专利名称：葡萄糖脱氢酶β亚基及其编码DNA的制作方法
技术领域：
本发明涉及构成葡萄糖脱氢酶β亚基的细胞色素C，编码所述细胞色素C的DNA，以及它们的应用。所述葡萄糖脱氢酶可用于利用酶电极或类似物的葡萄糖传感器。
背景技术：
在多种工业领域都在积极地发展使用与特定的底物特异性反应的酶的生物传感器。关于葡萄糖传感器，它是生物传感器的一种，特别地，主要在医学领域正在积极地发展使用这种方法的测量方法和设备。例如，自从Clark和Lyons于1962年首次报道有关包括葡萄糖氧化酶和氧电极结合起来的生物传感器以来葡萄糖传感器有大约40年的历史(L.c.Clark，J.和Lyonas，C.″Electrode systems forcontinuous monitoring in cardiovascular surgery.″Ann.n.y.Acad.Sci.，10520-45)。
因此，葡萄糖氧化酶作为葡萄糖传感器的酶的应用具有长期的历史。这是因为葡萄糖氧化酶显示对于葡萄糖的高度的底物特异性和优良的热稳定性，这种酶可以进一步大规模地进行生产，并且其生产成本比其它酶要低。高度底物特异性意指这种酶不与除了葡萄糖的糖类反应，这带来了一个益处，即能够在测量值中无误差地获得精确的测量。另外，优良的热稳定性意指能够避免关于酶变性和它的酶活性失活的问题，这带来一个益处，即能够在较长期的时间上进行精确的测量。
但是，尽管葡萄糖氧化酶具有如上所述的益处，它有一个问题，即该酶被溶解的氧所影响并且这影响测量的结果。
同时，除了葡萄糖氧化酶之外，利用葡萄糖脱氢酶(下文称为“葡萄糖脱氢酶”或“GDH”)也已被发展。这种酶也在微生物中发现。例如，有已知的源自芽孢杆菌属(Bacillus)(EC 1.1.1.47)的葡萄糖脱氢酶和源自隐球菌属(Cryptococcus)(EC 1.1.1.119)的葡萄糖脱氢酶。
前一种葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)为一种催化β-D-葡萄糖+NAD(P)+→D-δ-葡萄糖酸内酯+NAD(P)H+H+反应的酶，而后一种葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.119)为一种催化D-葡萄糖+NADP+→D-δ-葡萄糖酸内酯+NADPH+H+反应的酶。上述源自微生物的葡萄糖脱氢酶已经上市。
这些葡萄糖脱氢酶具有一个益处，即它们不会被测量样品中的溶解氧所影响。这带来一种益处，即使当在其中氧分压低的环境中进行测量，或者使用需要大量氧的高浓度样品进行测量时也能够在测量结果中无误差地获得精确的测量。
但是，尽管传统的葡萄糖脱氢酶不被溶解氧所影响，它还有低热稳定性和比葡萄糖氧化酶低的底物特异性的问题。对于用于传感器的酶，期望克服葡萄糖氧化酶和葡萄糖脱氢酶二者缺点的酶。
本发明的发明人在Sode K.，Tsugawa W.，Yamazaki T.，Watanabe M.，Ogasawara N.和Tanaka M.，Enzyme Microb.Technol.，19，82-85(1996)；Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Appli.Biochemi.and Biotec.，77-79/0325(1999)；和Yamazaki T.，Tsugawa W.和Sode K.，Biotec.Lett.，21，199-202(1999)中报道了他们使用收集自温泉附近土壤的样品的关于GDH的研究结果。在那些样品中的微生物产生一种结合辅酶的GDH，并且已清楚酶的特性如最佳反应温度、热稳定性和底物特异性(参见前述文件)。这里所述酶为由具有高度耐热性的催化亚基(α亚基)、电子传递亚基(β亚基)以及未知功能的γ亚基所构成的异低聚酶，并且在45℃和75℃分别观察到其活性峰。另外，所述γ和α亚基基因已被克隆，并且已经清楚前述微生物属于洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)，而且所述β亚基的N-末端氨基酸序列已清楚(Ken Inose，东京农业工程大学硕士论文(2001))。但是，所述β亚基基因的结构尚未被报道。
发明内容
本发明的一个目的是提供编码属于伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的微生物的GDHβ亚基的DNA，以及使用所述DNA的方法。
本发明的发明人进一步进展了在洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDH上的研究并且成功分离了编码GDHβ亚基的DNA，从而完成了本发明。
也就是说，本发明能够如下进行描述。
(1)定义于下面(A)或(B)中的蛋白质(A)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列；(B)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列，包括1-20个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加。
(2)编码定义于下面(A)或(B)中的蛋白质的DNA(A)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列；(B)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列，包括1-20个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加。
(3)根据项目(2)所述的DNA，其中所述DNA定义于下面(a)或(b)中(a)包含由SEQ ID NO15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA；(b)可与由SEQ ID NO15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列在严格条件下杂交的DNA。
(4)根据项目(3)所述的DNA，所述DNA还包含由SEQ ID NO15的核苷酸121-187组成的核苷酸序列。
(5)重组载体，所述重组载体包含根据项目(2)到(4)任一项所述的DNA。
(6)用根据项目(2)到(4)任一项所述的DNA或根据项目(5)所述的重组载体转化的转化体。
(7)生产葡萄糖脱氢酶β亚基的方法，包括培养项目(6)的转化体以产生葡萄糖脱氢酶β亚基作为所述DNA的表达产物，并收集产生的β亚基。
(8)根据项目(3)或(4)所述的DNA，其中所述DNA还包含编码洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶的α亚基和γ亚基的核苷酸序列。
(9)包含根据项目(8)所述的DNA的重组载体。
(10)用根据项目(8)所述的DNA或根据项目(9)所述的重组载体转化的转化体。
(11)生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养根据项目(10)所述的转化体以产生葡萄糖脱氢酶复合物作为所述DNA的表达产物，并收集产生的复合物。
实施本发明的最佳方式下面将详细描述本发明。
本发明的发明人已搜索并分离了编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHβ亚基的DNA。前述的菌株于2000年9月25日保藏于国际专利生物保藏中心，国立先进工业科学与技术学院(中心6，1-1，Higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibarakiken，Japan，postal code305-8566)，并收到微生物登记号FERM BP-7306。在本说明书中，编码GDHβ亚基的DNA有时称为本发明DNA、“β亚基结构基因”或简称为“β亚基基因”。
本发明的发明人已确认由洋葱伯克霍尔德菌KS1株产生的GDH为包含α亚基、β亚基和γ亚基的聚合蛋白质。本发明的蛋白质与出自这些亚基的β亚基相应。GDH的分光光度计分析显示氧化的GDH的吸收波长与葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)和醋酸杆菌(Acetobacter sp.)的醇脱氢酶和醛脱氢酶的吸收波长相似，这些酶由脱氢酶细胞色素复合物组成，并且这种吸收通过热处理消失。这个事实和如下面所述的在β亚基存在和缺失之间GDH最佳反应温度的差异提示，β亚基由细胞色素C组成。
上面的GDH的物理和化学特性在下面显示。
(1)功能该酶催化葡萄糖的脱氢化反应。
(2)该酶由在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示大约60kDa分子量和大约43kDa分子量的亚基组成。
(3)该酶在使用TSK Gel G3000SW(Tosoh公司制造)的凝胶过滤层析中显示大约380kDa的分子量。
(4)最佳反应温度45℃左右(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
α亚基自身的物理和化学特性在下面显示。
(1)′该蛋白质具有葡萄糖脱氢酶活性。
(2)′该蛋白质在还原条件下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示大约60kDa的分子量。
