专利名称：：黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的制作方法
技术领域：
：本发明涉及辅酶结合型葡萄糖脱氢酶及其用途。本发明具体涉及以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶，以及该酶的生产菌、该酶的制造方法、使用该酶的葡萄糖测定法等。
背景技术：
：近年来，广泛应用的是采用电化学生物传感器的简易型自我血糖测定器。生物传感器是在绝缘性的基板上形成电极、酶反应层而形成的。作为其中可以使用的酶，可以例举葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖氧化酶(GO)等。现已指出使用GO的方法容易受到测定试样中所溶解氧的影响，溶解氧对测定结果产生影响这样的问题。另一方面，作为不受溶解氧影响且在不存在NAD(P)下作用于葡萄糖的酶，已知有以吡咯查啉醌(PQQ)作为辅酶的GDH(PQQ-GDH)(例如，参照专利文献1-3)。但是，PQQ-GDH中却存在着如下问题(l)PQQ容易被酶解离，(2)对葡萄糖选择性低，以及(3)由于一般存在于膜馏分中因此其提取分离操作有困难等。可是，近年来报道了，在医院使用简易血糖自我测定器的患者中发生低血糖等的病例。随后的调查分析的结果是，PQQ-GDH与作为输液成分而含有的麦芽糖反应，显示出比实际血糖值更高的值，从而清楚了其是这种发病例的原因(医药品■医药用具等安全性情报206号(PharmaceuticalsandMedicalDevicesSafetyInformationNo.206)，平成16年(2004年)IO月，厚生劳动省医药食品局)。由于有这样的事情，而迫切希望开发特异性作用于葡萄糖，尤其是与麦芽糖的作用性低的血糖测定用酶。而且，除了PQQ-GDH之外，作为不受溶存氧的影响且在不存在NAD(P)下与葡萄糖作用的酶，已知有以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(本说明书中也称为"FAD-GDH")。迄今为止分别从5米曲霉(Aspergillusoryzae)(非专利文献1~4)和土曲霉(Aspergillusterreus)(专利文献4)中获得了FAD-GDH。专利文献l:特开2000-350588号>5^才艮专利文献2:特开2001-197888号公报专利文献3:特开2001-346587号公报专利文献4:国际公开第2004/058958号小册子非专利文献l:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.I.Inductionofitssynthesisbyp國benzoquinoneandhydroquinone，T.C.Bak，andR.Sato，Biochim.Biophys.Acta，139，265-276(1967).非专利文献2:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.II.Purificationandphysicalandchemicalproperties，T.C.Bak，Biochim.Biophys.Acta，139，277-293(1967).非专利文献3:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.III.Generalenzymaticproperties,T.C.Bak,Biochim.Biophys.Acta，146,317-327(1967).非专利文献4:StudiesontheglucosedehydrogenaseofAspergillusoryzae.IV.Histidylresidueasanactivesite,T.C.Bak,andR.Sato，Biochim.Biophys.Acta，146,328-335(1967).
发明内容本发明是在上述背景下以提供可以更正确地测定葡萄糖量的新酶及其生产菌以及其用途作为课题。本发明人为了解决上述课题，首先关注于以黄素腺嘌呤双核苷酸作为辅酶的葡萄糖脱氢酶(FAD-GDH)。而且，以广泛微生物作为对象进行筛选的结果是，发现了在FAD-GDH的生产性上优异的菌抹。鉴定的结果判明为米曲霉(Aspergillusoryzae)。而且，还成功纯化出该菌林生产的FAD-GDH，确定其各种性状。根据所确定的各种性状，判断该FAD-GDH是一种新酶。而且，还表明该FAD-GDH对葡萄糖的选择性优异，而且难以受到存在于反应系中的溶解氧的影响，可以更正确地测定试样中的葡萄糖量。另一方面，确认了其它菌林(米曲霉)生产与该FAD-GDH同等的酶。进一步研究的结果是，成功确定了上述菌林所具有的FAD-GDH的氨基酸序列以及编码它的基因的序列。本发明基于上述认识及成果，提供如下所示的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶等。具备以下性状的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，(1)作用催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-5-内酯的反应，(2)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色镨法测得的分子量为约400kDa,(3)底物特异性对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。