一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法

一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法
【专利摘要】本发明涉及一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法，在PEI溶液中先加入活化后的mPEG?COOH溶液，再加入活化后的FA?PEG?COOH溶液，搅拌反应得到PEI?mPEG?(PEG?FA)；然后在PEI?mPEG?(PEG?FA)溶液中加入FI溶液避光搅拌反应最后加入三乙胺、乙酸酐搅拌，透析冷冻干燥得到FA?mPEI；在FA?mPEI的水溶液中加入预先脱酸的阿霉素·盐酸盐DOX·HCl，避光敞口搅拌，然后离心、选取上清液，干燥，即得；本发明采用价廉易得的PEI为基础载体，FA为靶向试剂，降低了材料的成本，对生物体无不良影响，制备方法简单，条件温和，易于操作，具有良好的前景。
【专利说明】
一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法
技术领域
[0001] 本发明属于负载药物缓释体系的制备领域，特别涉及一种叶酸靶向的多功能超支 化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法。
【背景技术】
[0002] 癌症一直被认为是人类需要攻克的重大难题之一。化学药物治疗作为癌症治疗的 重要手段之一，长期以来倍受关注。然而常见的抗肿瘤药物存在着水溶性差、毒副作用大， 药物释放快，抗肿瘤药物随血液运输到身体的各个部位，造成患者正常组织和器官受到严 重损伤等问题。近年来，利用纳米材料作为载体负载抗肿瘤药物，可显著增加药物水溶性、 实现药物缓释;延长药物在肿瘤部位的作用时间；同时通过修饰靶向分子，使药物靶向识别 肿瘤部位，从而能有效的聚集在肿瘤部位，实现更好的肿瘤治疗效果，减少毒副作用(ACS Appl.Mater. Interfaces,6(2014)16416-16425；Adv.Drug Delivery Rev.,55(2003)329-347)。因此，研究一种新型的纳米药物缓释体系是目前纳米医学的研究热点。
[0003] 超支化聚乙烯亚胺(PEI)是一种分子量较大的支链状PEI，内部有疏水的空腔，具 有支化的三维结构，表面具有大量带正电荷的氨基，为其进一步化学修饰提供了条件，而且 PEI商业化程度高，价格低廉，可以作为一种良好的药物载体。Wen等系统地研究了支化PEI 的表面氨基的各种修饰，如乙酰化、羟基化、羧基化及聚乙二醇化 (J. Appl .Polym. Sci .2013,128(6) ,3807-3813)。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容 性的链状聚合物，将其修饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性，同时能延长药 物缓释时间。Chen等用透明质酸链接PEG修饰的PEI作为靶向药物输送的载体(RSC Adv.， 2016,6,9232-9239)，在体外具有较长的药物缓释时间和良好抗肿瘤细胞能力。但此工作仅 停留在细胞层面，没有验证动物体内的抗肿瘤活性。叶酸(FA)是一种水溶性的维生素。此 外，FA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的FA受体分子特异性结合。 通过FA与肿瘤细胞表面FA受体分子的特异性结合可实现药物缓释体系对肿瘤细胞的特异 性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
[0004] 查阅国内外相关文献或专利，合成FA靶向的聚乙烯亚胺作为药物载体用于抗肿瘤 药物输送与肿瘤靶向治疗的研究尚未见报道。

【发明内容】

[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负 载阿霉素的方法，本发明制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，易于操作，具有产业化实 施的前景。
[0006] 本发明的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法，包括：