(3)′最佳反应温度75℃左右(Tris-HCl缓冲液，pH8.0)。
所述β亚基能够通过使用GDH活性作为指标纯化GDH的复合物从洋葱伯克霍尔德菌KS1株的培养物中与其它亚基一起获得。GDH的活性能够以与在已知的GDH活性测定中相同的方式进行测量。具体地，所述测定可以如下进行。将包含594μM-甲氧基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM 2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)加入到酶样品和作为底物的葡萄糖中，将混合物在37℃温育。使用分光光度计记录DCIP在600nm的吸光度的变化，并且将吸光度中的下降速率定义为酶反应速率。
此外，由于本发明已经测定了编码所述β亚基的基因的核苷酸序列(SEQ ID NO15)，所述β亚基也能够通过在合适的载体中表达具有所述核苷酸序列的DNA或编码与这种DNA编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列的DNA进行生产。将能够被SEQ ID NO15的开放阅读框(ORF)编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO16。从该蛋白质中测得的β亚基的N-末端氨基酸序列与SEQ ID NO16的氨基酸23-38相同。所以，推测氨基酸1-22为信号肽。注意尽管在SEQ ID NO15和16中氨基酸残基1被描述为缬氨酸，它却有很高的可能性为蛋氨酸并且它还有可能在翻译后被丢掉。
通过BLAST对上述氨基酸序列的同源性检索显示了全面的高度高源性；与源自甘薯青枯病菌(Ralstonia solanacearum)的氧化还原酶脱氢酶的细胞色素C亚基有65％的同源性，与源自氧化葡糖杆菌(Gluconobacter oxydans)的山梨糖醇脱氢酶的细胞色素C亚基有48％的同源性，与源自杓兰欧文氏菌(Eriwinia cypripedii)的葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基有44％的同源性，以及与源自柠檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮-葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基在核苷酸序列水平上有55.7％的同源性或在氨基酸水平上有46.4％的同源性。另外，这些细胞色素C的氨基酸序列保留了一个边缘连接基序(them-linking motif)(SEQ ID NO18)。这些事实显示本发明的β亚基为细胞色素C。
本发明的β亚基可以是具有包含SEQ ID NO16的氨基酸23到425的氨基酸序列的蛋白质，包括在氨基酸序列中的1-20个，优选1到10个，更加优选1到5个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加，只要它可以作为GDHβ亚基起作用即可。注意术语“作为GDH的β亚基起作用”意为“作为细胞色素C起作用而不破坏GDH的酶活性”。
本发明的DNA为编码上述β亚基的DNA并且可以从，例如洋葱伯克霍尔德菌KS1株中获得。在本发明完成的过程中已经从洋葱伯克霍尔德菌KS1株中分离到了本发明的DNA。本发明的DNA可以，例如通过利用具有SEQ ID NO13和14的核苷酸序列的引物以及洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA作为模板的PCR来获得。此外，由于本发明已经确定了本发明的DNA的核苷酸序列以及由该核苷酸序列所编码的氨基酸序列，本发明的DNA也可以通过进行基于这些序列的化学合成来获得。另外，本发明的DNA可以通过利用基于上述序列制备的寡核苷酸作为探针的杂交而从洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA中获得。
本发明的DNA可以是编码具有包含SEQ ID NO16的氨基酸23到425的氨基酸序列的蛋白质，或者具有1-20个，优选1到10个，更加优选1到5个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加的氨基酸序列，并且编码作为GDHβ亚基起作用的蛋白质的DNA。
具体地说，本发明的DNA包括具有由SEQ ID NO15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA。另外，本发明的DNA可以是与SEQID NO15或可以由这一序列制备的探针在严格条件下杂交的，并且编码可作为GDHβ亚基起作用的蛋白质的DNA。所述严格条件包括那些使得具有70％或更多、优选80％或更多，更加优选90％或更多同源性的DNA相互杂交的条件，特别是1×SSC、0.1％SDS和60℃的条件。
可以通过培养含有本发明的DNA或包含本发明的DNA的重组载体的转化体以产生GDHβ亚基作为所述DNA的表达产物，并且通过从微生物细胞或培养基中收集GDHβ亚基来进行GDHβ亚基的生产。在此种情况下，编码本发明的GDHβ亚基的DNA可以与编码α亚基的DNA或进一步与编码γ亚基的DNA结合进行表达以生产GDH复合物。接着可以通过利用具有SEQ ID NO18和19核苷酸序列的引物的PCR来获得编码γ亚基或α亚基的DNA片段。
生产GDHβ亚基或GDH复合物的微生物的例子包括包括大肠杆菌(Bscherichia coli)的肠杆菌；包括假单胞菌(Pseudomonas)和葡糖杆菌的革兰氏阴性菌；包括芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的革兰氏阳性菌；酶母如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；以及霉菌如黑曲霉(Aspergillusniger)。但是，所述微生物并不限于这些并且任何微生物只要它为适合于外源蛋白质生产的宿主微生物都可以加以利用。
用于克隆或表达本发明的DNA的载体是那些适于由质粒或噬菌体构建以进行基因重组的载体，它们可以在宿主微生物中自主地复制。用于大肠杆菌的载体的例子包括pBR322、pUC18、pUC118、pUC19、pUC119、pTrc99A、pBluescript或粘粒SuperCosI。将DNA从用于克隆本发明的DNA的载体转移到其它适于表达等的重组载体，可以通过利用限制性内切酶或通过PCR方法从含有本发明的DNA的重组载体中回收本发明的DNA并将它与载体片段连接而实施。另外，通过对属于埃希杆菌属(Escheriachia)的细胞用钙处理的感受态细胞法、对属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌用原生质法、对霉菌用KU法或KUR法、对霉菌用显微操作法等进行这些载体对微生物的转化。此外，也可以广泛应用电穿孔法。
基于其中目标重组载体的导入的存在或缺失的宿主微生物的筛选可以通过使用含目标DNA的载体的化学抗性标记等来进行。例如，可以筛选能够在基于化学抗性标记的选择性培养基中生长并产生GDH的微生物。
至于转化体的培养方法，可以通过考虑宿主的营养和生理特性来选择培养条件。在许多情况下，优选液体培养基。进行摇动的通气培养在工业上是有利的。
作为所述培养基的营养成份，可以广泛使用那些通过用于微生物培养的成份。作为碳源，可以使用任何可同化的碳化合物，这些会被利用的化合物的例子包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖、糖蜜和丙酮酸等。另外，作为氮源，可以使用任何可利用的氮化合物，这些会被利用的化合物的例子包括胨、肉提取物、酵母提取物、酪蛋白水解产物、豆饼碱性提取物等。此外，根据需要使用镁、钙、钾、铁、锰、锌等的磷酸盐、碳酸盐、硫酸盐，特定的氨基酸，特定的维生素等。
尽管可以在一个范围内适当地变化培养温度，在这样的范围内细菌生长并产生本发明的蛋白质，但培养温度优选为大约20℃到42℃。培养时间在一定程度上依赖于条件而变化。但是，培养可以在据估计给出最大GDH产量的合适的时间结束，培养时间通常为大约12到72小时。尽管可以在一个范围内适当地变化培养基的pH，在这样的范围内细菌生长并产生本发明的蛋白质，但培养基的pH优选在大约6.0到9.0的范围。
可以收集含有在培养物中产生本发明的蛋白质的微生物的细胞的培养基并直接进行利用。但是，当本发明的蛋白质存在于培养基中时，通常通过过滤、离心等以传统的方式将培养基分离成含有本发明的蛋白质和微生物细胞的溶液并且随后进行应用。当本发明的蛋白质存在于细胞中时，通过过滤、离心等手段收集细胞，随后通过机械的方法或酶法如使用溶菌酶进行破碎。另外，将螯合剂如EDTA和表面活性剂加入到细胞中以溶解本发明的蛋白质，根据需要，接下来作为水溶液进行分离和收集。
可以从所得的含蛋白质的溶液例如通过真空浓缩、膜浓缩、用硫酸铵、硫酸钠等盐析，或用亲水的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮进行分级沉淀来将蛋白沉淀出来。另外，热处理和等电点处理也是有效的纯化方式。随后，可以通过利用吸附剂、凝胶过滤剂等的凝胶过滤、吸附层析、离子交换层析和亲和层析的适当组合进行纯化以得到纯化的本发明的蛋白质。
