蛋白质及葡萄糖脱氢酶的精制方法

专利名称：蛋白质及葡萄糖脱氢酶的精制方法
技术领域：
本发明涉及利用液体层析法精制蛋白质的方法。该精制方法是在精制例如电子传递蛋白质所结合的葡萄糖脱氢酶时使用的方法。
背景技术：
使用对于特定底物有特异反应的酶的生物传感器的开发，不分产业领域地正在盛行起来。作为生物传感器的代表，可以举出主要在医疗领域使用的葡萄糖传感器。
葡萄糖传感器是用于构筑含有酶和电子传递物质的反应体系的器件，在利用该葡萄糖传感器的情况下，例如采用电流分析的方法对葡萄糖进行定量测定。作为酶来说，使用葡萄糖氧化酶(GOD)和葡萄糖脱氢酶(GDH)。
GOD，因为针对葡萄糖的底物特异性高、热稳定性优异、能够实现酶的批量化生产，所以，与其它酶相比，有生产成本低的优点。其反面，使用GOD的体系，因为容易受到测定样品中的溶解氧的影响，所以有溶解氧对测定结果产生影响的问题。
另一方面，使用GDH的体系不易受到测定样品中的溶解氧的影响。因此，使用GDH的体系，即使在氧分压低的环境下进行测定，对要求氧量多的高浓度样品进行测定时，也可以精度高地测定葡萄糖浓度。其反面是GDH有热稳定性差、底物特异性比GOD差的问题。
从这样的情况出发，摸索着弥补GOD和GDH双方的缺点。如国际公开WO02/36779号公报所公开的那样，早出等人从温泉附近的土壤中分离出新型菌株(Burkhorderia cepacia KS1株)，由该菌株取得了新的GDH。该GDH是由α、β、γ亚单位构成的(以下称“CyGDH”)，与电子传递物质的反应速度高，在耐热性方面也没有问题，作为葡萄糖传感器使用是合适的。
在葡萄糖传感器中使用CyGDH的情况下，从含有CyGDH的酶溶液出发，需要精制CyGDH。在酶的精制中，通常利用液体层析法。因此，本发明人等人根据通常方法，同时使用疏水层析法及阴离子交换层析法进行了精制酶溶液的试验。但是，用SDS-PAGE对精制酶液进行了确认，结果是，除了α、β、γ亚单位以外，还含有许多蛋白质，不能高纯度地精制CyGDH。

发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白质的新型精制方法。
由本发明的第一方面提供的蛋白质的精制方法，是从目标蛋白质溶解的蛋白质溶液出发、利用液体层析法精制上述目标蛋白质的方法，其中，上述液体层析法包括向填充有填充剂的填充槽中导入上述蛋白质溶液、在上述填充剂中保持上述目标蛋白质的第一步骤；和，使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液、从上述填充剂中洗脱上述目标蛋白质的第二步骤。
另外，在本说明书中，在称为“液体层析法”时，没有特别的限定，除了使用柱以流动方式(连续式)进行精制的情况以外，还包括以间歇式精制蛋白质的情况。作为间歇式的精制方法来说，可以举出例如在容器内使填充剂和蛋白质溶液共存、使目标蛋白质结合于填充剂后、分离填充剂、使该填充剂和洗脱液接触、然后从填充剂中分离和回收目标蛋白质的方法。
作为精制对象的目标蛋白质来说，可以举出例如含有电子传递蛋白质的蛋白质。典型的是，作为目标蛋白质来说，可以举出包含电子传递蛋白质和具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质的葡萄糖脱氢酶。
作为填充剂来说，使用例如离子交换树脂，由离子交换层析法精制蛋白质。此时，作为离子交换树脂来说，使用例如具有季铵基作为离子交换基的离子交换树脂。
这里，所谓“羟基胆烷酸”，指的是胆烷酸三水合物的胆酸及广义的衍生物，作为羟基胆烷酸盐来说，可以举出胆酸盐、甘氨熊脱氧胆酸盐、牛磺甘氨熊脱氧胆酸盐、牛磺熊脱氧胆酸盐、熊脱氧胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、甘氨石胆酸盐、牛磺石胆酸盐、石胆酸盐等。其中，优选使用胆酸盐、例如胆酸钠。
目标蛋白质从填充剂中的洗脱，优选使洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度为一定来进行。此时，洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度，优选在0.5～2.5重量％的范围、更优选在0.8～1.2重量％的范围来选择。这样的方法，不限于用间歇式进行目标蛋白质洗脱的场合，也适用于用连续式进行目标蛋白质洗脱的场合。另外，也可以使洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度与时间同时变化而进行目标蛋白质的洗脱。此时，洗脱液的浓度的上限，优选例如为3重量％以下、更优选为1.5重量％、最优选1重量％。即，洗脱液的浓度变化，在例如0～3重量％的范围、更优选为0～1.5重量％的范围、最优选为0～1.0重量％的范围进行。