[0007] (1)在超支化聚乙烯亚胺PEI溶液中逐滴加入1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚 胺盐酸盐H)C/N-羟基丁二酰亚胺NHS活化后的mPEG-COOH溶液，搅拌反应60-80h，透析，冷冻 干燥，得到白色粉末，标记为PEI -mPEG;其中EDC与mPEG-⑶OH的摩尔比为8-12:1 (最优摩尔 比为IO: I); NHS与mPEG-COOH的摩尔比为8-12:1(最优摩尔比为10:1); mPEG-COOH与PEI的摩 尔比为15-25:1;mPEG-COOH为一端单甲醚、另一端羧基的聚乙二醇；
[0008] (2)将EDC/NHS活化后的叶酸FA溶液加入NH2-PEG-⑶OH溶液中，搅拌反应60-80h， 透析，冷冻干燥，得到浅黄色粉末，标记为FA-PEG-C00H;其中EDC与NH 2-PEg-COOH的摩尔比 为1.5-2.1:1(最优摩尔比为2:1) ;NHS与NH2-PEG-⑶OH的摩尔比为1.5-2.1:1(最优摩尔比 为2:1); FA与NH2-PEG-C00H的摩尔比为2 · 2-2 · 8:1 (最优摩尔比为2 · 5:1); NH2-PEG-C00H为一 端氨基、另一端羧基的聚乙二醇；
[0009] (3)将PEI -mPEG溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H溶液，搅拌反应60-80h，再逐滴加入异硫氰酸荧光素 FI溶液，搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，得到黄色粉末， 标记为PEI-FI-mPEG-(PEG-FA);其中EDC与FA-PEG-C00H摩尔比为8-12:1;(最优摩尔比为 10:1); NHS 与 FA-PEG-C00H 的摩尔比为 8-12:1(最优摩尔比为 10:1) FA-PEG-C00H 与 PEI -mPEG 的摩尔比为8-12:1 ;FI与PEI-mPEG的摩尔比为5-7:1;
[0010] (4)将PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)的水溶液中加入三乙胺，搅拌20-40min，再加入乙酸 酐，继续搅拌20-30h，透析，冷冻干燥，得到FA靶向的多功能PEIPEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)， 简写标记为FA-mPEI;其中三乙胺与PEI的摩尔比为2800-3500 :1;乙酸酐与I3EI的摩尔比 2500-3000:1；
[0011] (5)将盐酸阿霉素 DOX · HCl溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，然后逐滴加入到FA- mPEI水溶液，避光敞口搅拌12-24小时，离心，冷冻干燥，得到叶酸靶向的多功能超支化聚乙 烯亚胺负载阿霉素的药物缓释体系FA-mPEI/D0X;其中FA-mPEI与盐酸阿霉素 DOX · HCl的摩 尔比为1:8-20;其中三乙胺与甲醇的体积比为1:30-80。
[0012]步骤（I )-(3)中EDC/NHS活化羧基的方式:先在待活化材料的溶液中加入EDC溶液， 室温搅拌20-40min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-4h，即得活化后的材料;其中EDC和NHS的 摩尔比为0.8-1:1 (最优值为1:1)。
[0013] 步骤(I )-(3)中溶液中的溶剂均为二甲基亚砜DMS0。
[0014] 所述步骤（1)中超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000g/moI; mPEG-COOH的分子 量为 2000g/mol。
[0015] 所述步骤（1)中PEI溶液的浓度为2-8mg/mL，EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液的浓 度为2-6mg/mL，EDC溶液的浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL，其中EDC溶液的浓 度、NHS溶液的浓度为活化mPEG-COOH所用浓度。
[0016] 所述步骤（1) - (3)中EDC/NHS活化方式为先在待活化的物质溶液中加入EDC溶液， 室温搅拌20-40min，然后加入NHS溶液继续搅拌2-4h，即得活化后的物质。
[0017] 所述步骤（2)中NH2-PEG-⑶OH溶液的浓度为3-6mg/mL，EDC溶液的浓度为l-5mg/ mL，NHS溶液的浓度为I -5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA溶液的浓度为I -3mg/mL，其中EDC溶液 的浓度、NHS溶液的浓度为活化叶酸FA所用浓度。
