苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子及其制备和应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化 磁性纳米粒子及其制备方法和在尿液中修饰核苷与核糖基化代谢物选择性富集方面的应 用。
【背景技术】：
[0002] 核糖核酸在许多生命过程中发挥着非常重要的作用。发生在核糖核酸核糖上或者 碱基上的多样化的修饰通常与其生物功能密切相关。核糖核苷作为核糖核酸的末端代谢物 能够直接反应核糖核酸的代谢速度。由于在细胞内缺乏特异性的磷酸化酶，修饰核苷不能 像正常核苷那样被再次合成重新利用，因此通常从细胞中分泌出来进入体液中。在癌细胞 中，受损的转录RNA代谢最终导致修饰核苷水平异常。因此修饰核苷被作为癌症潜在标志 物广泛研究。
[0003]目前，对修饰核苷的研究主要集中在利用液相或者毛细管电泳与紫外或质谱联用 技术对修饰核苷进行定量分析。但是，检测和发掘未知的修饰核苷对于发现新的癌症标记 物具有十分重要的意义。但是，低丰度和复杂的基质干扰为探索新型修饰核苷设置了障碍。 所以，适宜的预处理手段对于修饰核苷的提取和检测是十分必要的。
[0004] 在线SPE(质子型硼酸亲和色谱柱)面临着上样溶剂和流动相难以兼容的问题。离 线模式的SPE诸如商品化的OasisWCX,BondElutPlexa,andOasisHLB常常因为较差的 选择性和低的绝对回收率限制了它们的应用。像Affi-Gel601这种硼酸吸附剂由于在改 变pH条件下能可逆的与修饰核苷中核糖上的1，2顺二羟基形成可逆的5或6元环酯而广 泛应用高选择的捕获修饰核苷。然而该种材料需要繁琐的活化前处理和低的上样量，和较 长的操作时间，大大限制了处理的通量。近年来，硼酸功能化的纳米粒子引起了广泛关注， 尤其是磁性纳米粒子。因磁性纳米粒子具有高的比表面积，表面易修饰，快速磁场响应的特 点，因此整个操作过程简便迅速。但是，目前的苯硼酸功能化磁性材料吸附容量和选择性还 难以满足实际需求。一般来讲，为了提高吸附容量，人们通常在材料表面经原子转移自由 基聚和法嫁接聚合物或者引入介孔结构。不幸的是，原子转移自由基反应通常要严格控制 反应条件在无水无氧下操作，介孔结构也通常会限制内部物质的传输不利于非特异性的排 除。而人们通常用于减小非特异性吸附的聚乙二醇链在随后的官能团引入过程中常需要多 步的化学改性，提高了合成的难度。
【发明内容】
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[0005] 本发明的目的是提供一种制备简单，吸附容量高，选择性强，可高效对痕量1， 2-顺二羟基代谢物进行特异性捕获的苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子及其制备 方法和应用。
[0006] -种苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子，由如下方法制备：先采用溶剂热 还原法合成四氧化三铁纳米粒子，然后用正硅酸四乙酯经过反相微乳法合成具有核壳结构 的单分散性Fe304@Si02磁性纳米粒子，通过在Fe304@Si02表面硅羟基缩合3-氨丙基三乙氧 基硅烷引入氨基，为进一步增大Fe304@Si02表面氨基的量，随后用戊二醛经还原胺化法在 Fe304@Si02表面侨联聚乙烯亚胺，最终再次通过还原胺化反应键合4-甲酰基苯硼酸，即为 苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子。
[0007] 所述四氧化三铁磁性微球的粒径为6-10nm，中间层氧化硅层的厚度为28-35nm， 外层键入苯硼酸官能团的聚乙烯亚胺层厚度为2-5nm。
[0008] 具体步骤：
[0009] 第一步先采用溶剂热还原法合成四氧化三铁纳米粒子：以0. 5-0. 6g乙酰丙酮铁 为原料，用30-45ml正辛醇作溶剂，加入8-12ml正辛胺，反应温度为220-260°C，反应时间为 1-3小时，得到Fe304磁性纳米粒子；
[0010] 第二步采用反相微乳法合成具有核壳结构的Fe304@Si02磁性纳米粒子：首先对 第一步制得的Fe304磁性纳米粒子用环己烷清洗以除去表层吸附杂质，然后直接超声分散 到环己烧溶液中形成0. 5mg/mL的Fe304/环己烧溶液备用；
[0011] 将13-17g表面活性剂（Ig印alC0-520)溶解于280-350mL环己烷随后再加入 25-32mLFe304/环己烷溶液，经过2-6小时充分搅拌，加入2. 5-3. 2mL质量浓度28-30%浓 氨水反应1-3小时，最后在室温搅拌条件下逐滴加入1. 8-2. 4mL正硅酸四乙酯，反应20-26 小时，经过水和异丙醇清洗之后得到Fe304@Si02磁性纳米粒子；
[0012] 第三步在Fe304@Si02表面引入氨基：将第二步得到的Fe304@Si02磁性纳米粒子 分散到异丙醇溶液中，其浓度比例为在lg/500mL-lg/800mL之内，超声分散后，将8-llmL 3_氨丙基三乙氧基硅烷逐滴滴入溶液中，在氩气保护条件下，常温反应20-28小时；
[0013] 第四步合成聚乙烯亚胺修饰的磁性纳米粒子：第三步得到的产物用水以及甲醇 先后分别清洗后，分散于250-350mL冰醋酸/甲醇混合溶液中，随后加入2-4mL戊二醛于 30-50度水浴反应8-15小时，产物经冰醋酸/甲醇溶液洗2-3次后再次分散于250-350mL冰 醋酸/甲醇溶液中，加入〇. 05-0. 2g聚乙烯亚胺(重均分子量10000-75000)以及100-400mg 硼氢化钠还原反应8-15小时；其中，冰醋酸/甲醇体积比为1:100-1:150.
