浓度为0.25mg/ml的 步骤3)中得到的甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶的Tris-HCl(0.lM，pH7. 0)酶溶液以1:1 的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗 粒，离心分离，并用去离子水冲洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙烯 亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合酶多酶耦联体系，甘油脱氢酶-辅酶氧 化酶融合酶的包埋率为97. 6%，甘油脱氢酶酶活为12. 8U/mg，辅酶氧化酶酶活为1. 7U/mg， 其SEM形态见图5。
[0053] 6)利用催化甘油生产二羟基丙酮检测酶活性的方法：
[0054] 原理：二羟基丙酮有还原性，在煮沸条件下，可以与磷钼酸试剂发生反应，生成钼 蓝，使溶液呈蓝色，其颜色深度与二羟丙酮的浓度成正比，可以用比色法时行定量测定。
[0055] 标准曲线的制备：分别吸取各标准浓度二羟丙酮（0. 05、0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、 0. 4mg/mL) 100yL于1. 5mL离心管，然后分别加入100yL磷钼酸试剂，置于100°C水浴箱加 热15min。取20yL显色液加入200yL去离子水中，在630nm处测定吸光度，以吸光度为 纵坐标，二羟丙酮浓度为横坐标绘制标准曲线，其线性回归方程为：y= 9. 5429X+0. 0454,R2 =0? 9989(图 9)。
[0056] 底物甘油的浓度用高效液相色谱检测，色谱条件为：AmineX-HPX-87H色谱柱 (Bio-rad)，流动相为5mmol/L的硫酸溶液（用娃哈哈纯净水配制），流动相流速为0. 5mL/ min，柱温65°C，示差折光检测器，检测器温度45°C，进样量20yL，色谱图见图10。
[0057] 催化甘油生产二羟基丙酮：反应体系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+， 100mm〇l/L磷酸缓冲液（pH8.0)，催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶-辅酶氧 化酶融合酶多酶耦联体系和相等酶浓度的游离酶体系，30°C，200rpm反应2h，取样离心，检 测上清液二羟基丙酮含量，实验结果见图6,可以看出固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶融合 酶多酶耦联体系的转化率为73. 2%，游离酶体系为32. 5%，证明采用聚乙烯亚胺金属配位 固定化甘油脱氢酶-辅酶氧化酶多酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
[0058] 实施例4
[0059] 1)工程菌的构建：采用实施例2中制备的可表达甘油脱氢酶GDH的工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET32a和实施例1中制备的可表达辅酶氧化酶N0X的工程菌E. coli BL21(DE3)/pET32a；
[0060] 2)~3)实验步骤如实施例1和2的步骤2)~3)，制备得到甘油脱氢酶和辅酶氧 化酶；
[0061] 4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量187KDa) 溶液，向该溶液中加入氯化妈溶液并使其终浓度为〇. 〇5mmol/L，配成混合溶液，4°C保 温2h，离心除去上清，沉淀重悬于1~100mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸缓冲液或1~ 100mmol/L的pH8. 0~10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
[0062] 5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓 度均为0? 2mg/ml的Tris-HCl(0? 05M，pH7. 0)酶溶液以4:1的比例加入至步骤4)中得到的 聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲 洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙稀亚胺金属配位固定化甘油脱氢 酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为85. 6%和94. 5%，酶 活分别为5.541]/1^和2.391]/11^，相比于游离酶活性分别提高了110.7%和54.2%，其5￡1 形态见图7。
[0063] 6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实 施例3,反应体系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液（pH8. 0)， 催化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的 游离酶体系，30°C，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，实验结果见图 8,可以看出固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为65. 2%，游离酶体系为 27.0%，证明采用聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶 的催化活性与多酶耦联的效率。
[0064] 实施例5
[0065] 1)~3)实验步骤如实施例4的步骤1)~3);
[0066] 4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量25KDa)溶 液，向该溶液中加入氯化铜溶液并使其终浓度为0. 5mmol/L，配成混合溶液，4°C保温2h，离 心除去上清，沉淀重悬于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸缓冲液或1~100mmol/L 的pH8. 0~10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
[0067] 5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓 度均为0? 5mg/ml的Tris-HCl(0? 1M，pH7. 0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的 聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲 洗，重悬于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)缓冲液中，形成聚乙稀亚胺金属配位固定化甘油脱氢 酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为92. 3%和94. 3%，酶 活分别为 1. 48U/mg和 0? 27U/mg。
[0068] 6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实 施例3,反应体系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液（pH8. 0)，催 化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离 酶体系，30 °C，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶 和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为78. 8%，游离酶体系为27. 0%，证明采用聚乙烯亚胺金 属配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
[0069] 实施例6
[0070] 1)~3)实验步骤如实施例4的步骤1)~3);
[0071] 4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为100mg/ml的直链PEI(分子量217KDa) 溶液，向该溶液中加入氯化镍溶液并使其终浓度为50mmol/L，配成混合溶液，4°C保温4h， 离心除去上清，沉淀重悬于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸缓冲液或1~lOOmmol/ L的pH 8.0~10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
[0072] 5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓 度均为10mg/ml的Tris-HCl(0. 1M，pH7. 0)酶溶液以1:1的比例加入至步骤4)中得到的 聚乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲 洗，重悬于Tris_HCl(0. 05M，pH7. 0)缓冲液中，形成聚乙稀亚胺金属配位固定化甘油脱氢 酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为85. 8%和98. 6%，酶 活分别为 6. 42U/mg和 0? 30U/mg。
[0073] 6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实 施例3,反应体系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液（pH8. 0)，催 化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离 酶体系，30 °C，200rpm反应2h，取样离心，检测上清液二羟基丙酮含量，固定化甘油脱氢酶 和辅酶氧化酶耦联体系的转化率为98. 6%，游离酶体系为27%，证明采用聚乙烯亚胺金属 配位固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系能提高酶的催化活性与多酶耦联的效率。
[0074] 实施例7
[0075] 1)~3)实验步骤如实施例4的步骤1)~3);
[0076] 4)配置聚乙烯亚胺-金属溶液：配置浓度为5mg/ml的支链PEI(分子量25KDa)溶 液，向该溶液中加入氯化镁溶液并使其终浓度为25mmol/L，配成混合溶液，4°C保温2h，离 心除去上清，沉淀重悬于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸缓冲液或1~100mmol/L 的pH8. 0~10的氨水-氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺-金属溶液；
[0077] 5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的浓 度均为5mg/ml的Tris-HCl(0. 1M，pH7. 0)酶溶液以2:1的比例加入至步骤4)中得到的聚 乙烯亚胺-金属溶液，同时不断搅拌孵化，形成固定化颗粒，离心分离，并用去离子水冲洗， 重悬于氨水-氯化铵（〇. 1M，pH8.0)缓冲液中，形成聚乙烯亚胺金属配位固定化甘油脱氢 酶和辅酶氧化酶耦联体系，甘油脱氢酶和辅酶氧化酶的包埋率分别为95. 5%和91. 6%，酶 活分别为 2. 25U/mg和 0? 46U/mg。
[0078] 6)催化甘油生产二羟基丙酮：原理、标准曲线的制备及底物甘油的浓度检测同实 施例3,反应体系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸缓冲液（pH8. 0)，催 化剂使用步骤5)所制备的固定化甘油脱氢酶和辅酶氧化酶耦联体系和相等酶浓度的游离 酶体系，30 °C，200rpm反应2h，取样离心