核糖－核糖醇－磷酸之寡糖衍生物及含有它们的疫苗的制作方法

专利名称：核糖－核糖醇－磷酸之寡糖衍生物及含有它们的疫苗的制作方法
技术部分本发明涉及医药领域，尤其涉及核糖-核糖醇-磷酸衍生的寡糖混合物之化学合成，并涉及含有该寡糖混合物的疫苗，其中所述寡糖混合物被用作疫苗中的活性成分，用于防止由流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)b型(Hib)引起的感染。
纯化的流感嗜血菌荚膜多糖可在成人中诱导保护性免疫，但对儿童则诱导很低的免疫反应，特别是2岁以下的婴儿对其没有免疫反应。
荚膜多糖具有以下结构 已经表明主要问题是抗原的自身特性，由于它是一种多糖，为T细胞不依赖性抗原，不能刺激尚未成熟之婴儿的免疫系统。已表明该问题可通过将多糖与公知为载体的蛋白质共价连接(结合)而解决。这样得到的产物公知为结合疫苗，其可诱导2个月大的婴儿产生保护性水平的抗体。
Chu等人，(感染免疫(Infection immunity)1983，40，245-256)将天然的荚膜多糖与溴化氰活化的破伤风类毒素偶联，获得了结合物。
Gordon(美国专利号4,496,538)用溴化氰活化天然的多糖，然后将它通过已二酸二酰肼与白喉类毒素偶联。
Hilman等人(美国专利号4,459,286)将经最初活化后的天然多糖通过6-氨基己酸与脑膜炎球菌的外膜蛋白偶联。
在所有上面的结合方法中，共价连接是在荚膜多糖和载体蛋白质的几个基团之间进行的。
对婴儿诱导保护性免疫的能力依赖于偶联物的结构。当使用在的多糖进行偶联时，由于参与连接的基团随机分布在多糖链上，从而使每一批的表征变得很复杂。
通过物理化学方法对所有这些疫苗进行分析是非常困难的；因此常规方法是通过研究对实验动物的免疫原性，从而对每一批进行评价。但是偶联物对儿童与它对实验动物的行为是不同的。
按照世界卫生组织(WHO)的稳定质量标准(M.R.Holliday和C.Jones，生物学(Biologicals)，1999，27，51-53)，偶联疫苗的控制应基于使用物理化学方法来阐明批与批之间的相似性。
为了促进这项工作，更应该在分子水平上定义偶联疫苗。解决该问题的另一方法是合成荚膜多糖片段。通过合成来构建流感嗜血菌b型抗原的方法有两步主要步骤合成二糖中间体以及其寡聚化。针对该合成已经研究了一些途径。
Beuvery等人(欧洲专利申请EPO0276516；美国专利5,034,519；四面体快报(Tetrahedron Lett.)28，1553，1987)和Hoogerhout等人(糖化学杂志(J.Carbohydr.Chem)，7，1988，399-416)通过合成荚膜多糖片段而获得，其中申请专利的荚膜多糖片段含有3至20个重复单位。为达到该目的，首先制备二糖中间体2，然后通过固相化学或溶液合成，制备含6个重复单位的寡聚体(Elie等人，Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 108，1989，219)。寡聚体通过间隔臂与蛋白质或肽结合。在小鼠身上，偶联物三聚体与市售的由荚膜多糖制备的疫苗一样，具有免疫原性。
在一个优选的实施方案中，阐述了下述的合成途径，使用了以下策略1-合成核糖醇，2-与核糖偶联，3-向核糖单位选择性导入取代基，以及4-导入磷活化基团。用这种途径，可在仅15个反应步骤后得到关键的二糖衍生物2。 总产率为7％(Hermans等人，Recl.Trav.Chim.Pays-Bas 1987，106，498-504)。进一步地，该方法有两个主要的不足之处该方法包括11次层析步骤；并且对寡聚化的处理而言，其关键中间物的保护基团不理想。
在寡聚化时，或合成的第二步，所用方法为通过活化磷酸三酯而进行的溶液合成，使得基于二糖的每个循环的产率在70-90％之间。此类步骤的主要不足之处在于不可能制备含有多于4个重复单位的片段，因为其产率快速下降。二糖中间体2有三个不同的保护基团，这使得终产物的去保护非常困难。因此该二糖较不便于用固相化学法进行寡聚化作用。因为六聚体的合成已报道之故。
只在免疫测定法一文中(Peters CCAM等人，感染免疫(Infect.Immunity)1991，59，3504-10)报道了三聚体与破伤风类毒素的偶联及其对小鼠和猴的免疫原性。
G.Just，J.Upeslacis(欧洲专利申请EP0320942，L.Chan；G.Just，四面体(Tetrahedron)，46，1990，151-162)也通过二糖中间体合成了荚膜多糖片段，并且是在溶液化学中合成的。为了制备最佳的抗原合成中间体，选择了不同的途径1-合成核糖醇，2-合成具有充分保护基团的核糖单位，3-偶联核糖和核糖醇，以及4-导入磷活化功能。 用这种方法，将中间体3制备为氨基磷酸酯(phosphoramidite)，其在寡聚化处理时显示对保护基团的较好选择性。为达到这个目的，需要较多的步骤。于第19步可获得关键的衍生物，并且使用了8次层析步骤来进行纯化。
在溶液中使二糖3寡聚体化，得到含有3个重复单位的荚膜多糖片段，其基于二糖的产率为每个循环70-90％之间。
Kandil等人(合成快报(Syn.Lett.)，1992，555-7)，Chon等人(PCT专利申请WO93/15205和美国专利5,679,352)用同样的二糖中间体3并且通过固相化学法，合成了荚膜多糖的片段。用单甲氧基聚乙烯二醇作为支持物，获得的片段含有多至6个重复单位，每个循环的产率为95％。
Krivan等人(PCT专利申请WO94/00149)以及Nilsson等人(糖化学杂志10，1991，1-22)用类似的二糖中间体及固相化学法，获得了10个重复单位的片段。该片段通过间隔臂与Hib粘附素偶联。用21步获得了该膦酸酯中间体，总产率为5％。也至少需要7次层析步骤。用H-膦酸酯进行寡聚化处理，并且用Merrifield氨化树脂进行固相化学法。可获得每个循环97-99％掺入的抗原。
