒(Pharmacia)对插入片段进行定向系列缺失，然后用PCR对缺失子进行快速鉴定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA测序试剂盒(Epicentre Technologies)对依次截短的缺失子进行测序，最后用电脑软件拼接顺序，获得全长cDNA序列，共1218bp，详细序列见SEQ ID NO3，其中开放读框位于54-953位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出GGPPS的氨基酸序列，共300个氨基酸残基，其氨基酸序列详见SEQ ID NO4。
实施例2同源比较用GGPPS的全长cDNA序列及其编码蛋白在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库中用BLAST进行同源检索。结果发现它们与果蝇GGPPS基因及其编码蛋白具有极高同源性，在核酸水平上相同性达到了72％；在蛋白水平上的相同性达到了58％，相似性达到了75％。
GGPPS被研究得较多的是在植物中，其被认为是植物类胡萝卜素合成的前体，而类胡萝卜素在植物光合作用中起着吸收并转递光合作用所需能量的重要作用。同时有实验发现，GGPPS是维生素A合成的前体。其还可能在某些植物的生物代谢过程中起着重要的作用(FASEB.J 1996，10(2)，228-237)。
虽然GGPPS是在植物中发现的一种蛋白，但最近的研究发现，在动物中也同样存在这一蛋白。人们首先在牛脑中分离得到了GGPPS，并发现该基因在脑组织中高表达。牛脑中，GGPPS的含量很高，而脑的不同区域GGPPS的含量又各不相同，在白质中含量最高。(Runquist.M 1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
GGPPS在动物中的研究还刚刚起步，其被认为可能与蛋白的异戊二烯化过程有关。蛋白的异戊二烯化过程是真核生物中普遍存在的现象，是生物蛋白调控的一种手段。尤其是在高等生物中，蛋白的翻译后调控，对于繁重的生物体内代谢调节过程起着极为重要的作用(Runquist.M 1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。
特别是在GGPPS的氨基酸序列中存在两个分别由15和13个氨基酸组成的多聚异戊二烯合成酶的特征性序列——(L/I/V/M/F/Y)GX2(F/Y/L)Q(L/I/V/M)XDD(L/I/V/M/F/Y)X(D/N/G)；(L/I/V/M)2XDDX(2，4)DX4RR(G/H)[注该序列中X为任意氨基酸，“2”等数字为氨基酸数目，“(L/I/V/M/F/Y)”表示从这6个氨基酸中任意选择一个氨基酸]。在本发明的蛋白中符合上述模式的序列片段是LGLFFQIRDDYAN(SEQ ID NO.4中179-192位)，LLIDDIEDNSKLRRG(SEQ ID NO.4中61-75位)。这更证实了本发明的人的GGPPS与牛及其它物种的GGPPS属于一个家族，而且同样具有GGPPS家族的相关功能。其催化蛋白异戊二烯化的作用可能与对脑的正常代谢调控起着重要的作用。若脑中的这一基因出现问题，很可能会导致脑无法正常指挥人体的正常工作，从而引发早老性痴呆症等疾病，这将严重影响我们的正常生活(Runquist.M1995，J.Neurochem 65(5)2299-2306)。关于GGPPS在脑中影响早老性痴呆症及其他可能的疾病的产生及其作用机理，为我们有效地治疗这些疾病提供了研究的方向与手段。
实施例3GGPPS在大肠杆菌中的表达在该实施例中，编码GGPPS的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-GGCCGGATCCATGGAGAAGACTCAAGAAA-3′(SEQ ID NO.5)，该引物含有BamH1限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的GGPPS编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-ACACGGATCCTTATTCATTTTCTTCTTTG-3’(SEQ ID NO.6)
该引物含有BamH1限制性限制性内切酶的酶切位点、一个翻译终止子和GGPPS的编码序列。
限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(ori)、一个IPTG-可调启动子/操纵子(P/O)、一个核糖体结合位点(RBS)、一个6-组氨酸标记物(6-His)以及限制性内切酶克隆位点。
用BamHI消化pQE-9载体，随后将插入片段连接到pQE-9载体并保持开放读框在细菌RBS起始。随后用连接混合物转化购自Qiagen，商品名为M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，其表达lacI阻遏物并携带卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。抽提质粒，用PstI酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明GGPPS的cDNA插入片段已正确装入载体。
在补加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶100-1∶250的稀释率稀释，然后接种到大体积培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)达0.4-0.6时，加入IPTG(“异丙基-硫代-B-D-半乳糖苷”)至终浓度为1mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-4小时，随后离心(6000×g，20分钟)。超声裂解包涵体，收集细胞并将细胞沉淀溶于6M的盐酸胍中。澄清后，通过在能使含6-His标记物蛋白紧密结合的条件下，用镍-螯合柱层析从溶液中纯化溶解的GGPPS。用6M盐酸胍(pH5.0)从柱中洗脱GGPPS。可用几种方法从盐酸胍中变性沉淀蛋白。或者，使用透析步骤除去盐酸胍，或者从镍-螯合柱中分离出纯化蛋白。纯化后蛋白可以结合到第二个柱中，该柱中具有递减的线性盐酸胍梯度。在结合到该柱时蛋白质变性，随后用盐酸胍(pH5.0)洗脱。最后，将可溶的蛋白质用PBS进行透析，然后将蛋白质保存在终浓度为10％(w/v)甘油的贮存液中。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为35KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例4GGPPS在真核细胞(CHO细胞株)中的表达在该实施例中，将编码GGPPS的cDNA序列用对应于该DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物，用人脑λgt11cDNA文库(购自Clontech公司)为模板进行扩增，以合成插入片段。
