专利名称：一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆的制作方法
技术领域：
本发明是一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆，属于生物工程领域，特别涉及到紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因及其克隆。
背景技术：
林业生产中树木的价值不但在于木材产量，还体现在木纤维的理化指标上。木纤维主要由木质素和纤维素组成。纤维素是主要由β-D-葡萄糖基以1-4糖苷键连接而成的复杂的高分子物质，是造纸的主要原料。造纸制浆的过程就是要从植物纤维原料中去除木质素类物质，尽量保留纤维素和半纤维素。对植物纤维素合成过程及调控的研究，在生物学、生态学和经济上都有重要意义。随着植物分子生物学的飞速发展，人们开始重视从造纸原料——植物入手，试图在了解植物生长发育机理及分子调控的基础上，通过基因工程途径研究开发出更适合制浆造纸工业的植物资源。因此涉及植物纤维素合成的基因工程的研究、应用对纸浆工业具有非常重要的作用。本发明从增加植物纤维素合成的角度来研究如何改善树木材质的问题，并通过基因克隆及其在转基因植物中的表达来研究相关基因在植物体内的作用。
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶UGPase(UDP-glucose pyrophosphorylase(EC 2.7.7.9))在UDP-葡萄糖的合成和降解中都起作用。尿苷二磷酸葡萄糖是高等植物中主要活化糖的形式，作为葡萄糖基供体参与蔗糖、纤维素、半纤维素、果胶质的合成代谢，是细菌和植物中纤维素合成酶的高能底物。高等植物在纤维素合成过程中，UDP-葡萄糖在细胞代谢途径中作为葡萄糖苷供体扮演了重要角色，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶可以以1-磷酸葡萄糖为底物催化纤维素的前体UDP-葡萄糖的形成。本发明从增加植物纤维素合成的角度来研究如何改善树木材质的问题，并通过基因克隆及其在转基因植物中的表达来研究相关基因在植物体内的作用。
发明内容
本发明的目的是提供了紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因UGPase序列及其相应的氨基酸序列，提供了含有UGPase的克隆载体pUC118/UGPase和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC118/UGPase。利用本发明成果，可以构建尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
本发明采用的技术方案是利用简并寡核苷酸PCR法结合cDNA末端快速扩增PCR法，以紫穗槐茎RNA为模板，先用简并PCR引物，通过RT-PCR的方法，得到了UGPase基因片段，又据此片段设计反向嵌套引物，用RACE方法获得了未知的5’和3’端基因片段，从而克隆了紫穗槐UGPase全长cDNA，并测定了核苷酸序列。将UGPase和克隆载体pUC118分别用限制性内切酶切割，形成互补的粘性末端，T4DNA连接酶连接，形成UGPase克隆载体pUC118/UGPase。热激法将这个克隆载体导入感受态E.coli细胞JM109，成为含有pUC118/UGPase的大肠杆菌细胞JM109/pUC118/UGPase。
紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase序列如下1 aggtcaattt atgcaatcag caccacaccc tcctctcaac tctcacacac acaccctctt61 tctttatctt ggctctcttc tcttctcttc tactctccac acgtaaccga aactccctcg121 tttctcgaac cttccacagc aatggccgct actgctaccg acaacaagct ctccaacctc181 aaatccgccg tcgccggatt gaaccaaatc agcgagaatg agaagaaagg attcatcaac241 ctcgtctctc gctacctcag tggcgaagcg caacatgtgg aatggagcaa gatccagacg301 cctaccgatg aagtggttgt gccttacgag agtttggcgc caactcctga tggttcttcg361 gaggtgaaga gtctattgga taagcttgtg gtgttgaagc tcaatggagg cttggggaca421 actatgggtt gcactggtcc aaagtctgtc attgaagttc gtgatgggtt gacatttctt481 gatctgattg tcatccaaat tgagaatctc aattccaaat atggaagcaa tgttcctctg541 ctattgatga actcattcaa cactcatgat gacactcaaa agattattga aaagtacaaa601 aactcaaata ttcagattca tactttcaat cagagccagt atcctcgatt ggttgttgat661 gactttttgc cattgccttc caaagggcac actggcaagg atgggtggta ccctcctggg721 catggagatg tcttcccctc attgtcgaac