电子传递蛋白质，例如在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约43kDa。另一方面，具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质，在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约60kDa。这样的电子传递蛋白质及含有亚单位的葡萄糖脱氢酶，可以从例如具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物或从转化体取得。
本发明中所采用的属于Burkhorderia属的微生物，如果是具有该酶生产能力的属于Burkhorderia属的微生物，就没有特别的限制，但优选Burkhorderia cepacia、特别优选Burkhorderia cepacia KS1株(以下，简称为“KS1”株)。该KS1株在平成12年9月25日(2000年9月25日)在独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心( 305-8566日本国茨城县つくば市东1丁目1番地1中央第6)以微生物保藏号第FERM BP-7306号保藏。
转化体，可以通过在宿主微生物中导入从属于例如Burkhorderia属的微生物中取得的含有编码电子传递蛋白质及具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质的序列的DNA而形成。作为宿主微生物来说，优选使用属于假单胞菌属的微生物(特别是恶臭假单胞菌或大肠杆菌)。
如国际公开WO02/36779号公报等公开的那样，产生源自KS1株的葡萄糖脱氢酶，除了亚单位(α亚单位)和电子传递蛋白质(β亚单位)以外，还具有在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量约为14kDa的γ亚单位。
早出等人确认，与只表达α亚单位的情况相比，若与α亚单位一起表达γ亚单位，就可以得到高的酶活性。因此，从酶活性的观点出发，优选表达γ亚单位，在上述DNA中，优选在α亚单位的上游区域含有γ亚单位的结构基因。如果这样就可以认为，在转化体中，在产生α亚单位时，由于首先表达γ亚单位作为蛋白质来存在，所以可以在微生物体内高效率地产生α亚单位。
本发明的第二方面提供一种葡萄糖脱氢酶的精制方法，它是组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于上述疏水层析法包括在固定相中保持上述葡萄糖脱氢酶的步骤、溶出不要的蛋白质的步骤、使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液溶出上述葡萄糖脱氢酶的步骤；上述阴离子交换层析法包括在固定相中保持上述葡萄糖脱氢酶的步骤、使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液溶出上述葡萄糖脱氢酶的步骤。
在疏水层析法中，例如葡萄糖脱氢酶的溶出，是使洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度随时间变化来进行。另一方面，在阴离子交换层析法中，例如葡萄糖脱氢酶的溶出，是使洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度固定而进行的。另外，也可以使洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度随时间变化而进行目标蛋白质的洗脱。此时，洗脱液浓度的上限，设定为例如3重量％以下、更优选为1.5重量％、最优选为1重量％。即，洗脱液的浓度变化，在例如0～3重量％的范围、更优选为0～1.5重量％的范围、最优选为0～1.0重量％的范围进行。
在本发明的葡萄糖脱氢酶的精制方法中，优选在进行了疏水层析法以后、进行上述阴离子交换层析法。
葡萄糖脱氢酶是例如具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物所产生的。属于Burkhorderia属的微生物，例如是KS1株。
葡萄糖脱氢酶也可以是转化体产生的。转化体，可以通过将从具有葡萄糖脱氢酶产生能力的属于Burkhorderia属的微生物取得的编码上述葡萄糖脱氢酶的DNA导入宿主微生物中而形成。作为宿主微生物来说，可以使用例如恶臭假单胞菌或大肠杆菌。
在本发明的葡萄糖脱氢酶的精制方法中，优选使用将季铵基作为离子交换基的离子交换树脂进行阴离子交换层析法，作为羟基胆烷酸盐，优选使用胆酸盐。