PCR反应中使用的5′寡核苷酸引物序列为5′-GGCCGGATCCATGGAGAAGACTCAAGAAA-3′(SEQ ID NO.7)，该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点，接之是由起始密码子开始的GGPPS编码序列的19个核苷酸；3′端引物序列为5’-ACACGGATCCTTATTCATTTTCTTCTTTG-3’(SEQ ID NO.8)，该引物含有BamHI限制性限制性内切酶的酶切位点，一个翻译终止子和GGPPS的编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于CHO细胞表达载体pcDNA3上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Neor)、一个噬菌体复制起点(f1 ori)、一个病毒复制起点(SV40 ori)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)、一个Sp6启动子、一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序、。
用BamHI消化pcDNA3载体，随后将插入片段连接到pcDNA3载体。随后用连接混合物转化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培养皿上筛选转化子，在补加Amp(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的克隆。抽提质粒，用EcoRV酶切鉴定插入片段大小及方向，测序验证结果表明GGPPS的cDNA插入片段已正确装入载体。
质粒转染CHO细胞是用Lipofectin试剂盒(GiBcolife)用脂转染法进行。转染48小时后，经2-3周的持续G418加压筛选，收集细胞及细胞上清测定表达蛋白酶活力。去G418，连续传代培养；对混合克隆细胞极限稀释，选择具有较高蛋白活性的细胞亚克隆。按常规方法大量培养上述阳性亚克隆。48小时后，开始收集细胞及上清，用超声裂解方法破碎细胞。以含0.05％Triton的50mM Tris·HCl(pH7.6)溶液为平衡液及洗脱液，用经预平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mM Tris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用12％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小为35KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的N端和C端各10个氨基酸长度的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID NO4的序列一致。
实施例5制备抗体将实施例3或4中获得的重组蛋白用来免疫动物以产生抗体，具体如下。重组分子用层析法进行分离备用。也可用SDS-PAGE凝胶电泳法进行分离，将电泳条带从凝胶中切下，并用等体积的完全Freund’s佐剂乳化。用50-100μg/0.2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。14天后，用非完全Freund’s佐剂乳化的同样抗原对小鼠以50-100μg/0.2ml的剂量进行腹膜内注射以加强免疫。每隔14天进行一次加强免疫，至少进行三次。获得的抗血清的特异反应活性用它在体外沉淀GGPPS基因翻译产物的能力加以评估。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度23碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO1GCGTGAAAGT CGTGATATCA TCG 23(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)长度24碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2TTGGTGGCAA TGTCCTGTCA CTGC24(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特征(A)长度1218bp(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO31 GCGTGAAAGTCGTGATATCATCGTTGAACTATTAGCTTTGAAGTTTAAATCCAATGGAGA61 AGACTCAAGAAACAGTCCAAAGAATTCTTCTAGAACCCTATAAATACTTACTTCAGTTAC121 CAGGTAAACAAGTGAGAACCAAACTTTCACAGGCATTTAATCATTGGCTGAAAGTTCCAG181 AGGACAAGCTACAGATTATTATTGAAGTGACAGAAATGTTGCATAATGCCAGTTTACTCA241 TCGATGATATTGAAGACAACTCAAAACTCCGACGTGGCTTTCCAGTGGCCCACAGCATCT301 ATGGAATCCCATCTGTCATCAATTCTGCCAATTACGTGTATTTCCTTGGCTTGGAGAAAG361 TCTTAACCCTTGATCACCCAGATGCAGTGAAGCTTTTTACCCGCCAGCTTTTGGAACTCC421 ATCAGGGACAAGGCCTAGATATTTACTGGAGGGATAATTACACTTGTCCCACTGAAGAAG481 AATATAAAGCTATGGTGCTGCAGAAAACAGGTGGACTGTTTGGATTAGCAGTAGGTCTCA541 TGCAGTTGTTCTCTGATTACAAAGAAGATTTAAAACCGCTACTTAATACACTTGGGCTCT601 TTTTCCAAATTAGGGATGATTATGCTAATCTACACTCCAAAGAATATAGTGAAACCAAAA661 GTTTTTGTGAAGATCTGACAGAGGGAAAGTTCTCATTTCCTACTATTCATGCTATTTGGT721 CAAGGCCTGAAAGCACCCAGGTGAAGAATATCTTGCGCCAGAGAACAGAAAACATAGATA781 TAAAAAAATACTGTGTACATTATCTTGAGGATGTAGGTTCTTTTGAATACACTCGTAATA841 CCCTTAAAGAGCTTGAAGCTAAAGCCTATAAACAGATTGATGCACGTGGTGGGAACCCTG901 AGCTAGTAGCCTTAGTAAAACACTTAAGTAAGATGTTCAAAGAAGAAAATGAATAATGTT961 AAGCCATTCTTGATTGGACCTCATAGCTTATTTTAGTTAATCTTTTTTTTGTCTTTTAGC1021 CTTACCACCTTTTAAAAAATTTGTTATTCTCCAGAAACAGTAAATAGGTGAGTAGGGGTG1081 