agtggcaaac tcgatgcact attatcacag781 ggtaaagagt atgtgtttgt tgccaattcg gataacttgg gggctatagt tgacttgaaa841 atcttaaatc atttggtcaa gaacaagaac gaatactgta tggaggtgac tcccaaaaca901 ttggctgatg tgaagggtgg cactttgatt tcttatgaag gaagggttca gctcctggaa961 atcgcccaag tcccagatga acatgtcagt gaattcaagt caatagagaa gttcaaaatt1021 ttcaacacaa ataatttgtg ggtgaactta aaagcaatta aaaggctcgt tgaagctgat1081 gctcttaaga cggagattat tcccaatcca aaggaagttg atggagtaaa agttcttcag1141 ctggaaactg cagctggtgc agcaataagg ttctttgaca aggctattgg gattaatgtt1201 cctcgatccc gattccttcc agtgaaggca acttcagatt tgcttcttgt ccagtcggac1261 ctctacactt tggaagatgg atttgtcatt cgaaacaaag ctagggcaaa tcctgaaaac1321 cctactgttg aattggggcc agaatttaag aaggttagca acttcttgag ccggttcaag1381 tcaattccta gtatcgttga gcttgacagt ttaaaagtgg caggcgatgt atggtttgga1441 cctggcatta tcctcaaggg gaaagtcagt atcgtagcaa aacctggtgt aaagttggaa1501 attcctgatg gagctgtaat tgcgaacaag gaaattaatg gccctgagga cctgtgagga1561 agctgatgag ttttgaaatg tatctgactg tatacgatgt agacagtctt cttgctattt1621 ttgtattgct ccaagtttga taggaaaaga aaaaataata tggcggcttt tgttgaggat1681 tagtctgagt atggagcttt gctggatgtc ttgtaatttt gtttttaacg tttgcaagga1741 ctgcaggagg atcatgtttt gccccctaac atggtgagca ttttcgccat tttgtataaa1801 taaccgtgtt ccacaaaaaa aaaaaaaaaa a其中ATG为转录起始密码，TAG为转录终止密码。根据以上核苷酸序列，推测紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶氨基酸序列如下1MAATA TDNKL SNLKS AVAGL NQISE NEKKG FINLV SRYLS41 GEAQH VEWSK IQTPT DEVVV PYESL APTPD GSSEV KSLLD81 KLVVL KLNGG LGTTM GCTGP KSVIE VRDGL TFLDL IVIQI121 ENLNS KYGSN VPLLL MNSFN THDDT QKIIE KYKNS NIQIH161 TFNQS QYPRL VVDDF LPLPS KGHTG KDGWY PPGHG DVFPS201 LSNSG KLDAL LSQGK EYVFV ANSDN LGAIV DLKIL NHLVK241 NKNEY CMEVT PKTLA DVKGG TLISY EGRVQ LLEIA QVPDE281 HVSEF KSIEK FKIFN TNNLW VNLKA IKRLV EADAL KTEII321 PNPKE VDGVK VLQLE TAAGA AIRFF DKAIG INVPR SRFLP361 VKATS DLLLV QSDLY TLEDG FVIRN KARAN PENPT VELGP401 EFKKV SNFLS RFKSI PSIVE LDSLK VAGDV WFGPG IILKG
441 KVSIV AKPGV KLEIP DGAVI ANKEI NGPED L紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase全长1831bp，142-1558编码区，共编码472个氨基酸。
本发明的效果和益处在于UGPase是首次被提取、测序和克隆的紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因。因其所编码的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶参与植物糖代谢过程中尿苷二磷酸葡萄糖的合成，尿苷二磷酸葡萄糖是纤维素合成的重要底物，所以该基因的克隆可用于构建表达尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
具体实施方案以下详细说明本发明的最佳实施例。