中记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对麦芽糖的反应性为5%以下。根据[1或[2]中记载的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-半乳糖的反应性为5%以下。黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶基因，其由选自以下的(A)~(C)中任意一个DNA构成(A)编码序列号20所示的氨基酸序列的DNA;(B)由序列号19所示的碱基序列构成的DNA;(C)具有与序列号19所示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺噤呤双核普酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。11]含有[10中记载的基因的载体。12导入了[10中记载的基因的转化体。中记载的转化体的步骤；(ii)回收产生的前述蛋白质的步骤。葡萄糖测定法，其特征在于，使用[1~[8中任一项记载的黄素腺噤呤双核普酸结合型葡萄糖脱氢酶测定试样中的葡萄糖。表8,i，io-邻二氮杂菲终浓度(mM)米曲霉来源的fad-gdh抑制效果(％)0050—25—10385211213.米曲霉BB-56林的鉴定(l)方法(l-l)菌林米曲霉BB-56(1-2)培养基组成参考Klich,M.A.(2002).Identi打cationofCommonAspergillusspecies.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures,116pp.的报告，调制出以下培养基。CYA培养基lgK2HP04，10mLCzapek浓缩物，5g酵母提取物(Difco),30g蔗糖，15g琼脂(和光)，1000mL纯化7jCCZ培养基lgK2HP04，10mLCzapek浓缩物，30g蔗糖，17.5g琼脂(和光)，lOOOmL纯化水CY20S培养基lgK2HP04,10mLCzapek浓缩物，5g酵母提取物(Difco),200g蔗糖，15g琼脂(和光)，1000mL纯化水MEA培养基20g麦芽提取物(Difco)，20g葡萄糖，lg细菌蛋白胨(Difco)，15g琼脂(和光)，lOOOmL纯化水PDA培养基使用马铃薯右旋糖琼脂(荣研)。Czapek浓缩物30gNaNO3,5gKCl,5gMgS047H20，0.1gFeSO47H20,0.1gZnSO47H20,0.05gCuSO4'5H20，lOOmL纯化水(1-3)表现性状生长程度，于25C或37X:培养7天，测定菌落的直径。在CYA培养基、CZ培养基、CY20S培养基、MEA培养基中观察生长状态(25匸，7天)。形态观察在CYA培养基、于251C培养下进行(培养6~21天)。用扫描型电子显微镜进行分生孢子表面的观察，在CYA培养基中25匸培养15天，通过锇酸蒸汽固定进行处理，观察。菌落的色调按照日本园芸植物标准色卡(财团法人日本色彩研究所发行)。(2)结果(2-1)生长程度(菌落的直径)各种培养基中的生长程度(培养7天)如下表所示。[表9表9.各培养基中的生长程度(培养7天)培养基米曲霉BB-5625。C37。CCYA59-62誦3-5mmCZ33-38mm2-3mmCY20S49-56mm3-8mmMEA52-64mm2-3mmPDA44-54mm2-4mm(2-2)生长状态各种培养基中的生长状态(251C，培养7天)如下表所示。而且，颜色按照日本园芸植物标准色卡(财团法人日本色彩研究所发行)(括号内的数字为色卡编号)。[表1034表10各培养基中的生长状态(25TC,培养7天)<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(2-3)形态参考Raper，K.B.&Fennell,D.I.(1965).ThegenusAspergillus.Williams&WilkinsCo.,Baltimore,686pp、Kozakiewicz，Z.(1989).Aspergillusspeciesonstoredproducts.MycologicalPapers.No.161:1-188、Klich，M.A.(2002).IdentificationofCommonAspergillusspecies.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures，116pp.、Samson,R.A.Hoekstra,E.S.Frisvad,J.C&Filtenborg，O.(2002).Introductiontofood-andairbornefungi,6thedn，pp.64-97.Utrecht:CentraalbureauvoorSchimmelcultures，389pp.，则米曲霉BB-56其菌落颜色是浓绿黄色或暗绿黄色(表7),生长程度在CYA培养基(25C培养7天)中为59-62mm，在MEA培养基(25匸，培养7天)中为52-64mm(表6),分生孢子头呈放射状这样的緩柱状，分生孢子柄由顶嚢向下没有中间变细，单列和2列的曲霉混合存在，顶嚢呈亚球形或瓶状，其直径为10~42jim,分生孢子为亚球形或球形，其大小为5.6~8.8x5.2~8.8nm,表面为光滑表面或略微粗糙的表面(表8)，由此确认其为米曲霉。[表11表ll.在CTA培养基中的形态<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>14.