Chiu Machado等人(糖化学杂志，13 1994，465-474)和古巴专利22424报道了由葡萄糖合成适当的、被保护的核糖衍生物之有效步骤。他们用该衍生物，在20个反应步骤内制备出了关键的二糖。
使得合成应用于Hib片段的制备，以及将它们用作疫苗困难的诸方面之一是二糖中间体的合成。
上面列出的所有方法反映了现代糖化学的当今技术水平，然而它们在技术上存在两个主要严重的不足。在合成中多次使用层析步骤，从而使该合成在工业规模上不实用，而且合成步骤往往较多。用较少的反应步骤合成二糖中的主要问题在于向核糖单位中导入了苄基。
对二糖中间体的寡聚化处理可以在溶液中进行，但极不方便，可达到的最大尺寸限于3-4个重复单位。也可通过固相化学法进行。固相化学法可使制备的寡糖含有6至10个重复单位，并且每个循环高产率。但通常存在的两个严重问题是实际产率只有10-15％，因为每个循环中为了得到高掺入的二糖中间体，往往需要高过量的二糖，在3至10摩尔当量之间。过量的二糖在处理过程中是松散的。另一个问题是通常需要两种不同的衍生物，一个用于与固相支持物偶联，第二个用于链的延伸。
合成单一的、纯的寡糖片段是上述报道之合成Hib抗原的共同处，同时是它们的主要目的之一，其中所述寡糖片段不仅在结构，而且在链长度上均无差异。所有这些基于以下假定单一分子组成的抗原对获得较稳定质量的抗Hib结合疫苗是必需的，因为它较易控制。
已开发了用天然多糖片段制备寡糖片段的新方法，也开发了通过它们的末端位置之一活化寡糖混合物的新方法。
美国专利4,808,700、美国专利4,761,283以及复合糖杂志(Glycoconjugate J.)，1989，6，489-498(R.C.Seid等人)中，用peryodate氧化天然多糖并纯化所得到的片段。寡糖片段之混合物通过两个末端位置而被活化，如下列方案所示。这些寡糖通过还原性氨化反应，与CRM197结合。这一点可从该方案中看出，两个偶联位点是不同的。一旦进行偶联，至少存在具不同结构的两个结合寡糖家族。另一方面，寡糖的百分比不能很好地决定同一寡糖与同一蛋白质的两个不同位点，或与两个不同蛋白质分子的连接结果。所有这些现象会产生异质性，并使控制变得困难。 另一方面，在美国专利5,153,312以及疫苗(Vaccine)1999，17，1251-63(P.Constantino等人)中，报道了用乙酸水解天然多糖，并纯化所得到的寡糖片段混合物。产物通过一系列的反应活化，其中间隔臂在高pH及会影响寡糖混合物的完整性的温度下，用1，2-乙二胺通过还原性氨化作用导入。另一方面，一部分抗原在其羰基半缩醛经还原后，可能失活，这一点如下列方案所示。进一步地，通过己二酸末端酯官能基之一，寡糖胺类衍生物被己二酸的活化酯选择性取代。其余的酯官能基仍然有可与蛋白质偶联的活化功能， 由天然多糖片段之产物而制备的两种疫苗已实用于对大量儿童的免疫接种。这表明可以使用寡糖生产抗Hib的偶联疫苗，同时充分控制产品的重复性及质量是可能的，其中所述寡糖不是单一大小，而是在一定的大小范围内。即使通过这种方法获得的偶联物比那些通过多糖直接活化获得的产物更确定，但在实际上，对天然多糖片段片段化，随后导入功能活化基团，并达到如化学合成得到的抗原同样水平的抗原分子定义和纯度是不可能的。
对使用具有明确大小的寡糖，还是使用大小不一但其余结构同质的寡糖混合物之偶联疫苗的控制上，没有明显的优势。先进的实验已阐明了这一点，通过当今技术水平的分析方法很容易测定Hib寡糖混合物的组成(P.Constantino等人，疫苗1999，17，1251-1263和D.Prioeti等人，欧洲糖讨论会(European CarbohydrateSymposium)，Galway，1999年7月，PB014)。
另一方面，由大小不一的Hib寡糖混合物组成的疫苗与由单一大小的寡糖(当片段大于三个重复单位时)组成的疫苗之间，免疫行为没有差异(S.Pillai等人，感染与免疫(Infection and Immunity)，1991，59，4371-6；A.A Kandil等人，复合糖杂志，1997，14，13-7和Peters CCAM，等人，感染免疫1991，59，3504-10)。
所有观点都认为额外的一些情况使选择最佳的单一大小困难。4-6个重复单位的寡糖较易合成，并且它们的大小通常足以诱导充分的免疫反应。但该疫苗所必需的载体蛋白质的量很高，且疫苗中寡糖的稳定性较差，因为通过磷酸二酯的水解作用而发生的降解过程很快驱使很小的、少于4个重复单位的片段与蛋白质偶联，并因此失活。具有大小在8-20个重复单位的片段原则上较稳定，因为在降解为它们的一半大小后，剩余的与载体蛋白质偶联的片段仍大于4个重复单位。对疫苗剂量所必需的载体蛋白质的量也较少。
但根据Hib寡糖的现有技术，用溶液方法合成大小在10-20之间的片段是不可能的，并且这对固相法也是一个挑战。实际上，在以前报道的实例中根本没有这种大小的寡糖。另一个不利之处是免疫反应的T细胞依赖性，而这对儿童达到好的免疫反应却是一个非常重要的方面。多糖的T细胞依赖性随其大小的增加而降低(C.Fernández，E.Sverremark，细胞免疫(Cell Immunol)1994，153，67-78)。
总之，任一具有竞争力的合成Hib抗原的方法必须是可减少到达关键二糖的步骤，减少层析步骤的次数，且特别显著地增加在寡聚化处理过程中的产量。
通过水解天然多糖而获得的寡糖混合物含有两种大小间隔的组分，它们各取所长并且减少了不足。如果通过合成可获得类似的混合物，其必将具有含有两种大小间隔的优势。由于是通过合成获得的，该混合物将更确定和更纯，并且含有精确比例和精确位置的间隔臂。