[0018] 步骤(2)中NH2-PEG-C00H 的分子量为 2000g/mol。
[0019]所述步骤⑵中透析为：透析膜为纤维素透析膜，其MCWO = 2000,先在PBS中透析 ld，再在去离子水中透析2d。
[0020] 所述步骤（3)中PEI-mPEG溶液的浓度为2-5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H 溶液的浓度为〇. 5-1.5mg/mL，FI溶液的浓度为0.1-0.3mg/mL，E：DC溶液的浓度为2-5mg/mL， NHS溶液的浓度为2-5mg/mL，其中EDC溶液的浓度、NHS溶液的浓度为活化FA-PEG-COOH所用 浓度。
[0021]所述步骤（1 )、（3)、（4)中透析为:透析膜为纤维素透析膜，其MCWO为8000-14000， 先在PBS透析ld，再在去离子水中透析2d。
[0022] 所述步骤（5)中DOX · HCl溶液的浓度为8-12mg/mL，FA-mroi溶液的浓度为30-40mg/mL〇
[0023]所述步骤（5)中搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150转/分钟；离心的速率为 8000-10000转/分钟，时间为8-10分钟。
[0024] 所述步骤(5)中为预先脱酸的阿霉素·盐酸盐(D0X · HC1)。
[0025]支化聚乙烯亚胺(PEI)内部有疏水的空腔，具有支化的三维结构，表面具有大量带 正电荷的氨基，为其进一步化学修饰提供了条件，而且PEI商业化程度高，价格低廉，可以作 为一种良好的药物载体。聚乙二醇(PEG)是一种具有良好生物相容性的链状聚合物，将其修 饰到PEI表面能够提高材料的水溶性和生物相容性，同时能延长药物缓释周期。叶酸(FA)是 一种水溶性的维生素。此外，FA可以作为一种生物靶向分子，能与肿瘤细胞表面过度表达的 叶酸受体分子特异性结合。通过FA与肿瘤细胞表面叶酸受体分子的特异性结合可实现药物 缓释体系对肿瘤细胞的特异性识别与主动富集，实现肿瘤的特异性的靶向治疗。
[0026]本发明所得到的负载阿霉素的叶酸靶向聚乙烯亚胺的纳米药物缓释体系FA-mPEI/DOX能够有效控制阿霉素的释放，并且通过叶酸的主动靶向功能，能显著提高对特异 肿瘤细胞的抑制作用，应用前景广阔。
[0027] 本发明使用核磁共振氢谱(1H NMR)、紫外一可见光分光光度计(UV-Vis)、动态光 散射(Dynamic Light Scattering，DLS)测量等方法表征本发明制备的叶酸革El向的多功能 支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的纳米药物缓释体系，同时用CCK-8法、流式细胞术分析和激光 共聚焦显微镜来检验制备的纳米药物缓释体系FA-mPEI/DOX对高叶酸受体表达的子宫颈癌 细胞(HeLa细胞）的毒性与靶向性，以及对接种肿瘤动物的治疗效果做出详细评价。具体测 试结果如下：
[0028] (I)1H NMR
[0029] 参见说明书附图2(a)，6 · 5、7 · 5和8 · 5ppm是FA的特征质子峰，3 · 4-3 · 6ppm是PEG的 结构单元的亚甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG上链接了0.73个FA分 子。同样地，每个PEI (δ，2.2-3.4ppm)分子链接24.2个PEG，5.8个FA分子，和4.5个FI分子(参 见附图2)。制备的PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)经过乙酰化反应之后，在1.9-2.1ppm之间出现两 个峰，位于1.9ppm是二级酰胺的乙酰基的甲基质子峰，2.05ppm是三级酰胺的乙酰基的甲基 质子峰(参见附图2d)。通常认为伯胺比仲胺更易乙酰化，基于部分仲胺已发生乙酰化，所以 PEI表面氨基已全部被乙酰。另外，乙酰化的FA-mPEI的表面电势为1.33mV(参见附表1)，基 本显中性，也证实了PEI表面氨基全部被乙酰。
[0030] (2)UV-Vis 测试结果
[0031] UV-vis测试结果表明：FA的紫外吸收峰位于290nm左右，FI的紫外吸收峰位于 495nm左右，这些特征峰的出现说明我们成功制备FA-PEG-COOH，PEI-Ac-FI-mPEG(mPEI)和 FA-mPEI。载药之后，在480nm处的吸收峰增强明显（参见附图3a)。说明我们成功包裹了DOX， 生成了 mPE I /DOX 和 FA-mPE I /DOX。
[0032] (3)Zeta表面电势和水合粒径
