学分析、高质量提取麦曲总DNA的方法；
[0040] (2)本发明方法先将麦曲与微生物进行分离再进行DNA的提取，对常规麦曲总微 生物DNA提取做出了改进。本发明方法通过添加吐温80,促进了霉菌孢子从固体杂质上的 洗脱，同时使孢子能够进入提取液中，避免了其在提取提取过程中悬浮于提取液上层导致 大量损失；本发明改进了传统SDS法提取含多糖环境效果不佳的缺点，针对麦曲含有的大 量多糖，采用CTAB法与SDS法联用，有效的减少了产物中多糖的污染；本发明针对麦曲体系 的复杂性，先采用SDS法对样品进行提取，之后再与CTAB法联用，这样的使用顺序一方面提 高了对样品提取的强度，同时既减少了单纯采用CTAB法时加入CTAB的用量，也降低了单纯 采用SDS法多糖带来的污染；本发明通过控制CTAB的用量有效提高了DNA的提取效果，避 免了过少的CTAB用量导致的多糖去除不彻底，以及过多的CTAB添加导致的后续处理中增 加了总DNA提取的损失。
【附图说明】
[0041 ] 图1 :本发明方法提取的麦曲总DNA电泳图，其中1为麦曲样品，M为Marker人DNA/ PstI;
[0042] 图2 :以本发明方法提取的麦曲总DNA为模板进行16SrDNAPCR扩增电泳图，其中 1为麦曲样品16SrDNAPCR扩增产物，M为MarkerDL15000 ;
[0043] 图3 :以本发明方法提取的麦曲总DNA为模板进行18SrDNAPCR扩增电泳图，其中 1为麦曲样品18SrDNAPCR扩增产物，M为MarkerDL15000 ;
[0044] 图4:本发明方法提取米曲霉及黑曲霉孢子DNA得到的电泳图，其中M为 MarkerADNA/PstI，1为米曲霉孢子样品，2为黑曲霉孢子样品。
【具体实施方式】
[0045] 以下结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，本实施例在以本发明技术 方案为前提下进行实施，给出详细的实施方式和具体的操作过程，所述是对本发明的解释 而不是限定。
[0046] 实施例1 :麦曲中总DNA的提取
[0047] 本实施例包括以下步骤：
[0048] (1)取5. 5g麦曲样品加15mlddH20置于50ml离心管中并添加终质量浓度为 0.04%的吐温80，加入适量玻璃珠，充分振荡51^11;4°(：条件于明70(^超声波清洗器中超 声振荡5min;200g离心5min，取上清，10000g离心lOmin;收集沉淀，加2mlddH20混悬均 勾转移至2mlEP管；10000g离心10min，得菌沉淀；
[0049] (2)菌沉淀加入 0? 5mLDNA抽提液（100mmol/LTris-HCLpH8. 0,100mmol/L EDTA，pH8. 0,100mmol/LNa3P04,1. 5mol/LNaCl)混悬，液氮条件下充分研磨菌体；
[0050] (3)向⑵得到的溶液中加入10yL溶菌酶（50mg/mL)，37°C条件下放置30min;;
[0051] (4)向（3)得到的溶液中加入125yL10%SDS，立即加入5yL蛋白酶K(20mg/ mL)，混均后65°C水浴lh;
[0052] (5)向⑷得到的溶液中加入1000yLCTAB缓冲液，混均后65°C水浴lh;
[0053] (6)步骤（5)所得样品用等体积的氯仿-异戊醇（体积比24:1)混均后于4°C条 件下，12000g，离心 15min，；
[0054] (7)重复步骤（6) 1次；
[0055] (8)向步骤（7)得到的溶液中加入0. 6倍体积的异丙醇于_20°C沉淀lh;
[0056] (9)将步骤⑶得到溶液于4°C，12000g条件下离心10min，收集核酸沉淀；
[0057] (10)向步骤（9)得到的沉淀中加入lml70%的乙醇于4°C条件下，12000g，离心 lOmin；
[0058] (11)重复步骤（10) 1 次；
[0059] (12)吸去步骤（11)得到样品的清液，收集沉淀，倒扣去除过量液体，于37°C干燥 DNA；
[0060] (13)向步骤（12)得到的样品中加入100yLDD水溶解沉淀，加入终浓度为10yL/ mL的RNA酶，并在37°C下水浴消化30,以去除RNA。
[0061] 实施例2 :麦曲总DNA的电泳检测及PCR扩增