实施例1UGPase cDNA全长目的片段的克隆和测序取春季萌发的紫穗槐枝条，剥去外皮，用清洁力片刮取次生分生组织，液氮研磨成粉，加入TRIzol试剂，提取RNA。按照BcaBESTTMRNA PCR KitVer.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT为引物，以提取的总RNA为模板，进行反转录反应，合成cDNA。根据GENEBANK上编码UGPase蛋白保守区序列设计简并引物UGPF1和UGPR1(表1)，以上述合成的cDNA为模板，进行PCR反应。用TaKaRa Ex TaqTM试剂盒，调制反应液，PCR反应物组成如下(50μl体系)5μl dNTP，5μl ExTag buffer，0.25μl(5U/μl)ExTag，RT反应产物1μl，引物UGPF1和UGPR1各1μl。反应条件为94℃预变性5min，然后98℃10s，55℃30s，72℃55s，共30个循环，反应结束时72℃继续延伸7min。将PCR产物回收片段UGP1克隆，测序并分析。
根据已获得的紫穗槐UGP1 cDNA部分序列，设计一条5′末端磷酸化的反转录引物URT1。在反转录引物内侧设计两对反向嵌套PCR引物UF1\UR1和UF2\UR2，扩增包括5′末端的cDNA片段。引物序列如下UGPF1 TATGGGNTGCACNGGNCCNAAGTCUGPR1 CCAANCGNGGATACTGGCTCUF3AGGTCAATTTATGCAATCAGURT1 (P)-AGGATACTGGCTCTGUF1CCTCTGCTATTGATGAACTCUR1GCTTCCATATTTGGAATTGAGUF2TTCAACACTCATGATGACACTCUR2TGTCAACCCATCACGAACTT反应按照5′-Full RACE Core Set(TAKARA)的方法进行。
PCR反应条件94℃预变性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重复30个循环，反应结束时72℃继续延伸7分钟。将PCR产物回收测序。
按照3′-FULL RACE Core Set(TAKARA)方法，用OligodT-3sitesAdaptor引物进行反转录反应。再用OligodT-3sites Adaptor引物和UF1引物扩增含3′末端的cDNA片段UGP3。PCR反应条件94℃预变性5min，94℃1min，55℃30s，72℃60s，重复30个循环，反应结束时72℃继续延伸7分钟。将PCR产物回收测序。
依据5′RACE和3′RACE扩增产物的核苷酸序列设计特异引物UF3，按照BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver.1.1(TAKALA)方法，以Oligo dT为下游引物，扩增UGP全长cDNA并测序，得到紫穗槐(Amorpha fruticosa)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase。
实施例2UGPase与克隆载体pUC118的重组UGPase和克隆载体pUC118分别用EcoRI/SphI双酶切。酶切条件如下Eppendorf AddH2O 11μl1×H 2μlPCR片段(1μg/μl) 5μlEcoRI 1μlSphI 1μlEppendorf BddH2O 15μl1×H 2μl质粒(1μg/μl)1μlEcoRI 1μlSphI 1μl37℃酶切3小时，电泳后分别回收两个目的片段，用T4DNA连接酶连接。连接条件如下ddH2O 6μlPCR片段(0.1μg/μl) 1μl质粒(0.05μg/μl) 1μl10×T4DNA连接酶Buffer 1μlT4DNA连接酶(1U/μl)1μl16℃连接1小时，电泳检测连接产物，回收其中约4.2kb片段为含有UGPase的克隆载体pUC118/UGPase，用于转化大肠杆菌。
实施例3克隆载体pUC118/UGPase转化大肠杆菌JM109加入60μl解冻的感受态E.coli JM109和10μl连接液至Eppendorf中，冰上30秒，42℃ 50秒，冰上2分钟，加入37℃的LB培养基930μl，37℃震荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal混合后涂含有50mg/Ap的LB平板上，37℃培养过夜。挑选白色菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.5kb特异带者为阳性转化菌落，为含有pUC118/UGPase的大肠杆菌JM109/pUC118/UGPase。从JM109/pUC118/UGPase中提取质粒，以pUC118的测序通用引物测定外源插入序列UGPase的核苷酸序列，与实施例1中所述PCR测序结果一致。
权利要求
1.一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase，其特征在于它是紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因。
