一种从黄酒麦曲中提取微生物总dna的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法，属于分子生物学技术领 域。
【背景技术】
[0002] 黄酒麦曲是以乳碎的小麦为原料，经过加水拌曲、压块成型并堆放在一定的温度 和湿度条件下，富集培养酿酒有益微生物制得的糖化发酵剂。麦曲中微生物群系复杂，是黄 酒酿制的主要微生物来源，这些微生物在黄酒制作过程中共同作用，最终形成了黄酒独特 的风格，因此黄酒麦曲有着"酒之骨"的美誉。
[0003] 黄酒麦曲中微生物的研究一直是麦曲的研究重点，传统的分离培养不仅工作量 大，耗时耗力，而且无法全面的了解微生物的组成，利用分子手段研究麦曲则能够避免传统 方法的不便。利用分子手段分析一定环境下微生物群落结构时，基因组提取的质量对后续 的分析有着很大的影响，高质量的提取麦曲中的宏基因组对全面的剖析麦曲微生物群落结 构有着重要作用。
[0004] 麦曲的制作在自然开放的环境中完成，且制曲时间较长（3个月左右），微生物来 源广泛（制曲用水、小麦、空气微生物等），造就了麦曲复杂的微生物体系。相关研究中将麦 曲制作过程中微生物的生长变化分为孢子发芽期、生长繁殖期和产酶成熟期3个阶段，之 后麦曲还要经过长时间的放置过程，随着水分含量的降低，麦曲中的大量霉菌、细菌产生成 孢子、芽孢，所以麦曲是一种含有真菌、细菌的营养体、孢子和芽孢的复杂体系，在进行群落 结构解析时需要同时获得他们的基因组。麦曲在制作过程中经过了小麦乳碎的操作，小麦 中含有丰富的淀粉、蛋白等营养物质，直接进入了麦曲体系，长时间的麦曲制作过程使其中 的微生物能够充分的利用麦曲中各种营养物质，同时也产生了各种代谢产物，这都影响了 麦曲中DNA的提取。麦曲中起重要作用的霉菌，如米曲霉、米根霉等在制曲完成后大多以孢 子形式存在，孢子易于悬浮不易进入提取液，同时孢子不容易破坏孢子壁，这也将会阻碍提 取过程。
[0005] 麦曲总DNA的提取有着重重阻碍，而麦曲总DNA的提取是以分子手段研究麦曲的 基础，因此亟需一种高质量提取麦曲总DNA的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题是，针对麦曲这种含有真菌、细菌营养体、孢子和芽孢的 复杂微生物体系，提供了一种高质量从黄酒麦曲中提取微生物总DNA的方法。
[0007] 所述方法，包括：
[0008] (1)在麦曲中加入ddH20和吐温80,并加入玻璃珠，振荡摇勾，然后在超声波清洗 器中振荡5~lOmin，使麦曲中的菌体尽量进入悬液中，低速离心后取上清；
[0009] (2)将步骤⑴得到的悬液高速离心的菌体沉淀；
[0010] (3)向步骤（2)得到的菌体中加入DNA抽提液，混悬后液氮条件下充分研磨；
[0011] ⑷向步骤⑶得到的溶液中加入溶菌酶，于37°c条件下放置30~40min;
[0012] (5)向步骤（4)得到的溶液中加入加入SDS溶液并立即蛋白酶K，65°C水浴45~ 65min；
[0013] (6)向步骤（5)得到的溶液中加入CTAB抽提液，65°C水浴45~65min;
[0014] (7)将步骤（6)得到DNA粗提液进行纯化得到麦曲总DNA。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述用于提取的麦曲的质量为4~6g;ddH20的加量 为12~18mL，吐温80的终质量浓度为0. 04~0. 06% ;
[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述低速离心是指离心力为200~500g，高速离心 是指离心力为10000~12000g。
[0017] 在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液配方为100mmol/LTris-HCl，pH 8.0,100mmol/LEDTA,pH8.0,100mmol/LNa3P04,1. 5mol/LNaCl；
[0018] 在本发明的一种实施方式中，所述DNA抽提液添加量为500~600yL。
[0019] 在本发明的一种实施方式中，所述溶菌酶的质量浓度为50mg/mL，加入量为8~ 12yL;