可以通过基于柱层析的分离和纯化获得纯化的酶制剂。尽管这种纯化的酶制剂优选纯化到在电泳(SDS-PAGE)中得到一个单条带的程度，它可能包含α亚基或γ亚基。
这样得到的纯化的酶可以通过，例如冻干法、真空干燥、喷雾干燥等进行粉末化并进行散布。
含有本发明的β亚基、α亚基或必要时γ亚基的GDH复合物，或包含这些的转化体，可以被用于葡萄糖传感器的酶电极。作为电极，可以使用碳电极、金电极、铂电极等，并将本发明的GDH固定到电极上。固定方法的实例包括使用交联剂的方法、将酶置于聚合物基质中的方法、用透析膜封盖酶的方法、使用光交联聚合物、导电性聚合物、氧化还原聚合物等的方法。选择性地，通过与电介质，其典型的例子为二茂铁及其衍生物，共同的吸附作用将酶固定在聚合物中或固定在电极上，或者可以结合使用这些方法。一般地，通过利用戊二醛将本发明的葡萄糖脱氢酶固定在碳电极上，随后通过用含胺基的试剂处理将戊二醛封闭。
可以如下对葡萄糖的浓度进行测量。将缓冲液置于一个恒温槽中，加入介质。随后，保持恒定温度。作为介质，可以使用铁氰化钾、吩嗪甲硫酸盐等。将其上固定着本发明的酶的电极用作工作电极，并使用计量电极(例如，铂电极)和参照电极(例如，Ag/AgCl电极)。在施加恒定电压到碳电极以获得稳态电流后，加入含葡萄糖的样品并测量电流的增加。样品中的葡萄糖浓度可以根据用具有标准浓度的葡萄糖溶液制定的标准曲线来计算。
可以将含本发明的β亚基的GDH复合物用作糖类如葡萄糖的分析试剂盒中的组分。一般地，该试剂盒除了GDH复合物还包括，对分析必要的缓冲液、介质、用于制备标准曲线的例如葡萄糖的标准溶液和试剂盒使用手册。可以以各种形式提供根据本发明的酶，例如作为冻干的试剂或适合的贮存溶液。
实施例下面，将参照实施例对本发明进行具体地描述。
参考实施例1编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHα亚基的基因的分离<1>来自洋葱伯克霍尔德菌KS1株的染色体DNA的制备。
以一种传统的方式从洋葱伯克霍尔德菌KS1株制备染色体基因。即，通过使用TL液体培养基(10克聚蛋白胨，1克酵母提取物，5克NaCl，2克KH2PO4，5克葡萄糖于1升，pH7.2)将细菌菌株于34℃摇动过液。通过离心收集生长的细胞。将细胞悬于含有10mM NaCl、20mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA、0.5％SDS和100μg/ml蛋白酶K的溶液中并在50℃处理6小时。将这一混合物加入等体积的酚-氯仿中并在室温搅拌10分钟，随后通过离心收集上清液。将醋酸钠加入上清液终浓度为0.3M并覆以2倍体积的乙醇以在中间层沉淀染色体DNA。以玻璃棒取出DNA，用70％乙醇洗涤，并溶于适量的TE缓冲液中以获得染色体DNA溶液。
<2>测定GDHα亚基的N-末端氨基酸序列通过冷冻干燥对用与实施例2相同的方式纯化的GDH进行浓缩并通过使用12.5％的SDS电泳进行分离以分离出α亚基。将得到的α亚基转移到一个聚偏乙烯氟化物膜上，随后通过使用氨基酸测序仪(PPSQ-10，Shimadzu公司生产)对N-末端的氨基酸序列进行测定。结果，发现该酶包含由SEQ ID NO3的氨基酸序列的氨基酸号2到12的11个氨基酸残基组成的肽序列。
<3>克隆编码α亚基的基因将在<1>中制备的DNA用限制性内切酶Sau3AI进行部分消化，接着进行小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)处理。单独地，用BamHI对粘粒SuperCosI(获自Stratagene)进行处理并且通过使用T4 DNA连接酶将由用Sau3AI部分消化源自α-15株的染色体DNA片段获得的DNA片段导入SuperCosI中。用得到的重组DNA对大肠杆菌XL-1 Blue MR(获自Stratagene)进行转化。在含10μg/ml新霉素和25μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上基于新霉素抗性和氨苄青霉抗性筛选转化体，所述抗性为在SuperCosI上的抗生素抗性。将得到的转化体在LB液体培养基中进行培养。收集这些转化体细胞并悬于试剂中以测量GDH的活性，并通过利用对葡萄糖的脱氢酶活性作为指标来筛选克隆。结果，获得一个显示葡萄糖脱氢酶活性的克隆。
<4>亚克隆从粘粒SuperCosI中制备含目标基因的DNA片段，SuperCosI含在<3>中获得的编码α亚基的基因。用限制性内切酶NotI将插入基因片段从所述粘粒上剪切下来。用限制性内切酶XbaI处理这些DNA片段并导入用XbaI消化过的质粒pUC18中。用包含各个插入片段的质粒pUC18转化大肠杆菌DH5α-MCR株，收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。将得到的转化体在LB液体培养基中进行培养，继而以与<3>中相同的方式检测这些细胞中的GDH活性。结果获得显示葡萄糖脱氢酶活性的转化体。从这个转化体中提取质粒并分析插入的DNA片段。结果，确认了一个大约8.8kbp的插入片段。将这一质粒命名为pKS1。
<5>测定核苷酸序列进行在pKS1中的插入片段的限制性内切酶分析并根据传统方法测定片段的核苷酸序列。结果，确定了编码在<2>中发现的α亚基的N-末端氨基酸序列的DNA的序列在这个插入的DNA片段中，并发现一个含这一序列的开放阅读框。将测定的核苷酸序列以及可由这个核苷酸序列编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO1和3中。在SEQ ID NO1的核苷酸序列中，从核苷酸号2,386下游的核苷酸序列编码SEQ ID NO4的氨基酸序列，并编码β亚基。
参考实施例2通过重组体大肠杆菌的GDHα亚基的生产由于测定了α亚基的核苷酸序列，利用上述α亚基的结构基因制备一种载体，并用这种载体进一步生产一种转化体。
首先，如下制备插入到载体中的基因。
通过利用源自所述KS1株的基因组片段作为模板的PCR进行扩增从而纳入一个需要的限制性内切酶位点。下面的寡核苷酸引物对用于PCR中。
(正向的)5’-CCCAAGCTTGGGCCGATACCGATACGCA-3’(SEQ ID NO5)(反向的)5’-GAGAAGCTTTCCGCACGGTCAGACTTCC-3’(SEQ ID NO6)用限制性内切酶HindIII消化由PCR扩增的基因并将其插入到一个表达载体pFLAG-CTS(SIGMA)于其克隆位点，HindIII位点。将得到的质粒命名为pFLAG-CTS/α。
用上述质粒pFLAG-CTS/α转化大肠杆菌DH5α-MCR株，并收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。
另外，当在α亚基的上游检索到pKS1插入片段的开放阅读框时，新发现一个含有编码示于SEQ ID NO2(SEQ ID NO1中的核苷酸号258到761)的包括168个氨基酸残基的多肽的507个核苷酸。据认为该结构基因是编码γ亚基的。
由于发现编码γ亚基的区域存在于α亚基的编码区的上游，生产一种包含具有连续地包括γ亚基和α亚基的多顺反子结构的基因的重组载体，并且构建一种导入这种载体的的转化体。
首先，如下制备待插入到载体中的基因。
通过利用源自KS1株的基因组片段作为模板的引物的PCR进行扩增从而纳入所需要的限制性内切酶位点，所述基因组片段连续地包括γ亚基的结构基因和α亚基的结构基因。下面的寡核苷酸引物对用于PCR中。
5’-CATGCCATGGCACACAACGACAACACT-3’(SEQ ID NO7)(反向的)5’-CCCAAGCTTGGGTCAGACTTCCTTCTTCAGC-3’(SEQ ID NO8)将由PCR扩增的基因的5’末端和3’末端分别用NcoI和HindIII消化，并将该基因插入载体pTrc99A(Pharmacia)在它的克隆位点，NcoI/HindIII位点。将所得的质粒命名为pTrc99A/γ+α。
用上述质粒pTrc99A/γ+α转化大肠杆菌DH5α-MCR株，并收集出现在含50μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂糖培养基上的菌落。
利用以每种上述质粒pKS1、pFLAG-CTS/α和pTrc99A/γ+α转化的大肠杆菌DH5α-MCR株生产α亚基。将每种转化体接种到3ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中并在37℃培养12小时，通过离心收集细胞。通过French press(1,500kgf)将细胞破碎，并通过超速离心(4℃，160，400×g，90分钟)分离膜部分(10mM磷酸钾缓冲液，pH6.0)。
参考实施例3确定GDH的活性首先，确定在每种上述膜部分中的GDH的活性。具体地，通过利用包含594μM的甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM的2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)进行可视的测定。结果显示如下，+号代表由蓝色到无色的改变程度。
培养的用pFLAG-CTS/α转化的转化体的膜级分+培养的用pKS1转化的转化体的膜级分++培养的用pTrc99A/γ+α转化的转化体的膜级分+++培养的只包含α亚基的用pFLAG-CTS/α转化的转化体的膜级分的GDH活性最低，而培养的用pTrc99A/γ+α转化的转化体的膜级分的GDH活性最高，用pTrc99A/γ+α有效地构建了一种载体。