[0033] 参见附表1，乙酰化后的载体的电势为l_3mV，基本为零，显中性。载药之后电势会 增加，但依然小于15mV，这样的电势本身并不会对细胞造成明显损伤。同时，载药之后的水 合粒径也会增大，但依然在200nm左右，这样的尺寸有利于细胞吞噬。
[0034] (4)D0X 上载率
[0035] 将DOX · HCl脱酸形成难溶于水的D0X，纯DOX以物理包裹的方式装载到制备的FA- mPEI中，生成FA-mPEI/DOX纳米药物缓释体系，然后取上清液进行紫外分析。DOX的紫外吸收 峰位于480nm，根据所制备的纳米药物缓释体系在480nm的紫外吸光值与DOX · HCl标准曲线 作比较，可以计算出DOX的上载效率为69%，上载百分比为6.1%。
[0036] (5)体外释放结果
[0037] 附图3b为FA-mPEI/DOX的体外累积释放曲线。在50小时中，DOX在弱酸性环境中（pH = 5.0)的释放量为51 %，比在生理环境(pH = 7.4)中的31.5%要大。说明这种载药体系具有 一定的pH响应性，在肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度比正常组织释放速度快，一 定程度减少DOX对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
[0038] (5)细胞毒性实验
[0039]将每孔8000个HeLa细胞种植于96孔板中培养过夜。倒掉原培养基，加入含不同材 料(FA-mPEI，FA-mPEI/D0X和纯D0X)的培养液再共培养24小时。倒掉培养液，用PBS洗2遍，加 入含CCK-8试剂的培养液(每孔20yL CCK-8试剂，180yL完全培养液)再孵育3h。之后用酶标 仪上检测各孔在λ = 450ηπι处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以生理盐水处理 的细胞作为空白对照，细胞活力记为100%。附图4结果显示，与空白对照组相比，经载体材 料FA-mPEI处理的实验组细胞活性均在80 %以上，说明载体材料FA-mPE I没有明显的细胞毒 性;制备的FA-mPEI/DOX和纯DOX都具有明显的细胞毒性，其半数致死量(IC5q)分别为5. Oyg/ mL和1.9yg/mL。可能的原因是，DOX是小分子易于快速穿透细胞膜，造成细胞损伤，而在纳米 药物缓释体系中DOX是缓慢从FA-mPEI/DOX释放出来的，因而在相同时间点下其药学活性较 低。
[0040] (6)流式细胞仪检测结果
[0041 ] 将每孔2\105此1^细胞种植于12孔板中，加入含有不同浓度的？六-1111^1/00父和 mPEI/DOX的培养液共培养4小时。之后倒掉培养液，经I3BS洗3次，用胰酶将细胞消化下来，转 移到5ml离心管中，1000转离心5分钟去除上清液，加 PBS Iml吹匀，放入冰盒，用流式细胞仪 对经FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理过的HeLa细胞的进行荧光检测。附图5结果显示在不同的 DOX浓度条件下，经FA-mPE I/DOX处理过He La细胞比经mPE I/DOX处理过的HeLa细胞表现出更 强的荧光信号。说明通过FA介导的靶向能力，本发明制备的FA-mPEI/DOX能够有效靶向识别 高叶酸受体表达的癌细胞。
[0042] (7)激光共聚焦显微镜检测结果
[0043] 将每孔5\104此1^细胞种在12孔板上培养过夜，然后加入含1(^/11^0(^的卩八-mPEI/DOX和mPEI/DOX的培养液共培养4小时。之后倒掉培养液，先用I 3BS洗3次，然后用戊二 醛固定，再用PBS溶液洗3次，最后用Hoescht 33342(-种染细胞核的染料)染色。然后用63 倍的油镜观察实验结果。附图6结果显示经FA-mPEI/DOX处理过的HeLa细胞比经mPEI/DOX处 理过的HeLa细胞表现出更强的FI介导的绿色荧光和DOX介导的红色荧光。说明本发明制备 的FA-mPEI/DOX能够有效靶向识别高叶酸受体表达的癌细胞，其结果与流式细胞仪数据相 一致。
[0044] (8)体外抗肿瘤效果评价
[0045] 将每孔8000HeLa细胞种植于96孔板中，加入含有不同浓度的FA-mPEI/DOX和mPEI/ DOX的培养液共培养4小时。之后倒掉旧培养基更换新培养基再培养48小时。用CCK-8试剂处 理3h后，在酶标仪上检测各孔在λ = 450ηπι处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以 生理盐水处理的细胞作为空白对照，细胞活力记为100%。附图7和8说明，在相同的DOX浓度 下，经FA-mPEI/DOX处理过的HeLa细胞，其细胞毒性明显比经mPEI/DOX处理过的要强，尤其 是在高浓度下。说明本发明制备的FA-mPEI/DOX具有良好的体外靶向抗肿瘤效果。