本发明之通过化学合成获得的寡糖混合物包含至少5个具有结构A或B的化合物，其重复单位的公式为(磷酸-核糖-核糖醇)n或(核糖-核糖醇-磷酸)n，其代表流感嗜血菌b型之荚膜多糖的重复单位，且只有n是不同的，其中n是在4和25之间的一个值(n4且25)，R1或R2是用来与载体偶联的间隔臂，其条件为如果R2＝H，则R1＝间隔臂，或如果R1＝H，则R2＝间隔臂。 本发明也涉及含有此类寡糖混合物的免疫原，以及含有该免疫原的疫苗，还有制备这些寡糖混合物的方法。进一步地，本发明包括疫苗的用途，其可单独或与其它疫苗联用，用来防止由流感嗜血菌b型引起的感染。
根据本发明可通过化学合成能以较有效的方式获得、能充分定义大小的规则寡糖混合物。该混合物具有较高的纯度，并且它是用较简单的技术方法获得的。此外发现用本发明之混合物制备的偶联疫苗是极好的，因为它们的生产及较易于控制。
本发明的另一个目的是获得上述寡糖混合物的合成方法，其可表征为一步法，其在于对关键的二糖、间隔臂和助聚剂之间受控的缩聚反应，并且也可根据以下事实表征抗原的平均大小可通过对每个参与成分的比例、它们的加入顺序及反应时间来控制。
本发明的另一个目的是上述免疫原将其制备为疫苗，以抵抗流感嗜血菌b型引发的疾病的用途，其中用或不用佐剂或其它添加剂。
本发明的另一个目的是前面描述的混合物与其它疫苗结合或不结合制备联合疫苗的用途，其中所述其它疫苗如抗乙型肝炎、DPT、抗脑膜炎球菌A、B、C、抗肺炎球菌1、5、6B、6A、14、19F、19A、23F和抗脊髓灰质炎的疫苗。
本发明的另一个目的是优化关键的二糖合成方法，其中所述二糖为合成Hib寡糖所需。优化包括发现了一个新的、用于二糖4的选择性苄基化反应，使其转化为二糖5，在一步中将苄基保护性基团导入核糖单位，使整个方法明显变短和变简单。 本发明的目的也有优化合成中间体4的步骤，使其在11步内能以高纯度制备，并且未使用层析方法。
本发明的另一目的是前面描述的寡糖的用途，其与免疫惰性物质(如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、乳胶)结合，用于抗-Hib抗体的检测和定量。
本发明的新颖之处是所得到的寡糖混合物之组成，其随带有间隔臂的流感嗜血菌b型荚膜多糖的重复单位的不同而不同，其中间隔臂只与其末端位置之一结合，且该位置是合成时预先设计的。它反应了同样的规则和同质结构。该寡糖混合物含有两种不同大小间隔的片段，主要在4-8和8-20之间，以得到每种间隔的优点并减少了每组基团单独存在时的缺点。
进一步地，本发明的新颖之处在于通过化学合成制备此类混合物之方法本身，它使得产物的制备具有高重复性和高效性。同样，通过本发明，也阐述了只用一个反应就可一步将苄基保护基团导入核糖单位，增加了关键二糖衍生物制备的效率，其中所述二糖衍生物用于合成此类寡糖。
二糖中间体的合成从制备衍生物5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-D-核糖醇14开始，后者通过9步化学反应制备，其在下列方案中给出。D-核糖蜡按照本领域前述的步骤(Leonart等人，J.Het.Chem.，1966，3，485)转化为异丙叉衍生物6，在第5位上用烯丙基溴在相转化条件下烯丙基化，然后用硫酸于甲醇中水解异丙叉基团，以提供衍生物8，然后用苄基氯和氢化钠在二甲基甲酰胺中进行苄基化。 用乙酸及盐酸的混合物水解甲基，然后用硼氢化钠还原。衍生物5-O-烯丙基-2，3-二-O-苄基-D-核糖醇11吸附于硅胶上，并借助于渗滤法，先用环己烷，然后再用氯仿进行选择性抽提。该步骤可允许大规模纯化，且不用求助于常规的层析法。
进一步地，衍生物11可在吡啶中三苄基化，用苄基氯和氢化钠在二甲基甲酰胺中苄基化，最后用乙酸水解，以给出最终的核糖醇衍生物，后者通过蒸馏法纯化。按下列方案将核糖醇衍生物14用呋喃核糖过乙酸酯15核糖基化。在脱乙酰基作用后，通过应用一种新的吸附和解吸附方法，可大规模得到三醇4，而不用任何常规的层析步骤。 然后，对三醇4进行本发明所发现的二苄基化反应。经该反应可获得衍生物5，其在经柱层析法纯化处理后而获得。中间体5的烯丙基异构为丙烯基，然后在核糖单位的游离位置3导入膦酸酯。去除丙烯基，得到关键的中间体衍生物19。用类似方法，对衍生物17之位置3的羟基进行乙酰化作用，然后水解丙烯基；在位置5导入膦酸酯，并对产物脱乙酰化作用，使得关键的二糖23在位置5上有膦酸酯，在位置3上有游离羟基。 所有形成产物之结构通过核磁共振1H和13C以及H-H和H-X相关实验证实。纯度通过薄层色谱法或HPLC检验。
从衍生物18或22开始，可获得衍生物24和25，后者也用作缩聚反应的接受体，对这一点将进行显示。
在不同的条件下研究了寡聚化反应，反应总是只基于三个成分关键的二糖(19或其类似物23)；反应的助聚剂，其可为新戊酰氯、金刚烷1-碳酰氯或其它具立体位阻的酰基氯；以及第三成分，其可猝灭反应，并同时导入间隔臂。该成分在末端位置含有功能活化基团或其前体，见例如24、25或26。
至于间隔臂，在24、25或26的情况下为5-叠氮-3-氧杂戊醇。间隔臂可使用具有通用公式R1-Y-OH的任一化合物，其中Y是间隔臂链，其可为脂族链。脂族链可包括插入其中的芳香链或在0-5之间摆动的杂原子数。R1为间隔臂末端位置的官能团，其可为NH2、COOR、CHO、SH或任一它们的前体。