[0014] 第五步苯硼酸修饰：向第四步得到的产物加入4-甲酰基苯硼酸以及200-500mg 硼氢化钠30-50度反应8-15小时，其中，4-甲酰基苯硼酸的加入量为第四步得到的产物重 量的 20-100%。
[0015] 直接将上述磁性纳米粒子加入含有修饰核苷和核糖基代谢物在内的1，2-顺二羟 基化合物复杂基质溶液中，进行痕量1，2-顺二羟基化合物的分离富集。
[0016] 由于上述技术方案的采用，与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明提出的 磁性纳米粒子，可作为一种亲和探针对复杂生物样品中痕量1，2-顺二羟基化合物实现高 选择性富集，并结合LC/MS和中性丢失查找软件对富集到的1，2-顺二羟基化合物进行分析 和鉴定。该材料合成方法简单，中间的磁核能提供足够的磁场响应，由于聚乙烯亚胺的引入 大大提高了材料的吸附容量和选择性。该材料在1，2-顺二羟基代谢物富集过程中展现了 很高的选择性，富集能力强和快速平衡的特点，在代谢组学领域具有良好的实用前景和应 用价值。
【附图说明】：
[0017] 图1是制备过程中不同阶段的透射电镜图以及材料的磁滞回线。（a)溶剂热法合 成的四氧化三铁纳米粒子.（b)Fe304@Si02核壳结构纳米粒子.（c)在？6304郎;102表面修饰 了聚乙烯亚胺以及4-甲酰基苯硼酸.（d)苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子磁滞回 线。从图中可以观测到材料具有典型核壳结构，较好的分散性和均一的包覆性，和较强的磁 性。
[0018] 图2是4-甲酰基苯硼酸键合前后红外光谱图。（a)苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁 性纳米粒子。（b)嫁接了聚乙烯亚胺的Fe304@Si02m米粒子.由图可知，4-甲酰基苯硼酸 已经成功键合到材料表面。
[0019] 图3是用苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子处理非顺二羟基混合物 (a，b，c)以及1，3_顺二羟基混合物（d，e)与1，2顺二羟基混合物按照摩尔比; 100:1 ;100:1 ;1000:1的前后对比图。比较处理前的（i)图和处理后的（ii)图可知该材料 具有很强的选择性和稳定的回收率。
[0020] 图4是苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子处理实际尿液前后提取离子流 色谱图。处理前（a)后（b)的对比可以得知该材料具有优良的富集能力。
[0021] 图5是本发明反应过程图（TE0S:正硅酸四乙酯；APTES: 3-氨丙基三乙氧基硅烷； PEI:聚乙烯亚胺；4-FPBA:4-甲酰基苯硼酸）
【具体实施方式】：
[0022] 苯硼酸修饰聚乙烯亚胺杂化磁性纳米粒子的具体合成方法是：先采用溶剂热还原 法合成四氧化三铁纳米粒子，然后用正硅酸四乙酯经过反相微乳法合成具有核壳结构的单 分散性Fe304@Si02磁性纳米粒子，再通过材料表面硅羟基缩合3-氨丙基三乙氧基硅烷引入 氨基，为进一步增大材料表面氨基的量，随后用戊二醛经还原胺化法侨联在材料表面引入 聚乙