[0046] (9)体内抗肿瘤效果评价
[0047] 所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周雌性BALB/c裸 鼠购自上海斯莱克实验动物中心（中国，上海）。按照3X IO6HeLa细胞八鼠的剂量在裸鼠右背 部注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到0.5-1.2cm3(大约在注射肿瘤细胞三周后)时随机将成瘤 裸鼠分为4组(每组裸鼠数量n = 6)。此时记作实验开始的第0天，将IOOyL生理盐水(NS)、纯 D0X、FA_mPEI/D0X，或者mPEI/DOX的生理盐水溶液(D0X的最终浓度为lmg/mL)通过尾静脉注 射到各组裸鼠体内。每3天给药一次，总共给药6次。肿瘤体积每3天测量一次，小鼠质量每3 天称一次。同时，长期观察以记录每组裸鼠的存活时间。肿瘤体积，相对肿瘤体积，以及相对 体重可以用下面的公式（1)-(3)分别计算。
[0048] 肿瘤体积（V)=aXb2/2 (1)
[0049] a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
[0050] 相对肿瘤体积= v/Vo (2)
[0051 ] V和Vo分别代表给药后的肿瘤体积和给药前的肿瘤体积。
[0052] 相对体重=m/m〇 (3)
[0053] m和mo分别代表给药后的小鼠的体重和给药前的小鼠体重。
[0054] 在给药治疗21天后，每组选出一只代表性的小鼠，将其处死取其主要器官和肿瘤， 用H&E和TUNEL染色观察小鼠在经21天的治疗后对器官的影响，和肿瘤坏死情况进行分析。 附图9说明，本发明制备的FA-mPEI/DOX组小鼠相对肿瘤体积变化最小，非靶向mPEI/DOX组 小鼠次之，纯DOX组再次之，生理盐水组小鼠相对肿瘤体积变化最大。但是，每组小鼠在经过 21天的治疗后期重量无明显变化。给药观察87天后，生理盐水组小鼠全部死亡，纯DOX组的 生存率仅为40%，非靶向mPEI/DOX组的生存率为60%，靶向FA-mTOI/DOX组的生存率为 80 %。H&E染色实验发现，纯DOX对小鼠的心有一定的损伤，其他组对小鼠器官未发现明显损 伤。肿瘤部位的H&E和TUNEL染色实验发现，FA-mPEI/DOX组造成肿瘤部位大量坏死，非靶向 mPEI/DOX组次之，纯DOX再次之，生理盐水组未明显造成肿瘤坏死(参见附图10)。综上所述， 本发明制备的FA-mPEI/DOX具有良好的体内抗肿瘤活性和生物相容性。
[0055] 有益效果
[0056] (1)本发明的FA-MPEI/DOX载药纳米颗粒具有良好的水溶性和生物相容性，较好的 药物缓释效果与pH响应性释放特性，对高叶酸受体表达的肿瘤细胞具有靶向性和明显的抑 制效果，可用于癌细胞的靶向化疗；
[0057] (2)本发明采用价廉易得的PEI为基础载体，FA为靶向试剂，降低了材料的成本，对 生物体无不良影响；
[0058] (3)本发明制备方法简单，反应条件温和，成本低廉，易于操作，具有产业化实施的 前景。
【附图说明】
[0059]图1为本发明制备的FA-mPEI/DOX合成示意图；
[0060]图2为FA-PEG-COOH(a),PEI-mPEG(b)，PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)(c)和FA-mPEI(PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA，d)的核磁共振氢谱图，（e)为FA-mPEI的结构示意图；
[0061 ]图3为不同样品的紫外吸收光谱图（a )，和体外不同pH条件下DOX从FA-mPE I /DOX中 的累积释放曲线(b);
[0062] 图4为经FA-mPEI、D0X和FA-mPEI/DOX处理24小时后的HeLa细胞活力柱状分析图；
[0063] 图5为经不同DOX浓度下FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理4小时后的HeLa细胞流式检 测分析图，右下角为经不同DOX浓度下FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理4小时后的HeLa细胞的 荧光强度与DOX的浓度之间的柱状图（***p〈0.001);