已揭示了对一些情形进行缩聚反应的最佳条件，例如在二氯甲烷-吡啶中，二糖19、间隔臂5-叠氮-3-氧杂戊醇26和新戊酰氯反应得出产物。可获得含有寡聚体27的部分，氧化反应后和用甲醇中的LH-20进行LH-20凝胶层析后，基于二糖的产率为70-85％。 寡糖混合物27在披钯木碳存在时，于甲醇-乙酸乙酯-水-乙酸中氢化，得到粗寡糖混合物28。如果间隔臂基团需要活化，该过程在下一步进行较好。例如，在二甲基甲酰胺中，将属于β-马来酰亚胺丙酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯加入寡聚体28。反应结束后，用蒸馏水稀释所得溶液，并在氮压下过1000截止值膜而渗滤。这样获得的产品30为活化的寡糖混合物，可用于偶联处理。 在所有的情况中，形成产物之结构通过核磁共振1H和13C以及H-H和H-X相关实验证实。
用硫代丙酸衍生蛋白质，其通过导入掩蔽为二硫化物的硫醇。对此衍生反应，可用试剂如SPDP或DSP，然后用二硫苏糖醇在氮气环境下反应。对脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)OMP或破伤风类毒素而言，过量试剂用含水乙醇(20-95％)沉淀，然后离心而去除。在下列方案中阐述了对脑膜炎奈瑟菌OMP所进行的处理。 在惰性环境下，将硫醇化蛋白质与活化寡糖混合，后者事先通过0.2微米过滤并冷冻干燥。该反应通过乙醇沉淀猝灭，然后离心或渗滤。
另外，可通过渗滤从偶联物去除过量的活化试剂。两次分离处理去除了几乎所有与蛋白质非偶联的寡糖，使最终产物的质量很稳定。
寡糖30的混合物可与其它载体偶联(例如脂类)偶联。这样，例如在碳化二亚胺存在时，与2，3-二-十八烷基氧基琥珀酰亚胺丁二酸丙酯33反应，可得到结合物34。 可稀释合成的寡糖混合物与蛋白质的偶联物，或在足量的生理缓冲液中进行重建，并且可与添加剂(如佐剂、防腐剂或其它)混合，以获得最终的疫苗制剂。
同样，在制剂处理之前或之间，可将疫苗与其它疫苗混合，其中所述其它疫苗来自目前对一岁以下婴儿之免疫方案中所用类型。例如，与脑膜炎奈瑟菌b型的外膜蛋白(OMP)混合，可形成抗-Hib和抗-脑膜炎b型的联合疫苗。与DTP混合后，可获得抗-Hib和抗白喉、百日咳和破伤风的联合四价疫苗。
用一些动物模型阐述了寡糖30和脑膜炎球菌外膜蛋白之结合疫苗的免疫原性。ELISA法可检测到该疫苗所诱导的抗-Hib荚膜多糖抗体的存在(D.C.Phipps等人，免疫学方法杂志(J.Immunolog.Methods)，1990.135.121-8)。该结果见图2-5。
对兔子而言，使用无氧化铝的疫苗剂型时，第一剂后可诱导较高的反应，但这两种制备物在第二剂后反应相同。这两种情况下均可观察到高的抗体滴度。
在斯普拉格-道利大鼠的实例中，由糖类-蛋白质比例不同的两种偶联物制备的疫苗也显示高的抗-Hib抗体滴度。
对Balb/c小鼠而言，从一种相似的偶联物所获得的疫苗诱导了高的抗-Hib荚膜多糖抗体滴度。
寡糖30的混合物可与基质偶联，例如聚丙烯酰胺。产物可用于检测被免疫的人或实验动物的抗-Hib抗体。混合物也可与乳胶偶联，并用于检测患病或接种过的人的抗体。根据N.Bovin(复合糖杂志，1998，15，431-446)，活化的聚丙烯酰胺可与寡糖30混合物反应。对HbO-HAS和30的聚丙烯酰胺偶联物的能力进行比较，结果如图6所示，其中所述HbO-HAS为用于检测抗-Hib抗体的推荐材料。含有合成寡糖的产物可达到较好的反应-噪声比。
实施例实施例1合成5-O-烯丙基-2，3-二-O-苄基-D-核糖醇11烯丙基化作用-100g的甲基2，3-O-异丙叉-D-呋喃核糖溶解于70mL烯丙基溴，在75mL 50％氢氧化钠含水溶液和2.6g季丁基碘化铵存在下，搅拌12小时。然后停止搅拌，并进行相的分离。用二氯甲烷提取含水相(70mL)，然后干燥并挥发合并的有机相。
水解作用-所得糖浆溶于1.5L甲醇。向该溶液加入3.6mL含水硫酸(0.4N)，并将混合物回流3小时。反应结束后，用碳酸氢钠中和，过滤所得到的盐并蒸发溶液。用乙酸乙酯提取残余物，干燥并蒸发。产物于真空干燥至少2小时。
苄基化作用-所得产物溶于450mL二甲基甲酰胺。将所得溶液冷却至0℃并缓慢加入50g氢化钠。搅拌该混合物30分钟后滴加苄基氯(150mL)。搅拌2小时后，向该反应滴加20mL甲醇。于真空蒸发所得悬浮液，再溶解于二氯甲烷并用水洗涤。用硫酸钠干燥并蒸发有机相。
水解作用-上述反应所得糖浆溶于1.5L二噁烷。加入HCl(2N，1.5L)，并于75-80℃加热该系统。2小时后停止反应，并进行相的分离。用200mL二氯甲烷提取含水相2次，并蒸发合并的有机相。将浓缩产物溶于二氯甲烷(1L)，并依次用水(400mL)、碳酸氢钠饱和溶液(300mL)和水(400mL)洗，最后用硫酸钠干燥并蒸发。
还原反应-所得糖浆溶于乙醇(800mL)，并将系统冷却至20℃。然后加入24g NaBH4。混合物于室温搅拌1.5小时，并于反应结束后，用乙酸在pH破坏过量的氢硼化物直到pH为7-8时。过滤并蒸发该溶液。残余物溶于500mL二氯甲烷，该有机溶液用水洗、硫酸钠干燥，并用于下列实施例。
实施例2纯化5-O-烯丙基-2，3-二-O-苄基-D-核糖醇11向来自上述实施例的粗5-O-烯丙基-2，3-二-O-苄基-D-核糖醇11之二氯甲烷溶液加入300g硅胶，手工搅拌该混合物，直至产物吸附于固相。真空蒸发悬浮液，以除去二氯甲烷。含有产物的硅胶置于渗滤器。用环己烷提取48小时，以去除杂质。将提取溶剂更换为二氯甲烷用于产物提取，得到层析纯的淡黄色糖浆。产率75-95％。NMR13C δ60.7(C-1)，70.2(C-4)，71.0，71.7，72.0，73.6(PhCH2C-5，OCH2CH＝)，79.2，79.3(C-2，3)，117.1(CH2＝)，127.5-128.2(Ph)，134.3(CH＝)，138.0，138.1(Cipso).