尽管α亚基甚至在以只使用α亚基的结构基因的载体转化的转化体中得以表达，α亚基能够通过使用一种含γ亚基的结构基因和α亚基的结构基因相结合的载体而有效地获得。
使用本发明的葡萄糖脱氢酶测定葡萄糖。通过使用具有各种浓度的葡萄糖测量本发明的葡萄糖脱氢酶(α亚基)的酶活性。GDH活性在包含594μM的甲基吩嗪甲硫酸盐(mPMS)和5.94μM的2，6-二氯靛酚(DCIP)的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.0)中进行测量。加入酶样品和作为底物的葡萄糖，接着在37℃培养，并通过使用分光光度计监测DCIP在60nm的吸光度的改变。测量吸光度的下降速率作为酶的反应速率。可以用本发明的GDH对葡萄糖在0.01-1.0mM的范围内进行量化。
实施例1编码洋葱伯克霍尔德菌KS1株的GDHβ亚基的基因的分离<1>洋葱伯克霍尔德菌KS1株GDHβ亚基的检索使用桑格中心(httpwww.sanger.ac.uk/)的洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库检索源自KS1株的GDHβ亚基的基因。根据已知的KS1株的GDHβ亚基(SEQ ID NO9)的N-端序列，设计一种与源自醋酸杆菌或葡糖杆菌的醇脱氢酶(Tamaki等，Biochim Bioohys Acta1088(2)292-300(1991)，Matsushita K.等，Biosc.Biotech.Biochem.，56，304-310(1992)，Takemura H.等，J Bacteriol，175，6857-66(1993)，Kondo K.等，Appl Environ Microbiol，63，1131-8(1997))；源自欧文氏菌(Erwinia sp.)或假单胞菌(Pseudomonas sp.)的葡糖酸脱氢酶(Yum DY等，J Bacteriol，179，6566-72(1997)，Matsushita K.等，J Biochem，85，1173-81(1979))；源自葡糖杆菌(Gluconobacter sp.)的山梨糖醇脱氢酶(Choi，E.S.等，FEMS Microbiol.Lett.，125，45-50(1995))；和源自欧文氏菌或泛菌(Pantoea sp.)的2-酮葡糖酸脱氢酶(Pujol CJ等，J Bacteriol，182，2230-7(2000))的每种细胞色素C亚基都具有高度同源性的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。
在上述氨基酸序列的基础上，从上述洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库中检索编码具有高度同源性的氨基酸序列的基因序列。随后，检索获得的五个序列与KS1株的GDHα亚基的C-末端的同源性。结果，由两个基因片段翻译的氨基酸序列显示了高度的同源性(大于90％)。每个基因片段短至200到500bp，从而通过BLAST从洋葱伯克霍尔德菌J2315株基因组文库中检索与这些序列具有高度同源性的序列并将这些片段相互连接。结果，获得了一个3,110bp的片段。在所获得的核苷酸序列中，存在据推测为GDH的C-末端的ORF和一个1,275bp的据推测为细胞色素C结构基因的开放阅读框(SEQ IDNO11)。由该开放阅读框编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO12。在所获得的J2315株的核苷酸序列和已被克隆的KS1株的α亚基的核苷酸序列之间的比较显示在所述α亚基的下游，包含与编码J2315株的细胞色素C信号肽的核苷酸序列具有高度同源性的核苷酸序列。
由上面的内容，推测在参考实施例1中所得的洋葱伯克霍尔德菌KS1株的克隆片段的第三个开放阅读框(SEQ ID NO1的核苷酸2386)编码β亚基。在纯化的β亚基的N-末端的氨基酸序列对应于由包含SEQID NO1中的核苷酸2452到2466的核苷酸序列所翻译的5个氨基酸残基，这也提示上述的开放阅读框编码β亚基。
<2>使用反向PCR方法扩增β亚基结构基因(1)微生物细胞的培养和基因组的提取使用5ml的完全培养基(0.5％的多聚蛋白胨，0.3％的酵母提取物，0.5％的NaCl)，在37℃过夜摇动培养KS1株。利用GennomicPrepTM细胞及组织DNA分离试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)从所获得的微生物细胞中提取基因组。根据所附的手册进行该方法。将所得的基因组进行酚/氯仿处理并用乙醇沉淀，随后在纯化的水中溶解。
(2)基因组片段的环化用BamHI、EcoRI、HindIII、SmaI、SacI和XhoI消化从KS1株中提取的基因组并通过用乙醇沉淀回收基因组片段。随后，利用DNA连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司)在16℃过夜对1μg用限制性内切酶消化的基因组进行连接反应。
(3)PCR将50pmol基于在KS1株的GDHβ亚基的N-末端信号序列区中的核苷酸序列设计的正向引物(EF1 SEQ ID NO13)、50pmol反向引物(ER1 SEQ ID NO14)(所有引物均委托Invitrogen合成)、0.5ml的LATaq(Takara生物有限公司)、8μl的dNTP溶液和5μl的10×PCR缓冲液加入到纯化的水中以得到总体积50μl，利用程序温度控制系统PC-801(ASTEC)进行PCR。PCR反应在下列条件下进行在94℃5分钟、98℃ 20秒、62℃ 30秒、72℃ 6分钟的30个循环之后，72℃ 10分钟。
当使用采用限制酶(SmaI)消化的基因组作为模板时，在琼脂糖电泳上证实了约2.1kbp的片段。
<3>PCR扩增片段的测序(1)TA克隆在将上述反向PCR产物在琼脂糖凝胶上进行电泳后，切出条带并用Gene clean II试剂盒(Biol0l inc.)进行纯化。用pGEMR-T和pGEMR-T EASY载体系统(Promega)将片段连接到pGEM-T载体上去。用连接的载体转化大肠杆菌DH5α，将转化体在含50μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml X-gal和0.1μM IPTG的LB琼脂培养基中培养过夜。从显现的菌落中，挑选白色菌落并在含50μg/ml氨苄青霉素的L培养基中过夜培养，随后通过碱法从细胞中提取质粒。
(2)序列样本的制备以RNA酶处理得到的质粒并加入0.6倍体积的20％PEG6000/2.5M的NaCl。将混合物置于冰上1小时。此后，将混合物于15,000转/分4℃离心15分钟以获得沉淀。将沉淀用70％的乙醇洗涤并在真空中干燥。将干燥过的产品溶于纯化的水中。
(3)DNA的核苷酸序列的分析利用ABI PRISMTM310遗传分析仪(PERKIN-ELMER AppliedBiosystems)对在(2)中获得的质粒的插入片段的核苷酸序列进行分析。利用M13引物从该载体的多克隆位点测定该插入片段的一部分序列。结果，确定了含有已经分析过的β亚基的N-末端的核苷酸序列。基于这一序列，接着制备引物并用于对插入片段的核苷酸序列进行测序。结果显示于SEQ ID NO15。另外，将由在所述核苷酸序列中的开放阅读框所编码的氨基酸序列显示于SEQ ID NO16。
所述β亚基共有425个氨基酸残基，从与已获得的N-末端氨基酸序列的比较中，认为其中的22个残基为信号肽。基于氨基酸序列计算的β亚基的分子量为45,276Da并且排除了信号肽的那部分的分子量42,731Da基本上与KS1株的GDHβ亚基的分子量43Da相同。在β亚基的氨基酸序列中，连接细胞色素C中的边缘的连接基序(SEQ IDNO18)在3个位置被确定。开放阅读框被定位于α亚基的结构基因的开放阅读框的紧邻的下游，而被推测为SD序列的序列存在于起始密码子上游。
通过BLAST对得到的氨基酸序列的同源性检索显示了全面的高度同源性；与源自甘薯青枯病菌的氧化还原酶脱氢酶的细胞色素C亚基有65％的同源性，与源自氧化葡糖杆菌的山梨糖醇脱氢酶的细胞色素C亚基有48％的同源性，与源自杓兰欧文氏菌(Eriwinia cypripedii)的葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基有44％的同源性，以及与源自柠檬泛菌(Pantoea citrea)的2-酮-葡萄糖酸脱氢酶的细胞色素C亚基在氨基酸水平上有46.4％的同源性。另外，这些细胞色素C的氨基酸序列保留了边缘连接基序(SEQ ID NO18)。
KS1株的GDHβ亚基的结构基因与J2315株的GDHβ亚基的结构基因在核苷酸序列水平上具有92.0％的同源性而在氨基酸水平上具有92.2％的同源性。
工业实用性本发明提供了属于伯克霍尔德菌属的微生物的GDHβ亚基以及编码它的DNA。
序列表<110>SODE，Koji<120>葡萄糖脱氢酶及其编码DNA<130>G780-OP1551<141>2003-04-25<150>JP 2002-125353<151>2002-04-26<160>19<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>2467<212>DNA<213>洋葱伯克霍尔德菌<220>