GTGCCAGTGAATTCGTTTTCATTTAGAAGCCCCTCTGTACAGATAATCAAAATTCAAAGT1141 TGAAAGAATCAAAAGCAGCCACAGTTATGTAGGTCTGATTTGAATGTCATAATTGCAGTG1201 ACAGGACATTGCCACCAA(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特征(A)长度300个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO41 Met Glu Lys Thr Gln Glu Thr Val Gln Arg Ile Leu Leu Glu Pro16 Tyr Lys Tyr Leu Leu Gln Leu Pro Gly Lys Gln Val Arg Thr Lys31 Leu Ser Gln Ala Phe Asn His Trp Leu Lys Val Pro Glu Asp Lys46 Leu Gln Ile Ile Ile Glu Val Thr Glu Met Leu His Asn Ala Ser61 Leu Leu Ile Asp Asp Ile Glu Asp Asn Ser Lys Leu Arg Arg Gly76 Phe Pro Val Ala His Ser Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Val Ile Asn91 Ser Ala Asn Tyr Val Tyr Phe Leu Gly Leu Glu Lys Val Leu Thr106 Leu Asp His Pro Asp Ala Val Lys Leu Phe Thr Arg Gln Leu Leu121 Glu Leu His Gln Gly Gln Gly Leu Asp Ile Tyr Trp Arg Asp Asn136 Tyr Thr Cys Pro Thr Glu Glu Glu Tyr Lys Ala Met Val Leu Gln151 Lys Thr Gly Gly Leu Phe Gly Leu Ala Val Gly Leu Met Gln Leu166 Phe Ser Asp Tyr Lys Glu Asp Leu Lys Pro Leu Leu Asn Thr Leu181 Gly Leu Phe Phe Gln Ile Arg Asp Asp Tyr Ala Asn Leu His Ser196 Lys Glu Tyr Ser Glu Thr Lys Ser Phe Cys Glu Asp Leu Thr Glu211 Gly Lys Phe Ser Phe Pro Thr Ile His Ala Ile Trp Ser Arg Pro226 Glu Ser Thr Gln Val Lys Asn Ile Leu Arg Gln Arg Thr Glu Asn241 Ile Asp Ile Lys Lys Tyr Cys Val His Tyr Leu Glu Asp Val Gly256 Ser Phe Glu Tyr Thr Arg Asn Thr Leu Lys Glu Leu Glu Ala Lys271 Ala Tyr Lys Gln Ile Asp Ala Arg Gly Gly Asn Pro Glu Leu Val286 Ala Leu Val Lys His Leu Ser Lys Met Phe Lys Glu Glu Asn Glu(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO5GGCCGGATCC ATGGAGAAGA CTCAAGAAA 29(2)SEQ ID NO6信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸
(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO6ACACGGATCC TTATTCATTT TCTTCTTTG29(2)SEQ ID NO7信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO7GGCCGGATCC ATGGAGAAGA CTCAAGAAA 29(2)SEQ ID NO8信息(i)序列特征(A)长度29碱基(B)类型核酸(C)链性单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO8ACACGGATCC TTATTCATTT TCTTCTTTG 29
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有人GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，该序列具有SEQ ID NO.3中核苷酸54-953位的序列。
4.一种分离的GGPPS蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
7.一种用权利要求6所述载体转化的宿主细胞。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，该细胞是真核细胞。
10.一种产生具有GGPPS蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有GGPPS蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成GGPPS蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成GGPPS蛋白的重组细胞；(c)在适合表达GGPPS蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有GGPPS蛋白活性的多肽。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，该序列为SEQ ID NO.3中从核苷酸54-953位。
12.一种能与权利要求4所述的GGPPS蛋白多肽特异性结合的抗体。
13.一种核苷酸分子，其特征在于，它是权利要求1所述DNA分子的反义序列。
14.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中约8-100个连续核苷酸。
全文摘要
本发明涉及一种新的人多核苷酸,更具体地涉及人GGPPS(Geranylgeranyl diphosphate synthase)编码序列。本发明的多肽是果蝇GGPPS基因的同系物。本发明还涉及该多核苷酸编码的多肽,这些多核苷酸和多肽的应用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生产方法。
文档编号C07K16/40GK1246536SQ98111038
公开日2000年3月8日 申请日期1998年8月31日 优先权日1998年8月31日
发明者余龙, 毕安定, 傅强, 赵勇, 赵寿元 申请人:上海新黄浦复旦基因工程有限公司