图1表示使用胆酸钠作为洗脱液对从恶臭假单胞菌的转化体得到的粗酶溶液进行精制而得到的酶的SDS-PAGE的结果。
图2表示使用NaCl或KCl作为洗脱液对从恶臭假单胞菌的转化体得到的粗酶溶液进行精制而得到的酶的SDS-PAGE的结果。
图3表示使用胆酸钠作为洗脱液对从大肠杆菌的转化体得到的粗酶溶液进行精制而得到的酶的SDS-PAGE的结果、同时也表示对从恶臭假单胞菌的转化体及KS1株得到的粗酶溶液进行精制而得到的酶。
具体实施例方式
以下，对于本发明的蛋白质的精制方法，以精制葡萄糖脱氢酶(以下称“GDH”)的情况为例，具体地加以说明。
在葡萄糖脱氢酶的精制时，首先，准备酶溶液。就酶溶液来说，可以从产生葡萄糖脱氢酶的微生物或其培养液采取，也可以从导入了由该微生物取得的DNA的转化体或其培养液采取。
就酶溶液来说，在GDH存在于菌体时，通过过滤或离心分离等手段从培养液中采集了菌体后，以机械方法或溶菌酶等的酶方法破坏该菌体，根据需要添加EDTA等螯合剂和表面活性剂，将GDH可溶化，从而得到酶溶液。另一方面，GDH存在于菌体外(培养液中)时，酶溶液可以通过过滤或离心分离等手段从培养液中分离菌体而得到。
作为产生葡萄糖脱氢酶的微生物来说，优选使用例如属于Burkhorderia属的微生物、特别是Burkhorderia cepacia。从该Burkhorderia cepacia，作为例如可溶化膜部分，可以采取酶溶液。可溶化膜部分，例如将离心分离培养液而得到的菌体粉碎，采取细胞提取液，将该细胞提取液进行离心分离，将所得到的上清液进行超离心，由此可以得到沉淀物。菌体的粉碎，按照通常的方法，可以由机械方法或酶方法来进行。
就转化体来说，可以通过以下方法来形成，即，例如取得含有将α亚单位(具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质)和β亚单位(电子传递蛋白质)的表达进行编码的序列的DNA后，将含有该DNA的重组媒介物导入宿主微生物中而形成。
在取得DNA时，首先构筑重组媒介物。该重组媒介物，从产生具有葡萄糖脱氢活性的酶的微生物，分离及精制染色体DNA后，可以使通过切断该染色体DNA的染色体DNA断片或由PCR放大的DNA断片与线型的表达媒介物进行结合闭链来构筑。
作为宿主微生物来说，可以举出以大肠杆菌为代表的肠内细菌群、假单胞菌属和葡萄糖菌属等的革兰氏阴性菌、以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)等芽孢杆菌属细菌为代表的革兰氏阳性菌、Saccharomycescerevisiae等酵母、Aspergillus niger等线状菌。其中，特别优选使用大肠杆菌和属于假单胞菌属的微生物(例如恶臭假单胞菌)。微生物的转化，可以根据例如在埃希氏杆菌属细菌中利用钙处理的感受态细胞法、杆菌属细菌的原生质体法、酵母的KU法或KUR法、线状菌的显微操作法等方法进行。作为转化的方法来说，也可以使用电蚀孔法。
酶溶液的精制，利用液体层析法进行。在由液体层析法进行的精制中，为了得到所要达到的精制程度，就要选择液体层析法的种类、次数和组合。作为液体层析法来说，可以举出凝胶过滤、吸附层析法、离子交换层析法以及亲和层析法。
液体层析法，可以在形成于柱内的固定相中保持目标蛋白质后，连续地供给洗脱液，洗脱目标蛋白质并进行回收，也可以以间歇式进行。在间歇式中，例如在容器内供给填充剂和含有目标蛋白质的试样，使目标蛋白质保持于填充剂中以后，除去杂质，供给洗脱液，从填充剂中洗脱目标蛋白质，回收目标蛋白质。
作为洗脱液来说，使用含有作为洗脱剂的羟基胆烷酸盐的溶液。在由多次液体层析法精制目标蛋白质的情况下，在至少一次的液体层析法中，使用羟基胆烷酸盐作为洗脱液。此时，在最后进行的液体层析法中，优选使用羟基胆烷酸盐作为洗脱液。
作为羟基胆烷酸盐来说，可以举出胆酸盐、甘氨熊脱氧胆酸盐、牛磺甘氨熊脱氧胆酸盐、牛磺熊脱氧胆酸盐、熊脱氧胆酸盐、甘氨胆酸盐、牛磺胆酸盐、甘氨鹅脱氧胆酸盐、牛磺鹅脱氧胆酸盐、甘氨脱氧胆酸盐、牛磺脱氧胆酸盐、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、甘氨石胆酸盐、牛磺石胆酸盐、石胆酸盐等。其中，优选使用胆酸盐、例如胆酸钠。
洗脱液，可以使该液体中的羟基胆烷酸盐浓度固定地与填充剂接触，也可以使羟基胆烷酸盐的浓度与时间同时呈直线变化地供给。
液体层析法，可以从酶溶液直接进行，也可以浓缩酶溶液中的目标蛋白质之后进行。就浓缩来说，可以由例如减压浓缩、膜浓缩、盐析处理、或利用亲水性有机溶剂(例如甲醇、乙醇、丙酮)的分别沉淀法、加热处理、等电点处理进行。
这样得到的精制酶，可以由例如冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥进行粉末化，使之在市场流通。