<221>CDS<222>(258)..(761)<220>
<221>CDS<222>(764)..(2380)<220>
<221>CDS<222>(2386)..(2466)<400>1aagctttctg tttgattgca cgcgattcta accgagcgtc tgtgaggcgg aacgcgacat 60gcttcgtgtc gcacacgtgt cgcgccgacg acacaaaaat gcagcgaaat ggctgatcgt 120tacgaatggc tgacacattg aatggactat aaaaccattg tccgttccgg aatgtgcgcg 180tacatttcag gtccgcgccg atttttgaga aatatcaagc gtggttttcc cgaatccggt 240gttcgagaga aggaaac atg cac aac gac aac act ccc cac tcg cgt cgc290Met His Asn Asp Asn Thr Pro His Ser Arg Arg1 5 10cac ggc gac gca gcc gca tca ggc atc acg cgg cgt caa tgg ttg caa 338
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370 375 380Lys Pro Asp Glu Leu Asp Ala Gln Ile Arg Asp Arg Ser Ala Arg Tyr385 390 395 400Val Gln Phe Asp Cys Phe His Glu Ile Leu Pro Gln Pro Glu Asn Arg405 410 415Ile Val Pro Ser Lys Thr Ala Thr Asp Ala Ile Gly Ile Pro Arg Pro420 425 430Glu Ile Thr Tyr Ala Ile Asp Asp Tyr Val Lys Arg Gly Ala Ala His435 440 445Thr Arg Glu Val Tyr Ala Thr Ala Ala Lys Val Leu Gly Gly Thr Asp450 455 460Val Val Phe Asn Asp Glu Phe Ala Pro Asn Asn His Ile Thr Gly Ser465 470 475 480Thr Ile Met Gly Ala Asp Ala Arg Asp Ser Val Val Asp Lys Asp Cys485 490 495Arg Thr Phe Asp His Pro Asn Leu Phe Ile Ser Ser Ser Ala Thr Met500 505 510Pro Thr Val Gly Thr Val Asn Val Thr Leu Thr Ile Ala Ala Leu Ala515 520 525Leu Arg Met Ser Asp Thr Leu Lys Lys Glu Val530 535<210>4<211>27<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德菌<400>4Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp20 25<210>5<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的说明引物<400>7catgccatgg cacacaacga caacact 27<210>8<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>8cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 31<210>9<211>16<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德菌<400>9Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15<210>10<211>25<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明一致<220>
<221>不确定的<222>(6，17，18，19，22)<223>Xaa＝未知的<400>10Ala Asp Ala Ala Asp Xaa Ala Leu Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala1 5 10 15Xaa Xaa Xaa Asp Cys Xaa Ala Cys His20 25仸<210>11<211>2410<212>DNA<213>洋葱伯克霍尔德菌<220>
<221>CDS<222>(673)..(1950)<400>11gatggaccac ccgggcaccg gcgtgtcgtt ctacgcgaac gagaagctgt ggccgggccg 60cggcccgcag gatatgacgt cgctgatcgg tttccgcgac ggcccgttcc gcgcgaccga 120agccgcgaag aagatccatc tgtcgaacat gtcccgcatc aaccaggaga cgcagaagat 180cttcaaggcc ggcaaactga tgaagcacga ggagctcgac gcgcagatcc gcgaccgttc 240cgcgcgctac gtgcagttcg actgcttcca cgagattctg ccgcagcccg agaaccgcat 300cgtgccgagc aagacggcca ccgacgcgat cgggatcccg cgccccgaga tcacgtatgc 360gatcgacgat tacgtgaagc gcggcgccgt gcacacgcgc gaggtctacg cgacggccgc 420gaaggtgctg ggcggcaccg acgtcgtctt caacgacgag ttcgcgccga acaaccacat 480cacgggcgcg aggatcatgg gcgcggatgc acgcgactcg gtcgtcgaca aggactgccg 540cacgttcgac catccgaacc tgttcctctc gagcagctcg acgatgccga ccgtcggtac 600ggtgaacgtg acgctgacga tcgcggcgct cgcgctgcgg atgtcggaca cgctgaagaa 660ggaagtctga cc gtg cgg aaa tct act ctc acc ttc ctc ctc gcc ggc tgc 711Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys1 5 10ctc gcg ctg ccc ggc ctc gca cgc gcg gcc gat tcg gcc gat ccg gcg 759Leu Ala Leu Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala15 20 25cat gtc aag cgc ggc gaa tac ctc gcc gtc gcg ggc gac tgc atg gca 807
His Val Lys Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala30 35 40 45tgc cac acc gcg aag ggc ggc aag ccg ttc gcg ggc ggc ctc ggc atg 855Cys His Thr Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met50 55 60ccg gtg ccg atg ctc ggc aag atc tat acg agc aac atc aca ccg gat 903Pro Val Pro Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp65 70 75ccc gat acc ggc atc ggc aac tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg 951Pro Asp Thr Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala80 85 90gtg cgg cac ggc gta tcg aag aac ggc gac aac ctg tac ccg gcg atg 999Val Arg His Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met95 100 105ccg tac gtg tcg tac gcg aag atc aac gac gac gac gtg caa gcg ctg 1047Pro Tyr Val Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu110 