实施例3合成5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-D-核糖醇14三苄基化(Trytilation)-来自上述实施例的100g 5-O-烯丙基-2，3-二-O-苄基-D-核糖醇11真空干燥，然后溶于600mL吡啶。向该溶液加入75g氯化三苯甲烷和0.5g二甲基氨基吡啶，并将混合物于50℃搅拌6小时。反应结束后，蒸发溶剂，并将残余物溶于500mL二氯甲烷，该溶液用水(1L)洗、干燥并蒸发。残余物于真空干燥3小时。
苄基化作用-来自上述反应的糖浆溶于300mL二甲基甲酰胺，并将溶液冷却至5℃。缓慢加入氢化钠(25g)，然后继续搅拌30分钟。然后缓慢加入苄基氯(40mL)，并且维持搅拌1小时。反应结束后，再次冷却，并缓慢加入10mL甲醇，以破坏过量的试剂。蒸发溶剂，并将残余物溶于500mL二氯甲烷，用1L水洗。有机相用硫酸钠干燥并蒸发。
水解作用-残余物溶于乙酸(1L)和110mL水，并于80℃搅拌1.5小时反应。通过蒸发去除溶剂，并将残余物溶于500mL环已烷。有机相冷却至0-5℃，4小时；然后过滤，用水洗、硫酸钠干燥并蒸发。通过于200-220℃和0.1mm蒸馏，获得纯的产物。基于100g核糖，产量为80-90g。NMR13C δ61.2(C-1)，69.6，71.8，72.1，72.3.73.9(PhCH2C-5，OCH2CH＝)，78.0，78.8，78.9(C-2，3，4)，116.8(CH2＝)，127.5-128.2(Ph)，134.7(CH＝)，138.0，138.1，138.2(Cipso).
实施例4合成5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-1-O-(β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇4糖基化作用-上述实施例的产物(370g)溶于2.7L无水二氯乙烷，并转移至反应器。将溶液冷却至0-25℃，加入粉质分子筛4(207g)，15分钟后，以15mL/min缓慢加入三氟化硼醚合物(407mL)。最后，在20分钟内缓慢加入溶于无水二氯乙烷(1L)的D-呋喃核糖过乙酸酯15(370g)。搅拌3小时反应，并通过己烷/乙酸乙酯(2/1)的TLC(薄层层析)观察。平板通过用5％H2SO4(c)于乙醇中碳化。反应结束后，用三乙胺(222mL)中和直至pH为7，然后加入碳酸氢钠饱和溶液(800mL)，并继续搅拌30分钟。反应的pH必须保持在中性。真空过滤反应器内容物。固体用二氯乙烷(200mL)洗2次，以提取固体中的任何残余产物。弃去固相，并用600mL水提取有机相2次，用硫酸钠干燥并真空蒸发。
脱乙酰基作用-上述反应所得的糖浆溶于甲醇(2L)，加入用甲醇钠的甲醇溶液(1％)，直至pH达到9。继续反应近2小时。反应结束后，用酸性树脂中和，直至pH达到6-7。真空过滤去除树脂。糖浆(427g)含有目标产物及5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-D-核糖醇4、D-核糖及其它未确定的杂质。
实施例5纯化5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-1-O-(β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇4
上述实施例的糖浆溶于二氯甲烷(1L)。向溶液中加入硅胶(1kg)并手工搅拌该混合物，直至产物吸附于固相。真空蒸发悬浮液，以除去二氯甲烷。所得固体真空干燥2小时，以去除任何痕量的二氯甲烷。
含有产物的硅胶置于渗滤器。用环己烷提取48小时除去杂质。将提取溶剂更换为氯仿，提取产物，得到淡黄色糖浆。产量238g。NMR1H δ5.85(m，1H，CH＝)，5.20(m，2H，CH2＝)，4.85(s，1H，H-1′)，13C δ62.8(C-5’)，77.7，77.9，78.2(C-2，3，4)，84.0(C-4’)，107.2(C-1’)。
实施例6合成5-O-烯丙基-2，3，4-三-O-苄基-1-O-(β-D-2′，5′-二-O-苄基-呋喃核糖)-D-核糖醇5苄基化-上述实施例所得的化合物(200g)溶于甲苯(2L)。向该溶液加入Bu2SnO(80g)，并将混合物回流4小时。室温以小部分加入NaH 50％(56g)，并于80℃搅拌混合物30分钟。加入季丁基碘化铵(62g)，再搅拌混合物1小时。然后加入苄基氯(148mL)，并于80℃继续搅拌反应数小时。每隔30分钟重复类似的加入苄基氯，直至TLC(己烷/乙酸乙酯-2/1)显示主要产物以二苄基化的二糖存在。冷却反应并用1％HCl的甲醇溶液中和。然后反应经硅藻土过滤，减压蒸发。将所得的含有一些盐的产物溶于乙酸乙酯，减压过滤并浓缩。粗糖浆用甲苯-丙酮60/1溶剂系统柱层析纯化。纯化物5以糖浆(100g)形式获得。NMR-1H δ5.96(m，1H，-CH＝)，5.18(m，2H，CH2＝)，5.02(s，1H，H-1)实施例7合成2，3，4-三-O-苄基-1-O-(β-D-2′，5′-二-O-苄基-3′-O-三乙胺膦酸酯-呋喃核糖)-D-核糖醇(19)烯丙基的异构化作用-于高真空将上述实施例所得糖浆20g干燥2小时。糖浆溶于无水二甲亚砜(100mL)，并加入叔丁醇钾(6.4g)。于100℃搅拌1小时反应，然后加入250mL冰水。逐滴滴加入浓盐酸使pH达到7。用二乙醚80mL提取混合物3次。合并有机相，用硫酸钠干燥并蒸发。
膦酸化作用-将咪唑(1.5g)的无水乙腈(34mL)溶液冷却至0℃。加入三氯化磷(0.56mL)和三乙胺(3.1mL)。所得溶液搅拌15分钟。来自上述反应的二糖加至溶于无水乙腈(3mL)的该混合物。所得混合物于室温搅拌15分钟，并通过加入1M的三乙溴化胺终止反应。继续搅拌10分钟，加入二氯甲烷，并进行相的分离。有机相用冷的三乙碳酸氢胺溶液洗、干燥和蒸发。
丙烯基的水解作用-产物溶于60％乙酸，并于70℃搅拌30分钟。蒸发去除溶剂，并将产物溶于二氯甲烷，用三乙碳酸氢胺洗、干燥和蒸发。对所得产物进行柱层析，得到了纯化合物，产率在70-85％之间。NMR1H δ6.85(d，H-P)，4.95(s，H-1)，4.60(m，H-3)，2.93(q，NCH2CH3)1.20(t，NCH2CH3).13C δ105.9(C-1).
