一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 二羟基丙酮（Dihydroxyacetone)广泛应用于医药、农药中间体的制备，可用来 合成杂环化合物、甘油三酯、酮位取代化合物。二羟基丙酮可作防晒化妆品的组成成分。 在微生物代谢转化甘油为二羟基丙酮的氧化途径中，甘油在依赖于NAD+的甘油脱氢酶 (Glyceroldehydrogenase，简称⑶H，EC1.1. 1.6)的作用下形成二羟基丙酮。甘油脱氢酶 在医学诊断分析中也得到广泛应用，例如用于酶法分析血脂含量。
[0003] 在氧化还原酶催化过程中，辅酶的再生利用至关重要，在二羟基丙酮的酶法生产 中，使用辅酶氧化酶辅助辅酶再生，可以实现辅酶的循环利用，从而降低酶法生产二羟基丙 酮的成本。利用固定化多酶耦联体系催化合成二羟基丙酮，较微生物发酵法和化学法具有 反应效率高，操作简易，有利于连续反应和下游分离等优点，有利于此技术的工业化推广。
[0004] 聚乙稀亚胺（Polyethyleneimine，简称PEI)是一种水溶性聚胺，大分子链上具有 大量氨基。当pH〈10时，其分子链上的氨基多处于质子化状态，是一种带正电荷的聚电解 质。大部分酶在pH〈10时带负电，因此聚乙烯亚胺在该条件下对酶分子具有静电吸附作用， 从而实现固定化。Palomo等人曾用聚乙稀亚胺修饰的Sepabeads树脂固定化脂肪酶用于扁 桃酸甲酯的水解，结果表明固定化酶的对映体选择性优于游离酶；CesarMateo等人用聚乙 烯亚胺制备可以重复回收使用的固定化载体，实现酶的可逆固定化。
[0005] 基于静电相互作用的聚乙烯亚胺固定化酶的方法作用力较弱，需增强酶与PEI之 间的作用力。戊二醛是传统的固定化方法中采用较为广泛的交联剂，应用于脂肪酶、蛋白 酶、半乳糖苷酶等的固定化上。由于戊二醛交联形成共价键，对于易失活的氧化还原酶容易 造成酶活性大幅度下降。
【发明内容】
[0006] 本发明利用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶，以及甘油脱氢 酶-辅酶氧化酶融合酶，人工构建体外多酶耦联体系，提高多酶体系的稳定性与催化效率， 并且实现辅酶的循环再生。包括以下步骤：
[0007] 1)工程菌的构建：构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅 酶氧化酶基因，并利用上述两基因构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶 基因，用BamHI和xholI分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化 大肠杆菌（DH5a)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶、可表达 辅酶氧化酶、可表达甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的工程菌；
[0008] 2)粗酶液制备：将步骤1)得到的工程菌接种到含有氨苄霉素的LB培养基中培 养，培养一段时间后加入诱导剂异丙基硫代-0-D-半乳糖苷（简称IPTG);培养所得发酵 液在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液 离心，收集上清液即为粗酶液；
[0009] 3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化并利用Tris-HCl缓冲 液（pH6. 5~8. 0)超滤除盐，得到甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合 酶；
[0010] 4)聚乙烯亚胺-金属溶液制备：配置浓度为5~200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液， 向该溶液中加入金属盐溶液并使其终浓度为〇. 05~50mmol/L，配成混合溶液，4°C保温 0. 5~4h，离心除去上清，沉淀重悬于1~100mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸缓冲液或1~ 100mmol/L的pH8. 0~10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
[0011] 5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油 脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的酶浓度为〇. 〇5mg/ml~10mg/ml的酶溶液加入至步骤4)中 获得的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，冲洗，重悬 于0. 05M的pH7. 0的Tris-HCl缓冲液或0. 05~0. 1M的pH8. 0~10. 0的氨水-氯化铵缓 冲液中，即得聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
[0012] 其中，所述步骤1)中，带有组氨酸标签的甘油脱氢酶、带有组氨酸标签的辅酶氧 化酶、带有组氨酸标签的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶基因的核苷酸序列分别如SEQID NO. 1、SEQIDNO. 2、SEQIDNO. 3 所示。