实施例以下，对上述制造方法的具体例子加以说明，同时，实际证明在使用胆酸钠作为洗脱剂时，与使用NaCl和KCl相比，可以高效率地精制GDH。
<酶溶液的取得方法>
(1)源自Burkhorderia cepacia KS1株的酶溶液的取得Burkhorderia cepacia KS1株的培养，在有氧的培养条件下进行。更具体地说，KS1株的培养如下这样来进行，即，使用20L培养基在34℃下进行8小时的培养，该培养基是将每1升培养液的组成调整为表1所示的那样。
表1培养基组成

接着，在4℃下，用10分钟、以9000×g对本培养液20L进行离心分离，得到了约250g的菌体。回收菌体，冷冻后悬浊在10mM磷酸缓冲液(pH6)中，使用高压均质器(Rannie社、丹麦)、以500bar的压力、数次通过液体，粉碎了菌体膜。通过粉碎菌体膜所得到的细胞提取液，GDH活性是60kU。以8000×g、60分钟离心分离该细胞提取液，除去细胞固形物。再将该上清液在10℃温度下进行17万×g、1小时的超离心分离，回收作为沉淀物的膜部分。
就膜部分来说，为了使最终浓度达到胆酸钠为1.5％、KCl为0.1M，以10mM磷酸缓冲液(pH6)进行再分散，在4℃温度下搅拌一夜。其结果是，得到了含有30kU的GDH的膜部分悬浊液。将该膜部分悬浊液在10℃温度下进行17万×g、90分钟的超离心分离，除去沉淀，得到含有GDH的可溶化膜部分(GDH活性是26kU)。以10mM磷酸缓冲液(pH6)对该可溶化膜部分进行3液透析，将所生成的不溶物在10℃温度下进行17万×g、90分钟的超离心分离，除去沉淀。所得到的上清液(可溶化GDH部分)中的GDH，活性是28kU，比活性是6.8U/mg。
(2)来自转化体的粗酶溶液的取得进行以下的实施例和比较例中的精制时，可分别从宿主不同的2种转化体得到粗酶溶液。
在形成转化体时，首先，将含有编码α、β、γ亚单位的序列的DNA根据通常的方法从KS1株中取得。
接着，将所得到的DNA插入媒介质粒，形成GDH表达用质粒，将其导入宿主微生物进行转化。
作为宿主来说，使用恶臭假单胞菌KT2440株(ATCC47054)和大肠杆菌BL21株。
在使用恶臭假单胞菌KT2440株作为宿主的情况下，使用RSF1010作为插入基因GDH的媒介质粒，在使用大肠杆菌BL21株的情况下，使用pTrc99A作为媒介质粒。另外，在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，始终表达细胞色素C成熟化(Cytochrome C maturationccm)的基因组。首先，根据通常方法从JM109株中取得含有编码大肠杆菌ccm基因组的序列的DNA，将其插入媒介质粒，形成ccm表达用质粒。在此时，使用pBBR122作为媒介质粒。其次，在导入完成GDH表达用质粒的宿主大肠杆菌中，导入ccm表达用质粒，进行转化。
对于各自的转化体，分别进行培养。
恶臭假单胞菌的转化体的情况，如通常那样在有氧气条件下在20L的培养液中进行。培养液的组成设定为3.2％聚蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、2％甘油、0.05mL/Lアデカノ一ルLG-126(旭电化东京)、50μg/mL链霉素(pH7.0)。对于培养液来说，将200mL的前培养液进行植菌，在34℃下开始培养。从开始培养4小时后，添加IPTG(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)，成为0.2mM，再培养20小时，得到本培养液。以夏普勒斯型离心分离机离心分离本培养液，对于恶臭假单胞菌的转化体来说，得到约800g的菌体。
在大肠杆菌的转化体的情况下，就培养来说，如通常那样在有氧条件下在2L培养液中进行。培养液的组成设定为3.2％聚蛋白胨、2％酵母提取物、0.5％NaCl、2％甘油、0.05mL/L アデカノ一ルLG-126(旭电化东京)、50μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素(pH7.0)。对于培养液来说，将50mL的前培养液进行植菌，在30℃下培养29小时。由离心分离从培养液得到约85g大肠杆菌的转化体。
接着，所得到的菌体(转化体)悬浊在10mM磷酸缓冲液(pH8)中，使用高压均质器(500bar)粉碎以后，分别添加マイド一ル12(花王、东京)和KCl，使它们分别为1％和0.1M，搅拌30分钟。接着，通过离心分离(8000×g、60分钟、10℃)，作为沉淀除去细胞固形物，得到上清液为粗酶溶液。
粗酶液，对于恶臭假单胞菌的转化体来说，GDH活性是2930kU、比活性是22U/mg，对于大肠杆菌的转化体来说，GDH活性是259kU、比活性是10.3U/mg。
<葡萄糖脱氢活性的测定方法>