米曲霉BB-56来源FAD-GDH的鉴定(l)氨基酸序列的分析培养米曲霉(Aspergillusoryzae)BB-56，用6.所示的方法对获得的纯化酶进行等电点分离。将获得的纯化酶提供给采用凝胶PAGMiniDAIICHI7.5(第一化学药品林式会社)的SDS-PAGE。使用转印緩冲液1(0.3MTris(pH10.4)，20%甲醇)，转印緩冲液2(30mMTris(pH10.4)，20%甲醇)，转印緩冲液3(40mM6-氨基已酸(pH7.6)，20。/。甲醇)作为转印緩沖液，将电泳后的凝胶转印到PVDF膜上。转印操作，在阳极侧使用转印緩冲液1，在含有膜的中央部位使用转印緩冲液2，在阴极侧使用转印緩冲液3，用半干转印装置，在定电流0.8mA/PVDF膜cm2，90min的条件下进行。转印后进行CBB(考马斯亮蓝R-250)染色、切出该酶相应的条带，作为N末端氨基酸序列分析用试样。同样，对电泳后的凝胶进行CBB染色，切出该酶相应的条带，照原样作为内部氨基酸序列分析用试样。分析的结果清楚了N末端氨基酸序列和内部氨基酸序列。(2)通过N末端氨基酸序列进行的同源性检索从特开2005-176602的申请人获得特开2005-176602公开的米曲霉RIB40的基因信息中的全CDS序列，用数据库软件Kirokuver.3(WorldFusion公司)，实施依据已经清楚的N末端氨基酸序列的同源性检索。其结果确认葡萄糖氧化酶前体与具有同源性的某种氨基酸序列(特开2005-176602的序列表中的序列号20494)之间有高同源性。同序列中还存在与通过内部氨基酸序列分析已经清楚的氨基酸序列一致的区域。根据这些事实，清楚了同序列(序列号l)对应于该酶的氨基酸序列。(3)由米曲霉BB-56提取基因组用装入了100mlYPD培养基(1%酵母提取物,2%蛋白胨，2%葡萄糖)的广口瓶将米曲霉BB-56于30X:培养一夜后，用布氏漏斗和Nutsche吸滤瓶过滤培养液，获得菌体。于-80lC冷冻后，通过冷冻干燥获得的重量约0.3g的菌体与1药匙的海砂一起用乳钵、乳棒破碎，然后悬浮于12ml提取緩沖液(l%十六烷基三甲基铵，0.7MNaCl,50mMTris-HCl(pH8.0),10mMEDTA，1%巯基乙醇)中。在室温下连续旋转搅拌30分钟后，加入等量的苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)溶液进行搅拌，进行离心分离(1500g，5分钟，室温)获得了上清。在获得的上清中加入等量的氯仿异戊醇(24:1)溶液进行搅拌，然后进行离心分离(1500g，5分钟，室温)。在所获得的上清中緩緩加入等量的异丙醇。用70%乙醇对通过该处理析出的染色体DNA进行离心分离(20000g，10分钟，4C)而获得的沉淀进行清洗，然而进行真空干燥。将这样获得的染色体DNA再次溶解到4mlTE中，加入200n110mg/mlRNaseA(Sigma-AldrichJapan公司)后，于37匸温育30分钟。然后，加入40H1的20mg/ml蛋白酶K,重组，PCRGrade(Rochediagnostics7〉司)溶液，于37匸温育30分钟后，加入等量的苯酚氯仿异戊醇(25:24:1)溶液。搅拌后，进行离心分离(1500g，5分钟，室温)，从而获得了上清。重复进行2次这种清洗操作后，在获得的上清中加入等量的氯仿异戊醇(24:1)溶液进行搅拌，然后进行离心分离(1500g，5分钟，室温)。通过在所获得的上清中加入其1/10容量的3MNaOAc(pH4.8)和2倍容量的乙醇，于-80X:冷却使染色体DNA析出。通过离心分离(20000g,20分钟，4X:)析出的染色体DNA进行回收。用70%乙醇清洗回收的染色体DNA后，真空干燥，最后溶解于400pl的TE溶液，获得了浓度为约lmg/ml的染色体DNA溶液。(4)合成引物的设计合成相当于编码序列号1的氨基酸序列(特开2005-176602的序列表中的序列号20494所示的序列)的总链长为3226bp的RIB40林来源的基因序列(序列号2)的5，、3，两末端序列的合成引物FG-F、FG-R(序列号3、4)。(5)通过PCR法进行的FAD-GDH基因的扩增以(3)中调制的染色体DNA作为模板来实施PCR反应。反应使用TAKARALA-TaqTM(takarabio公司)，反应液组成按照所附的常规方法。加入引物(FG-F、FG-R)，使之终浓度分别为0.4jiiM，加入模板基因组使之终浓度达到10ng/jLil,然后实施PCR。反应循环如下。即，重复进行35个由94匸反应2分钟后，94X:反应30秒，60匸反应30秒，721C反应10分钟构成的循环，最后在721C反应IO分钟。反应结束后，于4"C保存试样。(6)FAD-GDH基因的碱基序列分析将PCR反应液提供给琼脂糖电泳，分离扩增片段和引物，用GENECLEANIII(BIO101公司)从琼脂糖凝胶中提取。将提取的扩增片段亚克隆到载体pUC19(Takarabio公司)的Smal位点。然后，对亚克隆的质粒pFG2的相当于该酶基因的区域实施碱基序列分析。测序反应用BigDyeTMTerminatorv3.1循环测序试剂盒(Appliedbiosystemjapan公司)，按照制品的使用说明书进行测序反应。分析中使用ABIPRISM310测序仪(Appliedbiosystemjapan乂>司)。为了实施该酶基因的碱基序列分析，合成了合成引物FG-l(序列号5)、FG-2(序列号6)、FG-3(序列号7)、FG-4(序列号8)、FG-5(序列号9)、FG-6(序列号10)、FG-7(序列号11)、FG-8(序列号12)、FG-9(序列号13)、FG-10(序列号14)、FG-11(序列号15)、FG-12(序列号16)、M13-M5(序列号17)、M13-RV2(序列号18)。