115 120 125tac gcg tac ttc atg cac ggc gtc gaa ccg gtc aag cag gcg ccg ccg 1095Tyr Ala Tyr Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro130 135 140aag aac gag atc ccc gcg ctg ctg agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc 1143Lys Asn Glu Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile145 150 155tgg aac tgg ctg ttc ctg aag gac ggc gtg tac cag ccg aag ccc gag 1191Trp Asn Trp Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu160 165 170cag agc gcc gag tgg aac cgc ggc gcc tat ctc gtg cag ggc ctc gcg 1239Gln Ser Ala Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala175 180 185cac tgc agc acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag 1287His Cys Ser Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys190 195 200 205tcg ctc gac gaa acg ggc ggc agc ttc ctg tcg ggc tcg gtg ctc gcg 1335Ser Leu Asp Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala210 215 220ggc tgg gac ggc tac aac atc acg tcc gac ccg aac gcg ggg atc ggc 1383Gly Trp Asp Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly225 230 235ggc tgg acg cag cag cag ctc gtc cag tac ctg cgc acc ggc agc gtg 1431Gly Trp Thr Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val240 245 250ccg ggc ctc gcg cag gcg gcc ggc ccg atg gcc gag gcg atc gag cac 1479Pro Gly Leu Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His255 260 265
agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc ggc ccg atg gcc gag 1527Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu270 275 280 285gcg atc gag cac agc ttc tcg aag atg acc gaa gcc gac atc ggc cgc 1575Ala Ile Glu His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg290 295 300tcg tcg tgg ggc aag ccg gcc gag gat ggc ctg aag ctg cgc ggc gtc 1623Ser Ser Trp Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val305 310 315gcg ctc gcg tcg tcg ggc atc gat ccg gca ccg ctg tat ctc ggc aac 1671Ala Leu Ala Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn320 325 330tgc gcg acc tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggt tac 1719Cys Ala Thr Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr335 340 345tac ccg ccg ttg ttc cac aac tcg acg gtc ggc gcg tcg aat ccg acc 1767Tyr Pro Pro Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr350 355 360 365aac ctc gtg cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag gcc ggc agc 1815Asn Leu Val Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser370 375 380gag gac gtc ggg atg ccc gcg ttc cgc cac gag ctg tcg gat gcg cag 1863Glu Asp Val Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln385 390 395atc gcc gcg ctg acg aac tac ctg acg ggg cag ttc ggc aat ccg gcc 1911Ile Ala Ala Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala400 405 410gcg aag gtg acc gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga aacgcggcac1960Ala Lys Val Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg415 420 425gcggcgaggc agggcaacaa tagaaaagag gaggagcaca gcacatcggg cgggccccga 2020tgccggttgt tgcagagcgg gacgggcggc gcaggcggtc gcccgtcctg gttcacaggc 2080aatccggtgc gcgcacgccg cgcatcgttt tcgttgatcg agaccatgac accgaaccaa 2140ccgtttctcg cgtcccagcg cgatgtgctg ctgctgctgt cccgaatcct gctcgtgatc 2200ctgttcgtga tgttcggctg gaagaagatt atcgacttct ccggtacgat cgcgttcatg 2260ggcagcgagg gcgcgccggc gccgatcatc tcggcggcga tctccgtcgt gatggagctc 2320atcgtcggga ttgcgatcct cgtcggtttc cagacgcggc cgctcgcgct gttgcttgcg 2380ctgtacacga tcggtaccgg catcatcggc 2410<210>12<211>425<212>PRT<213>洋葱伯克霍尔德菌
<400>12Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Leu Ala Arg Ala Ala Asp Ser Ala Asp Pro Ala His Val Lys20 25 30Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Val Ala Gly Asp Cys Met Ala Cys His Thr35 40 45Ala Lys Gly Gly Lys Pro Phe Ala Gly Gly Leu Gly Met Pro Val Pro50 55 60Met Leu Gly Lys Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr65 70 75 80Gly Ile Gly Asn Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110Ser Tyr Ala Lys Ile Asn Asp Asp Asp Val Gln Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160Leu Phe Leu Lys Asp Gly Val Tyr Gln Pro Lys Pro Glu Gln Ser Ala165 170 175Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ser Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Gly Trp Thr225 230 235 240Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Leu245 250 255Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu His Ser Phe Ser260 265 270Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Gly Pro Met Ala Glu Ala Ile Glu275 280 285His Ser Phe Ser Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Arg Ser Ser Trp290 295 300Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Pro Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Pro