葡萄糖脱氢活性，基于葡萄糖的脱氢化，通过跟踪电子接收体的还原反应来进行。作为电子接收体，使用2，6-二氯苯酚靛酚(DCIP)和菲双甲氧硫酸盐(PMS)。
具体地说，首先在分光光度计的比色皿中添加900μL的含有20mM葡萄糖、2mM PMS和0.1mM DCIP的47mM磷酸缓冲液(pH6.0)，在37℃预培育3分钟。接着，添加0.5～10μL的酶溶液、直接颠倒混合使反应开始，在37℃、经时地测定波长为600nm时的吸光度下降。DCIP的吸收波长是600nm，吸光度降低，基于葡萄糖的脱氢化，是由于电子接收体的还原反应引起的。
这里，在吸光度运算时，DCIP的摩尔吸光系数设为4.76mM/cm。1单位酶(U)，定义为在标准测定条件下，每1分钟氧化1μM的葡萄糖的量。蛋白质浓度，使用UV法测定，280nm处的吸收为1时的蛋白质浓度定义为1g/L。
在本实施例中，根据上述方法，组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制从KS1株得到的酶溶液(可溶化GDH部分)。
疏水层析法，使用由60mM磷酸缓冲液(pH6)预先平衡化的Octylsepharose(辛基琼脂糖凝胶)4Fast Flow柱(44mmID×20cmAmershambiosciences)进行。对于柱来说，为了使最终浓度成为60mM，供给了添加1M磷酸缓冲液(pH6)而配制的可溶化GDH部分(酶溶液)。接着，将600mL的60mM磷酸缓冲液(pH6)、900mL的20mM磷酸缓冲液(pH8)通过柱后，由通过洗脱液将牢固吸附的GDH洗脱。作为洗脱液来说，使用胆酸钠溶解于20mM磷酸缓冲液(pH8)中形成的溶液。以15mL/min的流速供给洗脱液，使得胆酸钠的浓度在0～1重量％的范围内直线地变化。
其结果是，GDH在胆酸钠的浓度约0.8重量％时被溶出，可以回收340mL的具有GDH活性的部分。测定该回收部分(Octyl回收部分)的活性，比活性为108U/mg，总活性是16kU。
阴离子交换层析法，使用由20mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(32mmID×12cm Amershambiosciences)进行。对该柱来说，供给Octyl回收部分后，供给洗脱液。作为洗脱液来说，使用含有1重量％胆酸钠的20mM磷酸缓冲液(pH8)。以流速8mL/min供给600mL洗脱液。
其结果是，洗脱液通过300mL左右时，GDH被特异地溶出，可以回收340mL具有GDH活性的部分。测定该回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是770U/mg，总活性是14kU。
在下述表2示出各操作中的液量、总活性、比活性和收率。
表2
在本实施例中，组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制从恶臭假单胞菌的转化体得到的粗酶溶液。
在疏水层析法中，首先对于由含有0.1M的KCl的10mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的Phenyl cellulofine柱(300mmID×10cmチツソ、东京)，供给粗酶溶液、使GDH保持在填充剂中。接着，将7L含有0.1M KCl的10mM磷酸缓冲液(pH8)、21L的10mM磷酸缓冲液(pH8)通过柱后，由通过1洗脱液将牢固吸附的GDH溶出。作为洗脱液来说，使用胆酸钠溶解于20mM磷酸缓冲液(pH8)形成的溶液。以7L/hr的流速供给洗脱液，使得胆酸钠的浓度在0～1重量％的范围内直线地变化。
其结果是，GDH在胆酸钠的浓度约为0.9重量％时被溶出，可以回收7300mL的活性部分。测定该回收部分(Phenyl回收部分)的活性，比活性是204U/mg，总活性是596kU。
阴离子交换层析法，使用由10mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(44mmID×20cm Amershambiosciences)进行。对该柱来说，供给Phenyl回收部分。Phenyl回收部分，使用部分分子量为50000的实验模块(ラボモジユ一ル)(旭化成东京)，在10mM磷酸缓冲液(pH8)中缓冲置换后供给至柱中。接着，对于柱供给600mL的10mM磷酸缓冲液(pH8)后，供给洗脱液。使用含有1重量％胆酸钠的10mM磷酸缓冲液(pH8)作为洗脱液。洗脱液以流速10mL/min供给。
其结果是，洗脱液通过1400mL左右时，GDH被特异地溶出，回收315mL的活性部分。测定该回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是1283U/mg、总活性是390kU。