[0020] 在本发明的一种实施方式中，所述SDS的终质量浓度为1. 8~2. 2% ;蛋白酶K的 质量浓度为20mg/mL，加入量为4~6yL。
[0021] 在本发明的一种实施方式中，所述0^抽提液的配方为2%0^，1.4111〇1/1^(：1， lmol/LTris-HCL，0? 5mol/LEDTA;CTAB抽提液的加量为 700 ~1200yL。
[0022] 在本发明的一种实施方式中，所述DNA粗提液的纯化，是将样品用等体积的氯仿 与异戊醇体积比为24:1的氯仿-异戊醇抽提2~3次，然后用0. 6~0. 7倍体积的异丙醇 沉淀，离心取沉淀，用lml70 %的乙醇洗涤沉淀2~3次，去除水分，干燥得DNA，然后加入 ddH20溶解DNA，并加入10~20yL/mL的RNA酶处理，以去除DNA。
[0023] 在本发明的一种实施方式中，所述DNA粗提液的纯化，具体是将所得样品用等体 积的氯仿-异戊醇（体积比24:1)混均后于4°C条件下，12000g，离心10~15min，抽提2~ 3次；加入0. 6~0. 7倍体积的异丙醇于-20°C沉淀lh;4°C，12000g离心10min，收集核酸沉 淀；加入lml70%的乙醇于4°C条件下，12000g，离心10min，洗涤沉淀2~3次，倒扣去除过 量水分，于37°C干燥DNA;加100yLddH20溶解沉淀，加入终浓度为10~20yL/mL的RNA 酶，并在37°C下消化30~45min，以去除RNA。
[0024] 所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：
[0025] (1)取5g麦曲样品加15mlddH20置于50ml离心管中并添加终质量浓度为0.04% 的吐温80,加入适量玻璃珠，充分振荡5min;4°C条件于KQ700E超声波清洗器中超声振荡 5min;200g离心力离心5min，取上清，10000g离心10min;收集沉淀，加2mlddH20混悬均勾 转移至2mlEP管；10000g离心10min，得菌沉淀；
[0026] (2)菌沉淀加入 0? 5mLDNA抽提液（100mmol/LTris-HCLpH8. 0,100mmol/L EDTA，pH8. 0,100mmol/LNa3P04,1. 5mol/LNaCl)混悬，液氮条件下充分研磨菌体；
[0027](3)向⑵得到的溶液中加入10yL溶菌酶（50mg/mL)，37°C条件下放置30min;;
[0028] (4)向（3)得到的溶液中加入125yL10%SDS，立即加入5yL蛋白酶K(20mg/ mL)，混均后65°C水浴lh;
[0029] (5)向⑷得到的溶液中加入700yLCTAB缓冲液，混均后65°C水浴lh;
[0030] (6)步骤（5)所得样品用等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1)混均后于4°C条 件下，12000g，离心lOmin，；
[0031] (7)重复步骤（6)2次；
[0032] (8)向步骤（7)得到的溶液中加入0? 6倍体积的异丙醇于-20°C沉淀lh;
[0033] (9)将步骤⑶得到溶液于4°C，12000g条件下离心lOmin，收集核酸沉淀；
[0034] (10)向步骤（9)得到的沉淀中加入lml70%的乙醇于4°C条件下，12000g，离心 lOmin；
[0035] (11)重复步骤（10)2 次；
[0036] (12)吸去步骤（11)得到样品的清液，收集沉淀，倒扣去除过量液体，于37°C干燥 DNA；
[0037] (13)向步骤（12)得到的样品中加入lOOyLddH20溶解沉淀，加入终浓度为 10yL/mL的RNA酶，并在37°C下水浴消化45min，以去除RNA。
[0038] 本发明的有益效果：
[0039] (1)本发明方法提取得到的麦曲总DNA样品中，DNA质量浓度达到149. 6ng/yL，对 其中的真菌及细菌PCR扩增后进行电泳得到的条带单一明亮，A260/A280达到1. 93,A260/ A230达到1. 84,说明本发明方法能够将麦曲中以孢子形式存在的真菌、以芽孢形式存在的 细菌等菌体DNA得到有效提取，同时能够除去麦曲体系中存在的大量多糖污染。本发明方 法得到的总DNA能够直接用于PCR，无需再使用试剂盒对提取的样品进行纯化，从而建立了 一种可以用于分子生物