实施例819和26(比率10-1)间的缩聚反应向溶于吡啶-三乙胺(10-1，1mL)的化合物19(1g)之溶液加入三甲基乙酰氯(0.14mL)，搅拌反应20分钟。加入间隔臂26(29.2mg)和新的三甲基乙酰氯(0.9mL)，并搅拌反应1小时。加入溶于吡啶-水(7.3mL；20-1)的I2(1.1g)溶液，搅拌反应30分钟。混合物用二氯甲烷稀释，用硫代硫酸钠溶液(1M)和冷三乙溴化胺(0.5M)溶液洗，然后用硫酸钠干燥并蒸发。所得产物溶于甲醇，并用同一溶剂于葡聚糖LH-20柱进行层析。合并含有寡聚体的级分并蒸发。产率80％。
实施例919和26(比率10-1)间的缩聚反应向溶于吡啶-三乙胺(10-1，1mL)的化合物19(1g)和间隔臂24(14.6mg)之溶液加入三甲基乙酰氯(0.23mL)，并搅拌反应2小时。加入溶于吡啶-水(7.3mL；20-1)的I2(1.1g)溶液，产物用与实施例8类似的方式处理。
实施例1019和26(比率5-1)间的缩聚反应向溶于吡啶-三乙胺(10-1，1mL)的化合物19(1g)和间隔臂24(29.2mg)之溶液加入三甲基乙酰氯(0.23mL)，并搅拌反应2小时。加入溶于吡啶-水(7.3mL；20-1)的I2(1.1g)溶液，产物用与实施例8类似的方式处理。
实施例1123和26(比率5-1，溶剂吡啶)间的缩聚反应向溶于吡啶(1mL)的化合物23(1g)和间隔臂26(29.2mg)之溶液加入三甲基乙酰氯(0.23mL)，并搅拌反应2小时。加入溶于吡啶-水(7.3mL；20-1)的I2(1.1g)溶液，产物用与实施例8类似的方式处理。
实施例1219和24(比率5-1，溶剂吡啶)间的缩聚反应向溶于吡啶(1mL)的化合物19(1g)和间隔臂24(29.2mg)之溶液加入三甲基乙酰氯(0.23mL)，并搅拌2小时反应。加入溶于吡啶-水(7.3mL；20-1)的I2(1.1g)溶液，产物用与实施例8类似的方式处理。
实施例13来自实施例8-12之产物的氢化反应对上述实施例8-12的粗产物进行氢化作用，在10％的披钯木碳上于乙酸乙酯-乙醇-水-乙酸(1-2-2-0.1)的混合液中反应。最后，产物于葡聚糖C-25Na进行离子交换柱层析纯化。通过NMR表征冷冻干燥的产物，并显示了基本重复单位Rib-Rib-磷酸和间隔臂。渗滤法和超滤法处理后，得到了活化级分，首先通过1000截止值的膜，再通过10000截止值的膜。合并通过10000膜的溶液并冷冻干燥，得到最终的28，依据反应条件的不同，总产率在基于初始二糖的20-80％之间。NMR1H δ5.12(H-1)，4.60(H-3)，3.29(CH2NH2).31Pδ2.14(spac-P-Rib)0.74(核糖醇-P-Rib)。
实施例14.合成衍生物5-(3-马来酰亚胺丙酰胺)-3-氧杂戊烷基寡聚核糖基(ribosil)核糖醇磷酸酯30向上述实施例(3.34mg，1.73μmol)的双蒸水(0.1mL)溶液加入0.7mg(2.62μmol)N-羟基琥珀酰亚胺基β-马来酰亚胺丙酸酯27，后者溶于N，N-二甲基甲酰胺(0.4mL)。反应4小时后，溶液于真空蒸发，重悬于蒸馏水(0.5mL)并离心(10分钟，3500转/分)。用水稀释上清，并用具1000截止值的膜的Amicon设备超滤。冷冻干燥存留物。产率在85至95％之间。NMR1H，δ6.95(s，2H，CH＝CH)，5.01(s，H-1)3.41(t，2H，CH2NH)，2.56(t，2H，CH2a).