碱基序列分析的结果是，清楚了序列号19所示的总链长为3241bp的米曲霉BB-56来源的该酶基因序列。根据该酶基因序列预测的该酶基因的氨基酸序列示于序列号20。产业上利用的可能性本发明的FAD-GDH底物特异性优异，可以更为正确地测定葡萄糖量。因此，本发明的FAD-GDH可以说适于血糖值的测定、食品(调味料、饮料等)中的葡萄糖浓度的测定等中。本发明不限于上述发明的实施方式和实施例说明。在不脱离专利请求的范围的记载，而本领域技术人员可以容易想到的范围内的各种变化形态都包含于本发明中。本说明书中援引公开的论文、公开特许公报和特许公报等内容的全部。权利要求1、具备以下性状的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶(1)作用催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应，(2)分子量通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的分子量为约400kDa，(3)底物特异性对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。2、根据权利要求1所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对麦芽糖的反应性为5%以下。3、根据权利要求1或2所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-半乳糖的反应性为5%以下。4、根据权利要求1~3中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，将其对D-葡萄糖的反应性设为100%时对D-果糖和D-甘露糖的反应性均为5%以下。5、根据权利要求1~4中任一项所述的黄素腺噤呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状(4)最适pH:7附近，(5)最适温度:60"C附近，(6)pH稳定性:在pH3.0~7.0的范围内稳定，(7)温度稳定性:在40n以下稳定。6、根据权利要求1~5中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其还具备以下性状(8)Km值对于D-葡萄糖的Km值为约8mM。7、根据权利要求1~6中任一项所述的黄素腺噤呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其是来源于米曲霉的酶。8、根据权利要求1~7中任一项所述的黄素腺噪呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，其特征在于，具有序列号20所示的氨基酸序列、或与该氨基酸序列同源的氨基酸序列。9、具有生产黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的保藏编号为NITEBP-236的米曲霉BB-56。10、黄素腺嘌呤双核香酸结合型葡萄糖脱氢酶基因，其由选自以下的(A)~(C)中任意一个DNA构成(A)编码序列号20所示的氨基酸序列的DNA;(B)由序列号19所示的碱基序列构成的DNA;(C)具有与序列号19所示的碱基序列同源的碱基序列，且编码具有黄素腺噪呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶活性的蛋白质的DNA。11、含有权利要求10所述的基因的栽体。12、导入了权利要求10所述的基因的转化体。13、黄素腺噪呤双核苦酸结合型葡萄糖脱氢酶的制造方法，其包括以下的步骤(1)和(2)、或步骤(i)和(ii):(1)培养具有生产权利要求7所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶能力的米曲霉的步骤；(2)由培养后的培养液和/或菌体回收黄素腺噤呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶的步骤；(i)在产生所述基因编码的蛋白质的条件下培养权利要求12所述的转化体的步骤；(ii)回收产生的所述蛋白质的步骤。14、葡萄糖测定法，其特征在于，使用权利要求1~8中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶测定试样中的葡萄糖。15、葡萄糖测定用试剂，其特征在于，含有权利要求1~8中任一项所述的黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶。16、葡萄糖测定用试剂盒，其含有权利要求15所述的葡萄糖测定用试剂。全文摘要本发明提供了一种黄素腺嘌呤双核苷酸结合型葡萄糖脱氢酶，该酶(1)具有催化在电子受体存在下氧化葡萄糖的羟基而生成葡萄糖酸-δ-内酯的反应的作用，(2)通过SDS-聚丙烯酰胺电泳测得的分子量为约100kDa，通过凝胶过滤色谱法测得的分子量为约400kDa，(3)对麦芽糖、D-果糖、D-甘露糖和D-半乳糖的反应性低。而且，还提供了生产该酶的米曲霉。而且，还提供了采用该酶的葡萄糖测定法、葡萄糖测定用试剂和葡萄糖测定用试剂盒。文档编号C12N9/04GK101454443SQ200780019640公开日2009年6月10日申请日期2007年5月25日优先权日2006年5月29日发明者田中宪彰,结城健介申请人:天野酶株式会社