340 345 350Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Thr Asn Leu Val355 360 365Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ala Gly Ser Glu Asp Val370 375 380Gly Met Pro Ala Phe Arg His Glu Leu Ser Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400Leu Thr Asn Tyr Leu Thr Gly Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425<210>13<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>13tgcaccgtgc ggaaatctac tctcact 27<210>14<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>14acttccttct tcagcgtgtc cgacatc 27仸<210>15<211>1441<212>DNA<213>洋葱伯克霍尔德菌<220>
<221>CDS<222>(121)..(1398)<400>15
tccgaacctg ttcatttcga gcagcgcgac gatgccgacc gtcggtaccg taaacgtgac 60gctgacgatc gccgcgctcg cgctgcggat gtcggacacg ctgaagaagg aagtctgacc 120gtg cgg aaa tct act ctc act ttc ctc atc gcc ggc tgc ctc gcg ttg 168Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15ccg ggc ttc gcg cgc gcg gcc gat gcg gcc gat ccg gcg ctg gtc aag 216Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30cgc ggc gaa tac ctc gcg acc gcc atg ccg gta ccg atg ctc ggc aag 264Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45atc tac acg agc aac atc acg ccc gat ccc gat acg ggc gac tgc atg 312Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60gcc tgc cac acc gtg aag ggc ggc aag ccg tac gcg ggc ggc ctt ggc 360Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80ggc atc ggc aaa tgg acg ttc gag gac ttc gag cgc gcg gtg cgg cac 408Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95ggc gtg tcg aag aac ggc gac aac ctg tat ccg gcg atg ccg tac gtg 456Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110tcg tac gcg aag atc aag gac gac gac gta cgc gcg ctg tac gcc tac 504Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125ttc atg cac ggc gtc gag ccg gtc aag cag gcg ccg ccg aag aac gag 552Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140atc cca gcg ctg cta agc atg cgc tgg ccg ctg aag atc tgg aac tgg 600Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160ctg ttc ctg aag gac ggc ccg tac cag ccg aag ccg tcg cag agc gcc 648Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175gaa tgg aat cgc ggc gcg tat ctg gtg cag ggt ctc gcg cac tgc agc 696Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190acg tgc cac acg ccg cgc ggc atc gcg atg cag gag aag tcg ctc gac 744Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205gaa acc ggc ggc agc ttc ctc gcg ggg tcg gtg ctc gcc ggc tgg gac 792Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220
ggc tac aac atc acg tcg gac ccg aat gcg ggg atc ggc agc tgg acg 840Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240cag cag cag ctc gtg cag tat ttg cgc acc ggc agc gtg ccg ggc gtc 888Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255gcg cag gcg gcc ggg ccg atg gcc gag gcg gtc gag cac agc ttc tcg 936Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270aag atg acc gaa gcg gac atc ggt gcg atc gcc acg tac gtc cgc acg 984Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285gtg ccg gcc gtt gcc gac agc aac gcg aag cag ccg cgg tcg tcg tgg 1032Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300ggc aag ccg gcc gag gac ggg ctg aag ctg cgc ggt gtc gcg ctc gcg 1080Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320tcg tcg ggc atc gat ccg gcg cgg ctg tat ctc ggc aac tgc gcg acg 1128Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr325 330 335tgc cac cag atg cag ggc aag ggc acg ccg gac ggc tat tac ccg tcg 1176Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350ctg ttc cac aac tcc acc gtc ggc gcg tcg aat