GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCGACGACTTCCTATCTATG GC-3，
[0039]SEQIDNo. 11:5' -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCCAAAACAATCCTTTCCAGT-3'
[0040] (5)attB-PCR产物的合成及纯化回收
[0041]PCR离心管中加入以下反应体系
[0042]
[0043]PCR反应条件为：95°C，5min;95°C，30s
;58°C，30s;72°C，90s;72°C，10min;4°C， 00 O
[0044] PCR反应结束后，取1 y L PCR产物进行1. 0 %琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物的质 量，其余用作产物的纯化回收。
[0045] 实施例2
[0046] 一种含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体（pK2GW7I_S.saPHT)及宿主细胞的构建
[0047] 构建含有本发明的盐地碱蓬耐低磷基因的中间载体pJETl. 2_S. saPHT、pD0NR201_ S. saPHT和植物表达载体pK2GW7I_S. saPHT，见图2。
[0048] 将胶回收纯化后的目的片段（纯化后的盐地碱蓬耐低磷基因（S.saPHT基因）） 利用CloneJETPCRCloningKit(CloneJETPCRCloningKit#K1231 20rxns)连接到 pJETl. 2上，（质粒pJETl. 2 :Thermo)分别利用载体和目的片段的上下游引物PHT-F(SEQID NO. 4)和PHT-R(SEQIDNO. 5)对同一个大肠杆菌DH5a感受态细胞菌落进行菌落PCR双重 验证，筛选pJETl. 2_S.saPHT阳性菌落测序。提取测序正确菌液的质粒进行BP反应，筛选 出阳性克隆进行测序。同样，提取测序正确的BP菌质粒进行LR反应，筛选出阳性克隆。
[0049] 采用如上述相同的方法构建中间载体表达载体pD0NR201_S.saPHT，pD0NR201购 自invitrogen公司。对中间载体进行阳性克隆筛选，如附图3所示，用1%的胶电泳，点样 为 5yL2Xl〇adingbuffer+5yLPCR产物。右侧 7 个条带为：将pD0NR201_S.saPHT转化 大肠杆菌DH5a后，挑选单菌落，用克隆引物进行菌落PCR，然后进行琼脂糖凝胶电泳得到 的条带。条带大小为1679bp。最左侧条带为MarkerDL2000。
[0050] 构建含盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体（pK2GW7I_S.saPHT)，pK2GW7 (I)载体购 自invitrogen公司，大肠杆菌为DH5a感受态细胞，Tiangen，CB101-2,使用提纯的目的基 因进行转染，并进行PCR验证，筛选阳性菌落，得到得到一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载 体以及含有上述重组载体的宿主细胞。
[0051] 实施例3
[0052] -种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用
[0053] 利用实施例2筛选的pK2GW7I_S.saPHT阳性表达载体（盐地碱蓬耐低磷基因的重 组载体）转化农杆菌，实验所用的农杆菌菌株为C58 (购于中国质粒载体菌株细胞株基因保 藏中心，http://biovector.blog. 163.com/)，C58染色体具有利福平抗性（Rif)，辅助质粒 具有庆大霉素抗性（Gen)。菌落PCR挑选阳性克隆侵染拟南芥。
[0054] 农杆菌的活化与扩大培养：挑保存的阳性农杆菌的单菌落置于3mLYEB液体培养 基中（含相应Gen抗生素，浓度为25μg/ml;Rif抗生素，浓度为lOμg/ml;Km抗生素，浓度 为50yg/ml)过夜培养15小时左右（至0D6QQ= 0? 8左右），170rpm，28°C。农杆菌的扩大 培养：新鲜的l〇ml的YEB液体培养基中加入适量的抗生素（Gen抗生素，浓度为25yg/ml; Rif抗生素，浓度为10yg/ml;Km抗生素，浓度为50yg/ml)，然后接种接适量农杆菌菌液到 YEB液体培养基中进行培养，170rpm，在28°C培养至0D6QQ= 0. 6。得到含有重组载体的宿主 细胞。
[0055] 经过上述步骤筛选的阳性农杆菌（含有重组载体的宿主细胞）进行保存，挑保存 的阳性农杆菌的单菌落过夜培养（至〇D_= 0. 8左右），菌液离心后弃上清，用5%的蔗糖 液体重悬菌体后浸泡待转化的拟南芥的整个花序约30-45秒，取出拟南芥横躺在托盘中， 用塑料薄膜罩住保湿，并暗处理12h，然后在温度25°C，光周期16h光照/8h黑暗，相对湿 度：70%的培养条件下下使其正常生长，直到种子成熟。种子采集后放到37°C烘箱烘干两 周，已备后续试验使用。
[0056] 将收取的T1代种子经过消毒以后，放置在冰箱4°C春化三天，然后在超净台上将 已经春化好的拟南芥种子均勾播种在含有50yg/ml卡那霉素的1/2MS固体筛选培养基上， 在22-25°(：，140^111〇1八1112*8)(下生长8-10天，叶子为深绿色即为转基因拟南芥的1'1代 阳性转化子（由于农杆菌中含有卡那霉素的抗体，故成功转染的拟南芥中表现出卡那霉素 的抗性）。当转化植株长到3-4片真叶时，将其移植到土壤中，约一个半月后收集种子即为 T2代转化种子。采用相同方法进行筛选，继续生长一代后得到T3代种子，通过在含kan抗 生素的1/2MS培养基上筛选，100%成活率的从种子即为T3代纯合体种子。
[0057] 盐地碱蓬耐低磷基因转化拟南芥后，T3纯合体PCR测定表达水平结果，用克隆引 物做半定量，检测基因的表达情况，部分结果如附图4所示。选取表达水平高的2个独立转 化株系和野生型拟南芥（WT)的种子同时无菌处理，平铺到MS固体平板上，4°C春化两天， 22°C光照培养箱萌发5天，然后分别移到MS正常磷（lmMPi)及低磷（50yMPi)培养基上 垂直培养5天，观察其表型差异。如图5和图6所示在正常磷处理条件下，转盐地碱蓬耐低 磷基因拟南芥（〇ES.saPHT)和野生型对照基本一致；而在低磷处理条件下，野生型和转盐 地碱蓬耐低磷基因拟南芥在植株鲜重、根长和根密度上有显著差异。
[0058] 上述实验验证本发明的盐地碱蓬耐低磷基因具有耐低磷性能。
[0059] 以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况 下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均 落入本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种盐地碱蓬耐低磷基因，其特征是序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。2. 含权利要求1 一种盐地碱蓬耐低磷基因的重组载体。3. 含有权利要求2所述重组载体的宿主细胞。4. 权利要求1的一种盐地碱蓬耐低磷基因在改良植物耐低磷的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种盐地碱蓬耐低磷基因及应用，盐地碱蓬耐低磷基因，是序列表中SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列。本发明的盐地碱蓬耐低磷基因，从盐地碱蓬中获取并具有序列表中SEQ？ID？NO.1所示的核苷酸序列，并能够获得含有该基因的重组载体和宿主细胞，采用该基因转染的拟南芥表现出对低磷胁迫的耐受力，说明本发明提供的耐低磷基因能在改良作物耐低磷能力中应用。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/11, A01H5/00
【公开号】CN105063022
【申请号】CN201510422987
【发明人】杨少辉, 王洁华, 罗翠, 宋英今
【申请人】天津大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月17日