实施例15获自实施例13的产物通过离子交换层析分析实施例8-12之已氢化的并作为钠盐的产物通过HR5/5mono Q柱，用氯化钠线性梯度进行离子交换层析来分析(P.Constantino，ycol.，疫苗1999，17，1251-1263)。实施例8的洗脱层析曲线见

图1B，并显示了不同大小的片段。如将它们与文献报道的结果和图1A比较，前者代表有五聚物的层析谱，由此可得出结论混合物中呈现的片段从4-5个重复单位至超过20个重复单位。
实施例16与脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白的偶联400mg脑膜炎奈瑟菌外膜蛋白复合物(OMPC)溶于80mL pH8的PBS缓冲液，后者事先用N2(g)灌洗。溶液用N2(g)灌洗5分钟，同时在冰水浴中搅拌。加入溶于二甲基甲酰胺中的1.6mL DSP溶液，并将混合物于4℃轻轻搅拌2小时。加入溶于PBS的1.6mL DTT溶液，并继续于4℃搅拌1小时。所得的悬浮液转移至含有20-400mL冷乙醇的离心烧瓶。于1800转/分4℃离心烧瓶30分钟，弃去上清。向固体加入新的乙醇，在加入200-400mL乙醇后，再次重复离心步骤。用80mL pH7-9的PBS缓冲液重悬沉淀。向所得溶液中加入合成的寡糖30，并继续搅拌1-48小时。一旦处理结束，用30000截止值膜渗滤后，重复乙醇沉淀-离心操作。用PBS缓冲液重建存留物，使浓度为Hib 40-80μg/mL。
实施例17与破伤风类毒素的结合pH8 PBS配制的浓度为5mg/mL的破伤风类毒素溶液用N2(g)鼓气5分钟。维持在冰水浴中搅拌的同时，加入溶于二甲基甲酰胺中的1.6mL DSP溶液，并将混合物于4℃轻轻搅拌2小时。加入溶于PBS的1.6mL DTT溶液，并继续于4℃搅拌1小时。所得溶液转移至具10000截止值膜的超滤设备。加入事先用N2(g)鼓气新鲜缓冲液，对溶液渗滤几次，直至通过膜的溶液Elman试验阴性。向所得溶液中加入合成的寡糖30，并继续搅拌1-48小时。处理结束后，再次对溶液渗滤，直至通过膜的溶液对糖的酚-磺试验阴性。最后用PBS缓冲液重建溶液，使浓度为Hib 40-80μg/mL。
实施例18与双十八烷基甘油基半琥珀酸酯的偶联。
实施例8的产物(10mg)溶于1mL二甲基甲酰胺，并加至双十八烷基甘油半琥珀酸酯溶液，后者为N-羟基琥珀酰亚胺酯31。向该溶液加入乙基二胺丙基碳二亚胺(5mg)，搅拌6小时反应。加入新的碳二亚胺，继续搅拌6小时。蒸发溶剂并将混合物加至C18-硅胶柱(1g)。用水洗脱去除寡糖。用梯度浓度的甲醇-水洗脱产物。产率为85％。NMR1H δ5.12(H-1)，4.60(H-3)，3.40(CH2NH)，1.30(CH2)，0.90(CH3)。
实施例19制备无佐剂的疫苗溶于磷酸缓冲液、浓度为40μg/mL的实施例16之免疫原，在无菌条件下于4-8℃用双蒸水稀释。搅拌悬浮液10分钟。Hib抗原之终浓度通过对核糖和总蛋白质的估算而确定，并且可通过加入更多的缓冲液来重调，直至Hib抗原的终浓度为20mg/mL。加入Tiomersal至终浓度为0.1-0.001％。所得悬浮液为无佐剂抗Hib结合疫苗的终体积。
实施例20制备以氧化铝作为佐剂的抗Hib疫苗溶于磷酸缓冲液、浓度为40μg/mL的实施例16之免疫原，在无菌条件下于4-6℃与等体积的、溶于蒸馏水的1-0.01mg/mL氧化铝混合。于4-8℃维持搅拌20分钟。Hib的终浓度通过对核糖和总蛋白质的估算而确定，并且可通过加入更多的缓冲液来重调，直至Hib抗原的终浓度为20mg/mL。加入Tiomersal至终浓度为0.1-0.001％。所得悬浮液为氧化铝的抗Hib结合疫苗之终体积。
实施例21制备抗-Hib和抗脑膜炎球菌B的联合疫苗溶于磷酸缓冲液、浓度为80μg/mL的实施例16之免疫原，在无菌条件下于4-6℃与一定体积的脑膜炎奈瑟菌B型外膜蛋白复合体(OMPC)混合，后者目前用于VAMEMGOC BC的浓度为100-200mg/mL PBS。软磁力搅拌20分钟匀浆化后，反应物与等体积的、溶于蒸馏水的1-0.01mg/mL氧化铝混合。于4-6℃维持搅拌20分钟。Hib抗原的终浓度通过Lowry法对核糖和总蛋白质的估算而确定，并且可通过加入更多的缓冲液来重调，直至Hib抗原的终浓度为20mg/mL。加入Tiomersal至终浓度为0.1-0.001％。所得悬浮液为氧化铝中的联合抗Hib和抗脑膜炎球菌B之终体积。
实施例22制备抗Hib和抗-DTP的联合疫苗溶于磷酸缓冲液、浓度为80μg/mL的实施例16之免疫原，在无菌条件下于4-6℃与一定体积的4x浓度之DTP混合。软磁力搅拌20分钟匀浆化后，反应物与等体积的、溶于双蒸水的1-0.01mg/mL氧化铝混合。于4-6℃维持搅拌20分钟。Hib抗原的终浓度通过Lowry法对核糖和总蛋白质的估算而确定，并且可通过加入更多的缓冲液来重调，直至Hib抗原的终浓度为20mg/mL。加入Tiomersal至终浓度为0.1-0.001％。所得悬浮液为氧化铝的联合抗Hib和抗-DTP之终体积。
实施例23由合成的寡糖混合物和OMP制备的疫苗之免疫分析实施例19和20的疫苗以1μg至2μg抗原的剂量免疫。用于这些实验的动物为兔、大鼠和小鼠。免疫两次，其间隔为4周，于第0、28和42天取血。收集血液并于3500转/分离心20分钟。10倍稀释血清并贮存于-40℃。
用间接ELISA法，以Hib-HAS作为包被抗原测定抗体反应。结果如图2-5所示。
实施例24合成的寡糖混合物和对硝基苯基丙烯酸酯的偶联来自实施例13的寡糖混合物(10mg)溶于二甲基甲酰胺，并加至溶于二甲基甲酰胺的硝基苯基丙烯酸酯(10-30mg)溶液(1mL)。加入0.1-0.5mL三乙胺，维持搅拌反应16小时。加入0.1-0.5mL氨水，继续搅拌24小时。溶液上乙腈的交联葡聚糖LH-20柱。用乙腈-水进行洗脱。5-甲基间苯二酚分析核糖，合并阳性级分并冷冻干燥。产率通常高于80％。