ccg tcg aac ctc gtg 1224Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365cag gtg atc ctg aac ggc gtg cag cgc aag atc ggc agc gag gat atc 1272Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380ggg atg ccc gct ttc cgc tac gat ctg aac gac gcg cag atc gcc gcg 1320Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400ctg acg aac tac gtg acc gcg cag ttc ggc aat ccg gcg gcg aag gtg 1368Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415acg gag cag gac gtc gcg aag ctg cgc tga catagtcggg cgcgccgaca 1418Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425cggcgcaacc gataggacag gag 1441<210>16<211>425<212>PRT
<213>洋葱伯克霍尔德菌<400>16Val Arg Lys Ser Thr Leu Thr Phe Leu Ile Ala Gly Cys Leu Ala Leu1 5 10 15Pro Gly Phe Ala Arg Ala Ala Asp Ala Ala Asp Pro Ala Leu Val Lys20 25 30Arg Gly Glu Tyr Leu Ala Thr Ala Met Pro Val Pro Met Leu Gly Lys35 40 45Ile Tyr Thr Ser Asn Ile Thr Pro Asp Pro Asp Thr Gly Asp Cys Met50 55 60Ala Cys His Thr Val Lys Gly Gly Lys Pro Tyr Ala Gly Gly Leu Gly65 70 75 80Gly Ile Gly Lys Trp Thr Phe Glu Asp Phe Glu Arg Ala Val Arg His85 90 95Gly Val Ser Lys Asn Gly Asp Asn Leu Tyr Pro Ala Met Pro Tyr Val100 105 110Ser Tyr Ala Lys Ile Lys Asp Asp Asp Val Arg Ala Leu Tyr Ala Tyr115 120 125Phe Met His Gly Val Glu Pro Val Lys Gln Ala Pro Pro Lys Asn Glu130 135 140Ile Pro Ala Leu Leu Ser Met Arg Trp Pro Leu Lys Ile Trp Asn Trp145 150 155 160Leu Phe Leu Lys Asp Gly Pro Tyr Gln Pro Lys Pro Ser Gln Ser Ala165 170 175Glu Trp Asn Arg Gly Ala Tyr Leu Val Gln Gly Leu Ala His Cys Ser180 185 190Thr Cys His Thr Pro Arg Gly Ile Ala Met Gln Glu Lys Ser Leu Asp195 200 205Glu Thr Gly Gly Ser Phe Leu Ala Gly Ser Val Leu Ala Gly Trp Asp210 215 220Gly Tyr Asn Ile Thr Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ile Gly Ser Trp Thr225 230 235 240Gln Gln Gln Leu Val Gln Tyr Leu Arg Thr Gly Ser Val Pro Gly Val245 250 255Ala Gln Ala Ala Gly Pro Met Ala Glu Ala Val Glu His Ser Phe Ser260 265 270Lys Met Thr Glu Ala Asp Ile Gly Ala Ile Ala Thr Tyr Val Arg Thr275 280 285Val Pro Ala Val Ala Asp Ser Asn Ala Lys Gln Pro Arg Ser Ser Trp290 295 300Gly Lys Pro Ala Glu Asp Gly Leu Lys Leu Arg Gly Val Ala Leu Ala305 310 315 320Ser Ser Gly Ile Asp Pro Ala Arg Leu Tyr Leu Gly Asn Cys Ala Thr
325 330 335Cys His Gln Met Gln Gly Lys Gly Thr Pro Asp Gly Tyr Tyr Pro Ser340 345 350Leu Phe His Asn Ser Thr Val Gly Ala Ser Asn Pro Ser Asn Leu Val355 360 365Gln Val Ile Leu Asn Gly Val Gln Arg Lys Ile Gly Ser Glu Asp Ile370 375 380Gly Met Pro Ala Phe Arg Tyr Asp Leu Asn Asp Ala Gln Ile Ala Ala385 390 395 400Leu Thr Asn Tyr Val Thr Ala Gln Phe Gly Asn Pro Ala Ala Lys Val405 410 415Thr Glu Gln Asp Val Ala Lys Leu Arg420 425<210>17<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明边缘结合基序<220>
<221>不确定的<222>(2，3)<223>Xaa＝未知的<400>17Cys Xaa Xaa Cys His1 5<210>18<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>18catgccatgg cacacaacga caacact 27<210>19<211>27
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的说明引物<400>19cccaagcttg ggtcagactt ccttcttcag c 3权利要求
1.定义于下面(A)或(B)中的蛋白质(A)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列；(B)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列，包括1-20个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加。
2.编码定义于下面(A)或(B)中的蛋白质的DNA(A)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列；(B)蛋白质，其具有至少包含SEQ ID NO16的氨基酸23-425的氨基酸序列，包括1-20个氨基酸残基的替换、删除、插入或添加。
3.根据权利要求2所述的DNA，其中所述DNA定义于下面(a)或(b)中(a)包含由SEQ ID NO15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列的DNA；(b)可与由SEQ ID NO15的核苷酸187-1398组成的核苷酸序列在严格条件下杂交的DNA。
4.根据权利要求3所述的DNA，所述DNA还包含由SEQ ID NO15的核苷酸121-187组成的核苷酸序列。
5.重组载体，所述重组载体包含根据权利要求2到4任一项所述的DNA。
6.用根据权利要求2到4任一项所述的DNA或根据权利要求5所述的重组载体转化的转化体。
7.生产葡萄糖脱氢酶β亚基的方法，包括培养权利要求6的转化体以产生葡萄糖脱氢酶β亚基作为所述DNA的表达产物，并收集产生的β亚基。
8.根据权利要求3或4所述的DNA，其中所述DNA还包含编码洋葱伯克霍尔德菌的葡萄糖脱氢酶的α亚基和γ亚基的核苷酸序列。
9.包含根据权利要求8所述的DNA的重组载体。
10.用根据权利要求8所述的DNA或根据权利要求9所述的重组载体转化的转化体。
11.生产葡萄糖脱氢酶复合物的方法，包括培养根据权利要求10所述的转化体以产生葡萄糖脱氢酶复合物作为所述DNA的表达产物，并收集产生的复合物。
全文摘要
利用基于GDHβ亚基的N－末端信号序列区的碱基序列设计的引物，通过反向PCR获得编码所述β亚基的DNA片段，所述GDH源于洋葱伯克霍尔德菌KS1株。
文档编号C12N1/21GK1650006SQ0380938
公开日2005年8月3日 申请日期2003年4月25日 优先权日2002年4月26日
发明者早出广司 申请人:早出广司