在下述表3表示各操作中的液量、总活性、比活性和收率。
表3

本实施例中，还以SDS-PAGE进行了Phenyl回收部分和Q回收部分的电泳。SDS-PAGE，使用Tris-Tricine缓冲液、在8～25％聚丙烯酰胺的梯度凝胶中实施。对在凝胶中泳动的蛋白质来说，进行CBB染色。图1表示了SDS-PAGE电泳的结果。在该图中，路线2表示Phenyl回收部分的CBB染色，路线3表示Q回收部分的CBB染色。
在本实施例中，组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制从恶臭假单胞菌的转化体得到的粗酶溶液。
疏水层析法与实施例2同样地进行，超浓缩回收溶液，得到比活性为300U/mg、总活性为21kU的Phenyl回收部分。
阴离子交换层析法，使用由10mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的QAE-トヨパ一ル550柱(44mmID×10cm东ソ一、东京)进行。对于该柱来说，供给Phenyl回收部分后，供给洗脱液。使用含有1重量％胆酸钠的10mM磷酸缓冲液(pH8)作为洗脱液。洗脱液以流速5mL/min供给2000mL。
其结果是，洗脱液通过1600mL左右时，GDH被特异地溶出，回收300mL的活性部分。测定该回收部分(QAE回收部分)的活性，比活性是1500U/mg、总活性是7.8kU。
在下述表4示出各操作中的液量、总活性、比活性、收率。
表4

本实施例中，以与实施例2同样的方法，以SDS-PAGE进行了QAE回收部分的电泳后，对蛋白质进行CBB染色。图1表示了SDS-PAGE电泳的结果。在该图中，路线4表示QAE回收部分。
本比较例中，组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制从恶臭假单胞菌的转化体得到的粗酶溶液。
疏水层析法与实施例2同样地进行，得到7200mL的比活性314U/mg、总活性256kU的Phenyl回收部分。但是，在本比较例中，对于相当于Phenyl回收部分中的总活性39kU的1100mL(Q apply)，接着进行阴离子交换层析法的说明。
阴离子交换层析法，使用由10mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的Q sepharose Fast Flow柱(44mmID×13cm Amershambiosciences)进行。对于该柱来说，供给Q apply。此后，对于柱供给800mL的10mM磷酸缓冲液(pH8)，洗脱非吸附蛋白质。接着，对于柱供给洗脱液。使用在10mM磷酸缓冲液(pH8)中溶解有NaCl的溶液作为洗脱液。以7.5mL/min的流速供给洗脱液，使得NaCl的浓度在0～0.6M的范围内直线地变化。
其结果是，GDH在NaCl浓度为约0.25M和约0.4M的两处溶出，回收140mL和360mL的回收部分。测定这些回收部分(Q回收部分(1)和Q回收部分(2))的活性，Q回收部分(1)比活性是600U/mg、总活性是4.5kU，Q回收部分(2)比活性是432U/mg、总活性是12kU。
在下述表5表示各操作中的液量、总活性、比活性和收率。
表5

本比较例中，以与实施例2同样的方法，以SDS-PAGE进行了Phenyl回收部分和Q回收部分(2)的电泳后，对蛋白质进行CBB染色。图2表示了SDS-PAGE电泳的结果。在该图中，路线2表示Phenyl回收部分、路线3表示Q回收部分(1)。
本比较例中，在比较例1得到的Phenyl回收部分之中相当于总活性74kU的2100mL(QAE apply)，使用阴离子交换层析法精制GDH。
阴离子交换层析法，使用由10mM磷酸缓冲液(pH8)预先平衡化的QAE-トヨパ一ル550柱(44mmID×10cm东ソ一、东京)进行。对于该柱来说，首先供给QAE回收部分(总活性74kU)。此后，对柱供给800mL的10mM磷酸缓冲液(pH8)，洗脱非吸附蛋白质。接着，对柱供给洗脱液。使用在10mM磷酸缓冲液(pH8)中溶解有KCl的溶液作为洗脱液。以5mL/min的流速供给洗脱液，使得NaCl浓度在0～1M的范围直线变化。
其结果是，GDH在KCl浓度为约0.23M和约0.43M的两处溶出，回收200mL和400mL的回收部分。分别测定这些回收部分(QAE回收部分(1)和QAE回收部分(2))的活性，QAE回收部分(1)比活性是399U/mg、总活性是7.4kU，QAE回收部分(2)比活性是217U/mg、总活性是6.4kU。
在下述表6示出各操作中的液量、总活性、比活性和收率。
表6

本比较例中，以与实施例2同样的方法，以SDS-PAGE进行了QAE回收部分(2)的电泳后，对蛋白质进行CBB染色。图2表示了SDS-PAGE电泳的结果。在该图中，路线4表示QAE回收部分(2)。