[0013] 其中，所述步骤1)中，接种量为1~3%，所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨 5. 0~15. 0g/L，酵母粉1. 0~10. 0g/L，NaCl0. 0~15. 0g/L，接种前添加氨苄霉素使其终 浓度为50~150yg/mL;所述培养条件为：起始pH7. 0~7. 5,培养温度37°C，150~250 转/分钟培养4~6h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5~15mg/ml，继续在25~30°C， 150~250rpm下培养1. 5~3h;培养所得的发酵液，在冷冻离心机中4°C，8000rpm离心 15min获得细胞，弃上清液，沉淀用Tris-盐酸缓冲液（pH6. 5~8. 0)重悬，充分洗涤后离 心，重复操作3次，获得细胞，配置浓度为50~150g/L的细胞液，利用超声破碎仪对细胞液 进行处理，将制备的细胞悬液置于冰浴中，细胞破碎仪探头置于液面下1厘米，功率200W， 超声2秒，间隔4秒，超声20~60次。然后4°C、12000rpm将破碎液离心15min去除不溶 性细胞碎片，收集上清即为粗酶液。
[0014] 其中，所述步骤3)中，纯化过程采用的纯化柱为能够特异性纯化带有His-tagged 标签的蛋白质的HisTrap HP镍柱，其步骤包括平衡、上样、平衡、洗脱、柱子再生；收集洗脱 的部分并利用超滤离心管进行除盐，除盐后获得的液体即为纯酶溶液。
[0015] 其中，所述步骤4)中，聚乙烯亚胺包括分子量20~500KDa的直链PEI(优选为 分子量为22KDa，87KDa，217KDa)与分子量20~500KDa的支链PEI(优选分子量为25KDa， 187KDa)两种。
[0016]其中，所述步骤4)中，使用的金属盐为CuCl2、NiCl2、ZnCl2、MnCl2、MgCl2、CaCl2、 CoCl2、TiCl4〇
[0017] -种根据上述的制备方法所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。
[0018] 本发明的有益效果如下：
[0019] 本发明选用聚乙烯亚胺作为固定化骨架，利用金属离子在聚乙烯亚胺分子以及重 组酶的组氨酸标签之间的配位作用力，实现酶的高效稳定固定化，从而制备聚乙烯亚胺金 属配位固定化多酶体系。金属离子不仅在固定化过程中起配位交联作用，还可提高多酶体 系的催化效率。本发明所获得的聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系具有操作方法简单， 固定化迅速，温度稳定性高及重复使用稳定性好等优点，并能提高酶的催化能力和多酶体 系的协同作用。
【附图说明】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
[0021] 图1为本发明实施例一所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶的表面 扫描电镜（SEM)图。
[0022] 图2为本发明实施例一所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化辅酶氧化酶的温度 稳定性实验变化图，其中横坐标为时间，纵坐标为相对酶活，N0X+Mn2++PEI为聚乙烯亚胺金 属配位固定化辅酶氧化酶，N0X为游离酶。
[0023] 图3为本发明实施例二所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶的表面 扫描电镜（SEM)图。
[0024] 图4为本发明实施例二所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶的温度 稳定性实验变化图，其中横坐标为时间，纵坐标为相对酶活，PEI+Mn2++GDH为聚乙烯亚胺金 属配位固定化甘油脱氢酶，GDH为游离酶。
[0025] 图5为本发明实施例三所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧 化酶融合酶多酶耦联体系的表面扫描电镜（SEM)图。
[0026]图6为本发明实例三所制备的聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶 融合酶多酶耦联体系与游离酶体系催化甘油生产二羟基丙酮的转化率对比图，其中纵坐标 为转化率，PEI-Mn-GDH-NOX为聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多 酶親联体系，Freecoupling为游离酶体系。
[0027] 图7为本发明实施例四所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶 氧化酶耦联体系的表面扫描电镜（SEM)图。
[0028] 图8为本发明实例四所制备的聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧 化酶耦联体系与游离酶体系催化甘油生产二羟基丙酮的转化率对比图，其中纵坐标为转化 率，PEI-Ca-GDH-NOX为聚乙烯亚金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系，Free coupling为游离酶体系。
[0029]图9为本发明所使用的二羟基丙酮标准工作曲线。
[0030] 图10为本发明所使用的甘油检测的液相色谱图。
【具体实施方式】
[0031] 下面通过实施例具体说明本发明的内容：
[0032] 实施例1
[0033] 1)工程菌的构建：PCR法构建如SEQIDN0. 2所述的带有组氨酸标签的辅酶氧化 酶基因，用BamHI和xholI分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转 化大肠杆菌（DH5a)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)制备可表达辅酶氧化酶N0X的 工程菌E.coliBL21(DE3)/pET32a;所述辅酶氧化酶基因的原始序列来源于Lactobacillus brevis；
[0034] 2)粗酶液