[0064] 图6为经FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理4小时后的HeLa细胞激光共聚焦显微镜成像 图，其中材料DOX浓度为10yg/mL(标尺为20μπι);
[0065] 图7为经FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理4小时后，分别用新培养液培养48小时的细 胞活力柱状分析图（**p〈〇 · 005，***p〈0 · 001);
[0066] 图8为经FA-mPEI/DOX和mPEI/D0X(D0X的浓度为10yg/mL)处理4小时后，分别用新 培养液培养48小时的细胞形貌图，其中图a、b为放大100倍的细胞形貌图，图c、d为放大200 倍的细胞形貌图（标尺均为IOOym);
[0067] 图9为体内抗肿瘤效果；（a)为经21天不同药物治疗后小鼠相对体积变化图，（b)为 药物治疗结束后一周选出的代表性小鼠的拍照图，（c)为不同药物治疗后的小鼠生存率， (d)为小鼠经21天不同药物治疗后体重变化图；
[0068] 图10为药物治疗结束后一周选出的代表性小鼠，然后将其处死，其主要器官和肿 瘤的H&E染色图（a为NS组，b为纯DOX组，c为mPEI/DOX组，d为FA-mPEI/DOX组），和肿瘤的 TUNEL染色图（e为NS组，f为纯DOX组，g为mPEI/DOX组，h为FA-mPEI/DOX组），图中的标尺均为 200μηι 〇
【具体实施方式】
[0069] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。
[0070] 实施例1
[0071] (I )ΡΕΙ溶液（25 · Omg，5mL DMS0)中逐滴加入EDC/NHS活化后的mPEG-⑶OH溶液 (40mg，IOmL DMS0)，搅拌反应72h，先用PBS溶液透析一天，再用水透析2天，冷冻干燥，得到 白色粉末，标记为PEI-mPEG。
[0072] (2)在NH2-PEG-⑶OH溶液（20 . Omg，5mL DMSO)中加入EDC/NHS活化后的FA溶液 (IImg，IOmL DMSO)，搅拌反应72h，先用PBS溶液透析一天，再用水透析2天，冷冻干燥，得到 浅黄色粉末，标记为FA-PEG-C00H。
[0073] (3)在上述PEI-mPEG溶液（11. Omg，5mL DMSO)中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-⑶0H(4 · 64mg，5mL DMSO)搅拌反应48h，再逐滴加入FI (0 · 39mg，2mLDMS0)，搅拌反应 24h，再加入三乙胺（63.6yL)反应30min后加入醋酸酐（53. OyL)反应24h。反应液先用I3BS溶 液透析一天，再用水透析2天，冷冻干燥，得到黄色粉末，标记为PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA) (简写为FA-mPEI)。
[0074] (4)将盐酸阿霉素 DOX · HCl(5.88mg)溶于500yL甲醇溶液中，后加入50yL的三乙 胺，逐滴加入到FA-mPEI水溶液（IOOmg，3mL)，敞口搅拌12小时，8000转离心10min，取上清液 冷冻干燥得到FA靶向的多功能超支化PEI负载DOX的纳米药物缓释体系FA-mPEI/DOX。
[0075] 参见说明书附图2，6 · 5、7 · 5和8 · 5ppm是FA的特征质子峰，3 · 4-3 · 6ppm是PEG的结构 单元的亚甲基质子峰，根据它们积分面积之比，计算出每个PEG上链接了0.73个FA分子。同 样地，每个PEI (δ，2.2-3.4ppm)分子链接24.2个PEG，5.8个FA分子，和4.5个FI分子(参见附 图2)。制备的PEI-FI -mPEG- (PEG-FA)经过乙酰化反应之后，在1.9-2.1 ppm之间出现两个峰， 位于1.9ppm是二级酰胺的乙酰基的甲基质子峰，2.05ppm是三级酰胺的乙酰基的甲基质子 峰(参见附图2d)。通常认为伯胺比仲胺更易乙酰化，基于部分仲胺已发生乙酰化，所以PEI 表面伯胺已全部被乙酰。另外，乙酰化后的FA-mPEI的表面电势为1.33mV，基本显中性，也证 实了PEI表面氨基全部被乙酰(参加表1)。另外FA的紫外吸收峰位于290nm左右，FI的紫外吸 收峰位于495nm左右（参见附图3a )，这些特征峰的出现说明我们成功制备FA-PEG-C00H， PEI-Ac-FI-mPEG-(PEG-FA)，和PEI-Ac-FI-mPEG。
[0076]载药之后，在480nm处的吸收峰增强明显。说明我们成功包裹了DOX，制备了FA-mPEI/DOX纳米药物缓释体系，其DOX的上载效率为69%，上载百分比为6.1 %。