本实施例中，组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制从大肠杆菌的转化体得到的粗酶溶液。
疏水层析法，使用Octyl sepharose 4Fast Flow柱、在与实施例1同样的条件下进行。
其结果是，GDH在胆酸钠的浓度约为0.8重量％时被溶出，可以回收220mL具有GDH活性的部分。测定该回收部分(Octyl回收部分)的活性，比活性是503U/mg、总活性是149kU。
阴离子交换层析法，使用Q sepharose Fast Flow柱、在与实施例1同样的条件下进行。
其结果是，洗脱液通过500mL左右时，GDH被特异地溶出，回收175mL具有GDH活性的部分。测定该回收部分(Q回收部分)的活性，比活性是1147U/mg、总活性是50kU。
在下述表7示出各操作中的液量、总活性、比活性和收率。
表7

本实施例中，以与实施例2同样的方法，以SDS-PAGE进行了Q回收部分的电泳后，对蛋白质进行CBB染色。图3表示了SDS-PAGE电泳的结果。在该图中，路线3表示本实施例的Q回收部分。在图3中，对实施例1中的Q回收部分(路线2)和实施例2中的Q回收部分(路线4)也同时进行电泳。
<结果的讨论>
从表2～表7可以看出，使用胆酸钠作为洗脱剂使GDH溶出时(实施例1至4)，与使用NaCl或KCl作为洗脱剂将GDH进行梯度溶出时(比较例1和2)相比，能够最终的比活性高并高效率地精制GDH。关于这一点，在图1和图2中也明确地显示出。即，源自KS1株的GDH，由α、β、γ亚单位组成，这些亚单位在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量，分别是约60kDa、约43kDa和约14kDa。如果站在这一点上看图1和图2，实施例2和3得到的回收部分，与比较例1和2得到的回收部分相比，相当于α、β、γ亚单位的带大、其它分子量的蛋白质变少。因此，可以说组合疏水层析法和阴离子交换层析法来精制GDH时，在使用胆酸钠洗脱GDH时，可以高效率地精制GDH。
另外，从图3可以看出，在使用来自以宿主为大肠杆菌的转化体的粗酶时，虽然相当于γ亚单位的带小，但与使用相当于α、β亚单位的带等其它的粗酶溶液时相比，是很大的。另外，大肠杆菌廉价而且容易得到，同时自己增殖性优异。因此，在考虑到工业性应用的情况下，从以大肠杆菌作为宿主的转化体得到粗酶溶液、精制该粗酶溶液得到GDH的方法可以说是有用的。
权利要求
1.一种蛋白质的精制方法，它是从目标蛋白质溶解的蛋白质溶液、利用液体层析法、精制所述目标蛋白质的方法，其特征在于所述液体层析法包括在填充有填充剂的填充槽中导入所述蛋白质溶液、使所述目标蛋白质保持在所述填充剂中的第一步骤；和使用含有羟基胆烷酸的洗脱液、从所述填充剂中洗脱所述目标蛋白质的第二步骤。
2.如权利要求1所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述目标蛋白质包含电子传递蛋白质。
3.如权利要求2所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述目标蛋白质是含有具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质的葡萄糖脱氢酶。
4.如权利要求1所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述填充剂是离子交换树脂。
5.如权利要求4所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述离子交换树脂具有季铵基作为交换基。
6.如权利要求3所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述电子传递蛋白质在还原条件下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约43kDa，具有所述葡萄糖脱氢活性的蛋白质在还原条件下在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中测定的分子量是约60kDa。
7.如权利要求1所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述羟基胆烷酸盐是胆酸盐。
8.如权利要求1所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述目标蛋白质从所述填充剂中的洗脱，使所述洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度固定地来进行。