[0062] 将实施例1中得到的麦曲总DNA用0. 8 %琼脂糖对所得麦曲总DNA进行电泳实验， 所用Marker为MarkerDL15000,跑胶完成后用伯乐DCXR+凝胶成像仪进行拍照观察得到 电泳图（如图1所示），从电泳图可以看出，电泳条带单一，清晰无杂带，无明显拖尾现象。
[0063] 将得到的麦曲总DNA进行TouchPCR扩增，对其中真菌的18SrDNA区进行 扩增，对细菌的16SrDNA区进行扩增。真菌扩增采用通用引物：上游引物序列NS1: 5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'，下游引物序列NS8 :5' -TCCGCAGGITCACCTACGCGA-3'， 扩增片段大小为1. 7kb左右；细菌采用通用引物：上游引物序列27f: 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3'，下游引物序列 1492r:5' -TACGGCTACCTTGITACGACTT-3'，扩 增片段大小为1. 5bp左右。
[0064] 真核微生物PCR反应体系如下（20yL):TaqPCRmastermix10yL，上下引物各 〇. 2yL，模板1yL，补无菌水至20yL。相应PCR反应条件为：95°C预变性5min;94°C变性 30s，60°C退火 30s，72°C延伸 2min(TouchdownPCR，10 个循环，每个循环降低 1°C) ;94°C 变性30s，58°C退火30s，72°C延伸2min(20个循环）；72°C终延伸7min。
[0065] 原核微生物PCR反应体系如下（20yL):TaqPCRmastermix10yL，上下引物各 〇. 4yL，模板1yL，补无菌水至20yL。相应PCR反应条件为：95°C预变性5min;94°C变性 30s，57°C退火 30s，72°C延伸 2min(TouchdownPCR，10 个循环，每个循环降低 1°C) ;94°C 变性308,55°(：退火308,72°(：延伸2111111(20个循环）；72°(：终延伸7111111。？〇?产物用0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测，所用Marker为MarkerDL15000,跑胶完成后用伯乐DCXR+凝胶成 像仪进行拍照观察得到电泳图（如图2、3所示）。
[0066] 从图2和图3可以看出，对麦曲总DNA中细菌和真菌相应片段扩增后电泳得到的 条带单一，无杂带，扩增特异性强，细菌扩增条带大小为1500bp左右，真菌扩增条带大小为 1700左右，说明本发明针对麦曲的提取方法可以高质量的对麦曲中的总DNA进行提取，可 以用于对麦曲分子生物学的研究。
[0067] 实施例4 :不同方法对麦曲总DNA提取效率比较
[0068] (1)与已有报道方法的对比：
[0069] 样品1 :实施例1得到的麦曲总DNA样品
[0070] 样品2 :按照张中华文献《绍兴黄酒麦曲中微生物群落结构的研究》中的方法提取 麦曲总DNA得到的样品
[0071] 样品 3 :按照zhou等文献《DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition》 中方法提取麦曲总DNA得到的样品
[0072] 三种方法得到麦曲总DNA样品进行纯度和提取质量浓度比较如表1所示：
[0073] 表1 3种不同方法提取得到的总DNA产量及纯度
[0074]
[0075] 从表1可以看出，本发明方法对于麦曲的提取相对于其他两种方法能够更好的避 免蛋白、多糖及各种小分子的污染，同时提取的DNA质量浓度最高，达到了 149ng/yL，是一 种高质量提取麦曲总DNA的方法。
[0076] (2)提取试剂对提取效率的影响
[0077] 样品1 :实施例1得到的麦曲总DNA样品
[0078] 样品2 :实施例1中省略吐温添加步骤进行提取所得麦曲总DNA样品。
[0079] 样品3 :实施例1中CTAB提取液添加量为1. 8mL时进行提取所得麦曲总DNA样品。
[0080] 样品4 :实施例1中CTAB提取液添加量为0. 3mL时进行提取所得麦曲总