[0077]表1.不同样品水溶液的表面电势和水合粒径
[0079] 实施例2
[0080] 将实施例1制备的FA-mPEI/DOX分别用pH=7.0和pH = 5.4的缓冲液溶解成浓度为 lmg/mL的溶液，取ImL放入透析袋中固定，置于含有9mL不同pH的缓冲液的容器中，放在37 °C 摇床中振荡。在不同的时间点取样。每次取透析袋外液体ImL，测量其在480nm处吸光度值， 再向透析袋外加入对应的缓冲溶液lmL。用此方法得到体外不同pH条件下DOX从FA-mPEI/ DOX中释放的释放曲线。参见附图3b，在50小时中，DOX在弱酸性环境中（pH=5.0)的释放量 为51 %，比在生理环境(pH = 7.4)中的31.5%要大。说明这种载药体系具有一定的pH响应 性，在肿瘤组织类似的弱酸性环境中的释放速度比正常组织释放速度快，一定程度减少DOX 对正常组织的毒性，提高对肿瘤细胞恶性增殖的抑制效果。
[0081 ] 实施例3
[0082] 将每孔8000个HeLa细胞种植于96孔板中培养过夜。倒掉原培养基，加入含不同材 料(FA-mPEI，FA-mPEI/D0X和纯D0X)的培养液再共培养24小时。倒掉培养液，用PBS洗2遍，加 入含CCK-8试剂的培养液(每孔20yL CCK-8试剂，180yL完全培养液)再孵育3h。之后用酶标 仪上检测各孔在λ = 450ηπι处的吸光值，并据此计算相应的细胞活力，其中以生理盐水处理 的细胞作为空白对照，细胞活力记为100%。附图4结果显示，与空白对照组相比，经载体材 料FA-mPEI处理的实验组细胞活性均在80 %以上，说明载体材料FA-mPEI没有明显的细胞毒 性;制备的FA-mPEI/DOX和纯DOX都具有明显的细胞毒性，其半数致死量(IC 5q)分别为5. Oyg/ mL和1.9yg/mL。可能的原因是，DOX是小分子易于快速穿透细胞膜，造成细胞损伤，而在纳米 药物缓释体系中DOX是缓慢从FA-mPEI/DOX释放出来的，因而在相同时间点下其药学活性较 低。
[0083] 实施例4
[0084] 将每孔2\105此1^细胞种植于12孔板中，加入含有不同浓度的？六-1111^1/00父和 mPEI/D0X(D0X的浓度为0-10yg/mL)的培养液共培养4小时。之后倒掉培养液，经I3BS洗3次， 用胰酶将细胞消化下来，转移到5ml离心管中，1000转离心5分钟去除上清液，加 PBS Iml吹 匀，放入冰盒，用流式细胞仪对经FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX处理过的HeLa细胞的进行荧光检 测。附图5结果显示在不同的DOX浓度条件下，经FA-mPEI/DOX处理过HeLa细胞比经mPEI/DOX 处理过的HeLa细胞表现出更强的荧光信号。说明通过FA介导的靶向能力，本发明制备的FA-mPEI/DOX 能够有效靶向高叶酸受体表达的细胞。
[0085] 实施例5
[0086] 将大小合适的处理过的圆形盖玻片以每孔1片的密度放入12孔板中，每孔加入 1.0 mL培养液浸泡过夜。弃掉浸泡培养液后，收集对数生长期HeLa细胞，按照5 X IO4Cel Is/ 孔接种在圆形载玻片上，置于5%C02,37°C条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换900 yL培养液，并添加 IOOyL含FA-mPEI/DOX和mPEI/DOX的培养液共培养4小时。之后倒掉培养 液，先用PBS洗3次，然后每孔加2.5%戊二醛的I 3BS溶液800yL，静置于4°C条件下固定30分 钟。弃掉戊二醛溶液，用无菌I3BS洗1-2遍，加 Hoechst 33342(lμg/ml)，覆盖细胞即可，静置 于37°C染色15分钟。将Hoechst 33342液吸出，用无菌I3BS洗3遍，在载玻片上滴加一滴荧光 封闭剂，将盖玻片从12孔板中勾出，将有细胞的一面压到载玻片上，用激光扫描共焦显微镜 观察细胞形态及细胞内荧光分布。参见附图6,发现经FA-mTOI/DOX处理过HeLa细胞比经 mPEI/DOX处理过的HeLa细胞表现出较强的FI介导的绿色荧光和DOX介导的红色荧光。说明 本发明制备的材料能够靶向识别高叶酸受体表达的细胞，其结果与流式细胞仪数据相一 致。
[0087] 实施例6