9.如权利要求8所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度从0.5～2.5重量％的范围内来选择。
10.如权利要求3所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物产生的。
11.如权利要求10所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述属于Burkhorderia属的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERM BP-7306)。
12.如权利要求3所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是转化体产生的，该转化体是在宿主微生物导入从具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物取得的所述电子传递蛋白质及编码具有所述葡萄糖活性的蛋白质的DNA所形成的。
13.如权利要求12所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是恶臭假单胞菌。
14.如权利要求12所述的蛋白质的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是大肠杆菌。
15.一种葡萄糖脱氢酶的精制方法，它是组合疏水层析法和阴离子交换层析法精制葡萄糖脱氢酶的方法，其特征在于所述疏水层析法包括使所述葡萄糖脱氢酶保持于固定相的步骤；使不需要的蛋白质洗脱的步骤；使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液洗脱所述葡萄糖脱氢酶的步骤，所述阴离子交换层析法包括使所述葡萄糖脱氢酶保持于固定相的步骤；使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液洗脱所述葡萄糖脱氢酶的步骤。
16.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于在所述疏水层析法中，所述葡萄糖脱氢酶的洗脱，使所述洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度随着时间变化来进行，在所述阴离子交换层析法中，所述葡萄糖脱氢酶的洗脱，使所述洗脱液中的羟基胆烷酸盐的浓度固定地来进行。
17.如权利要求16所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于在进行所述疏水层析法之后，进行所述阴离子交换层析法。
18.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物产生的。
19.如权利要求18所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于属于所述Burkhorderia属的微生物是Burkhorderia cepacia KS1株(FERM BP-7306)。
20.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于所述葡萄糖脱氢酶是转化体产生的，该转化体是在宿主微生物中导入从具有产生葡萄糖脱氢酶能力的属于Burkhorderia属的微生物取得的编码所述葡萄糖脱氢酶的DNA所形成的。
21.如权利要求20所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是恶臭假单胞菌。
22.如权利要求20所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于所述宿主微生物是大肠杆菌。
23.如权利要求15所述的葡萄糖脱氢酶的精制方法，其特征在于所述阴离子交换层析法使用具有季铵基作为离子交换基的离子交换树脂来进行，作为所述羟基胆烷酸盐，使用胆酸盐。
全文摘要
本发明涉及从含有电子传递蛋白质的目标蛋白质溶解的蛋白质溶液、利用液体层析法、精制所述目标蛋白质的方法。液体层析法通过如下这样来进行，即，在填充有填充剂的填充槽中导入所述蛋白质溶液，使所述填充剂和所述目标蛋白质结合后，除去杂质，使用含有羟基胆烷酸盐的洗脱液，从所述填充剂中洗脱所述目标蛋白质。目标蛋白质，例如是含有具有葡萄糖脱氢活性的蛋白质的葡萄糖脱氢酶。液体层析法，组合疏水层析法和阴离子交换层析法来进行。
文档编号C07K1/20GK1751119SQ0382473
公开日2006年3月22日 申请日期2003年8月20日 优先权日2002年8月30日
发明者山冈秀亮, 黑坂啓介, 川瀬至道 申请人:爱科来株式会社