实施例25合成寡糖偶联物检测抗-Hib抗体的能力溶于碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液的、来自上述实施例的产物溶液以1-100μg/mL浓度加入一半的96孔板。板的另一半加入推荐浓度的抗原HbO-HAS。用疫苗免疫过的小鼠血清进行ELISA测定，其中所述疫苗含有与破伤风类毒素偶联的天然荚膜多糖。获得的结果如图6所示。
附图简述图1.由实施例15得到的寡聚体级分之典型层析谱，其为通过Mono Q HR 5/5，用NaCl 0-500mM线性梯度进行的离子交换层析，其中A-五聚体；B-来自实施例10的寡聚体。
图2.用实施例16之疫苗免疫的兔中的抗体反应。
图3.用实施例15之疫苗免疫的兔中的抗体反应。
图4.用实施例15之疫苗免疫的大鼠中的抗体反应。
图5.用实施例15之疫苗免疫的Balb C小鼠中的抗体反应。
图6. 26-PAA偶联物检测抗-Hib抗体的能力。
权利要求
1.寡糖混合物，其包含公式为(磷酸-核糖-核糖醇)n或(核糖-核糖醇-磷酸)n的重复单位，其中该寡糖混合物是通过合成获得的，包含至少5个具有结构A或B的化合物，n为在4和25之间的一个值，且其中R1或R2是用来与载体结合的间隔臂，其条件为如果R2＝H，则R1＝间隔臂，或如果R1＝H，则R2＝间隔臂。
2.根据权利要求1的寡糖混合物，其中具有公式为(磷酸-核糖-核糖醇)n或(核糖-核糖醇-磷酸)n、结构为A或B的该化合物彼此间只有n不同，其中n为在4和25之间的一个值。
3.根据权利要求3的寡糖混合物，其中间隔臂指任一脂族烃链，其含有0-5个杂原子和/或芳香族链；在间隔臂的另一端总存在官能团NH2、COOR、CHO、SH或它们的前体，其可与作为载体的分子形成化学键。
4.合成寡糖混合物的方法，其中所述寡糖混合物包含公式为(磷酸-核糖-核糖醇)n或(核糖-核糖醇-磷酸)n的重复单位，其中在碱性溶剂中且间隔臂参与反应时，对二糖衍生物19或23在助聚剂存在下进行一步缩聚反应，其中助聚剂可以为并活化具立体位阻的酸性衍生物，间隔臂作为受体可猝灭寡聚体链的生长。
5.根据权利要求4的方法，其中二糖中间体19或23与助聚剂的摩尔比为1/1-3。
6.根据权利要求4和5的步骤，其中助聚剂为酯位阻的酸之活化衍生物。
7.根据权利要求4和6的方法，其中助聚剂优选新戊酰氯、金刚烷碳酰氯或磷酸的活化衍生物。
8.根据权利要求4的方法，其中二糖中间体19或23与间隔臂的摩尔比为5-10/1。
9.根据权利要求4-8的方法，其中二糖为19，且间隔臂为24，助聚剂为新戊酰氯，且溶剂为吡啶。
10.合成权利要求1-3之寡糖混合物的方法，其中对根据权利要求4-9的方法获得的化合物进行进一步膦酸到磷酸的氧化，然后通过氢化作用去除苄基保护基团，去保护或活化间隔臂，并通过一步或几步分子筛处理去除小于4或大于25个重复单位的级分。
11.包含权利要求1-3之寡糖混合物的免疫原，其中该寡糖混合物与选自蛋白质、肽或脂类的载体分子相结合。
12.用于防止由流感嗜血菌b型引起的感染性疾病的疫苗，其包含与或不与佐剂或其它添加物配制的权利要求11之免疫原。
13.根据权利要求12的疫苗，其与其它疫苗如抗乙型肝炎，抗-脑膜炎球菌A、B和/或C，DPT，抗脊髓灰质炎、抗肺炎球菌1、5、6B、6A、14、19F、19a和/或23F，联合使用，或与它们各自的免疫原联合使用。
14.合成纯的二糖中间体2，3，4-三-O-苄基-5-O-烯丙基-(β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇4的方法，其通过2，3，4-三-O-苄基-5-O-烯丙基-D-核糖醇14与呋喃核糖过乙酸酯的核糖基化作用，然后脱乙酰作用，得化合物4，对其用硅胶吸附-解吸附纯化。
15.合成二糖中间体17的方法，其包括将二糖4与二丁基氧化锡、季丁基碘化铵、氢化钠和苄基氯以1∶0.5-2∶0.001-1，0.5-10∶1-5的比例在如甲苯、苯、四氢呋喃或二甲苯的溶剂中的二苄基化处理，得到具有式5的化合物，然后烯丙基异构化成为丙烯基。
16.二糖5-O-丙烯基-2，3，4-三-O-苄基-1-O-(2′，5′-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇17作为中间体，用于衍生物19和23的合成。
17.二糖衍生物2，3，4-三-O-苄基-1-O-(2′，5′-二-O-苄基β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇-5-O-三乙胺膦酸23和2，3，4-三-O-苄基-1-O-(2′，5′-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖)-D-核糖醇-3′-O-三乙胺膦酸19作为关键的中间体，用于权利要求5-7的寡聚化过程。
18.由二糖17而制备二糖19或23的方法，其包括用三氯化磷-咪唑进行膦酸化，然后水解丙烯基或者乙酰化作用后，水解丙烯基，并用三氯化磷咪唑进行膦酸化作用，然后脱乙酰化。
19.二糖19或23的用途，其用于权利要求1-3之寡糖混合物的合成。
20.包含权利要求1-3之寡糖混合物的大分子，其中寡糖混合物与免疫惰性聚合物材料相结合。
21.权利要求20之大分子的用途，其用于检测和定量针对流感嗜血菌b型之荚膜多糖的抗体。
全文摘要
本发明特别涉及衍生于核糖－核糖醇磷酸之寡糖混合物的化学合成,以及含有该寡糖混合物的疫苗,其中所述寡糖混合物被用作疫苗中的活性成分,用于防止由流感嗜血菌b型(Hib)引起的感染。本发明之通过化学合成获得的寡糖混合物包含至少5个具有结构A或B的化合物,其重复单位的公式为(磷酸－核糖－核糖醇)n或(核糖－核糖醇－磷酸)n,其代表流感嗜血菌b型之荚膜多糖的重复单位,且只有n是不同的,其中n是在4和25之间的一个值(n 4且25),R
文档编号C07H15/08GK1376158SQ00813473
公开日2002年10月23日 申请日期2000年8月15日 优先权日1999年8月30日
发明者V·G·韦兹本科莫, R·罗伊 申请人:哈瓦那大学, 渥太华大学