2.根据权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase的核苷酸序列1 aggtcaattt atgcaatcag caccacaccc tcctctcaac tctcacacac acaccctctt61 tctttatctt ggctctcttc tcttctcttc tactctccac acgtaaccga aactccctcg121 tttctcgaac cttccacagc aatggccgct actgctaccg acaacaagct ctccaacctc181 aaatccgccg tcgccggatt gaaccaaatc agcgagaatg agaagaaagg attcatcaac241 ctcgtctctc gctacctcag tggcgaagcg caacatgtgg aatggagcaa gatccagacg301 cctaccgatg aagtggttgt gccttacgag agtttggcgc caactcctga tggttcttcg361 gaggtgaaga gtctattgga taagcttgtg gtgttgaagc tcaatggagg cttggggaca421 actatgggtt gcactggtcc aaagtctgtc attgaagttc gtgatgggtt gacatttctt481 gatctgattg tcatccaaat tgagaatctc aattccaaat atggaagcaa tgttcctctg541 ctattgatga actcattcaa cactcatgat gacactcaaa agattattga aaagtacaaa601 aactcaaata ttcagattca tactttcaat cagagccagt atcctcgatt ggttgttgat661 gactttttgc cattgccttc caaagggcac actggcaagg atgggtggta ccctcctggg721 catggagatg tcttcccctc attgtcgaac agtggcaaac tcgatgcact attatcacag781 ggtaaagagt atgtgtttgt tgccaattcg gataacttgg gggctatagt tgacttgaaa841 atcttaaatc atttggtcaa gaacaagaac gaatactgta tggaggtgac tcccaaaaca901 ttggctgatg tgaagggtgg cactttgatt tcttatgaag gaagggttca gctcctggaa961 atcgcccaag tcccagatga acatgtcagt gaattcaagt caatagagaa gttcaaaatt1021 ttcaacacaa ataatttgtg ggtgaactta aaagcaatta aaaggctcgt tgaagctgat1081 gctcttaaga cggagattat tcccaatcca aaggaagttg atggagtaaa agttcttcag1141 ctggaaactg cagctggtgc agcaataagg ttctttgaca aggctattgg gattaatgtt1201 cctcgatccc gattccttcc agtgaaggca acttcagatt tgcttcttgt ccagtcggac1261 ctctacactt tggaagatgg atttgtcatt cgaaacaaag ctagggcaaa tcctgaaaac1321 cctactgttg aattggggcc agaatttaag aaggttagca acttcttgag ccggttcaag1381 tcaattccta gtatcgttga gcttgacagt ttaaaagtgg caggcgatgt atggtttgga1441 cctggcatta tcctcaaggg gaaagtcagt atcgtagcaa aacctggtgt aaagttggaa1501 attcctgatg gagctgtaat tgcgaacaag gaaattaatg gccctgagga cctgtgagga1561 agctgatgag ttttgaaatg tatctgactg tatacgatgt agacagtctt cttgctattt1621 ttgtattgct ccaagtttga taggaaaaga aaaaataata tggcggcttt tgttgaggat1681 tagtctgagt atggagcttt gctggatgtc ttgtaatttt gtttttaacg tttgcaagga1741 ctgcaggagg atcatgtttt gccccctaac atggtgagca ttttcgccat tttgtataaa1801 taaccgtgtt ccacaaaaaa aaaaaaaaaa a
3.根据权利要求1所述尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase的克隆载体pUC 118/UGPase。
4.根据权利要求3所述克隆载体pUC118/UGPase的大肠杆菌(E.coli)受体细胞JM109/pUC118/UGPase。
全文摘要
本发明是一种尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其克隆，属于生物工程领域。本发明提供了一种来自于紫穗槐(Amorpha fruticosa)编码尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因UGPase，提供了UGPase序列及其相应的氨基酸序列。提供了含有UGPase的克隆载体pUC 118/UGPase和含有这种载体的E.coli细胞JM109/pUC118/UGPase。本发明可用于构建尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因工程菌，用于植物的基因转化，达到改善植物品质的目的。
文档编号C12N15/70GK1401774SQ02132629
公开日2003年3月12日 申请日期2002年7月19日 优先权日2002年7月19日
发明者安利佳, 刘文哲, 苏乔, 高晓蓉, 杨君 申请人:大连理工大学