[0088]收集对数生长期HeLa细胞，按8000ce 11 s/孔接种在96孔细胞培养板上，置于5 % ⑶2，37°C条件下培养24小时。弃掉培养液后，每孔更换180yL培养液，并加20yL FA-mPEI/ DOX或mPEI/DOX，每组设6个平行样。继续置于5 % CO2，37 °C条件下培养4小时。弃掉培养液， 更换新的不含材料的培养液，将细胞培养板继续放置在5%C02,37°C条件下分别培养24小 时和48小时。然后加入含CCK-8试剂的培养液(每孔20yL CCK-8试剂，180yL完全培养液)再 孵育3h。之后用酶标仪上检测各孔在λ = 450ηπι处的吸光值，并根据此值计算细胞的存活率。 参见附图7和8，我们发现在相同的DOX浓度下，经FA-mPEI/DOX处理过的细胞，其细胞毒性明 显比经mPE I /DOX处理过的要强，尤其是在高浓度下。说明本发明制备的FA-mPE I /DOX具有良 好的体外靶向治疗效果。
[0089] 实施例7
[0090] 所有动物实验均严格按照动物保护协会标准进行。实验用的4-6周雌性BALB/c裸 鼠购自上海斯莱克实验动物中心（中国，上海）。按照3X IO6HeLa细胞八鼠的剂量在裸鼠右背 部注射肿瘤细胞。在肿瘤体积达到0.5-1.2cm3(大约在注射肿瘤细胞三周后)时随机将成瘤 裸鼠分为4组(每组裸鼠数量n = 6)。此时记作实验开始的第0天，将IOOyL生理盐水(NS)、纯 D0X、FA_mPEI/D0X，或者mPEI/DOX的生理盐水溶液(D0X的最终浓度为lmg/mL)通过尾静脉注 射到各组裸鼠体内。每3天给药一次，总共给药6次。肿瘤体积每3天测量一次，小鼠质量每3 天称一次。同时，长期观察以记录每组裸鼠的存活时间。肿瘤体积，相对肿瘤体积，以及相对 体重可以用下面的公式（1)-(3)分别计算。
[0091] 肿瘤体积（V)=aXb2/2 (1)
[0092] a和b分别代表肿瘤直径的最大值和最小值。
[0093] 相对肿瘤体积= v/Vo (2)
[0094] V和Vo分别代表给药后的肿瘤体积，给药前的肿瘤体积。
[0095] 相对体重=m/m〇 (3)
[0096] m和mo分别代表给药后的小鼠的体重和给药前的小鼠体重。
[0097] 在给药治疗21天后，每组选出一只代表性的小鼠，将其处死取其主要器官和肿瘤， 用H&E和TUNEL染色观察小鼠在经21天的治疗后对器官的影响，和肿瘤坏死情况进行分析。 参见附图9,我们发现本发明制备的FA-mPEI/DOX组小鼠相对肿瘤体积变化最小，非靶向 mPEI /DOX组小鼠次之，纯DOX组再次之，生理盐水组小鼠相对肿瘤体积变化最大。但是，每组 小鼠在经过21天的治疗后期重量无明显变化。给药观察87天后，生理盐水组小鼠全部死亡， 纯DOX组的生存率仅为40%，非靶向mPEI/DOX组的生存率为60%，靶向FA-mPEI/DOX组的生 存率为80 %。参见附图10，H&E染色实验说明纯DOX对小鼠的心有一定的损伤，其他组对小鼠 器官未发现明显损伤。肿瘤部位的H&E和TUNEL染色实验发现，FA-mPEI/DOX组造成肿瘤部位 大量坏死，非靶向mPEI/DOX组次之，纯DOX再次之，生理盐水组未明显造成肿瘤坏死。综上所 述，本发明制备的FA-mPEI/DOX具有良好的体内抗肿瘤活性和生物相容性。
【主权项】
1. 一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方法，包括： (1) 在超支化聚乙烯亚胺PEI溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液，搅拌反 应60-80h，透析，冷冻干燥，得到PEI-mPEG;其中EDC与mPEG-COOH的摩尔比为8-12:1; NHS与 mPEG-C00H的摩尔比为8-12:l;mPEG-C00H与PEI的摩尔比为15-25:l; (2) 将EDC/NHS活化后的叶酸FA溶液加入NH2-PEG-C00H溶液中，搅拌反应60-80h，透析， 冷冻干燥，得到FA-PEG-C00H;其中EDC与NH2-PEG-⑶0H的摩尔比为1.5-2.1:1; NHS与NH2-PEG-C00H 的摩尔比为1 · 5-2 · 1:1 ;FA 与 NH2-PEG-C00H 的摩尔比为 2 · 2-2 · 8:1; (3) 将PEI-mPEG溶液中逐滴加入EDC/NHS活化后的FA-PEG-C00H溶液，搅拌反应60-80h， 再逐滴加入异硫氰酸荧光素 FI溶液，搅拌反应20-30h，透析，冷冻干燥，得到PEI-FI-mPEG-(PEG-FA);其中EDC与FA-PEG-C00H摩尔比为8-12:1 ;NHS与FA-PEG-C00H的摩尔比为8-12:1; FA-PEG-C00H 与 PEI-mPEG 的摩尔比为 8-12:1 ;FI 与 PEI-mPEG 的摩尔比为 5-7:1; (4) 将PEI-FI-mPEG-(PEG-FA)的水溶液中加入三乙胺，搅拌20-40min，再加入乙酸酐， 继续搅拌20_30h，透析，冷冻干燥，得到FA靶向的多功能PEI，标记为FA-mPEI;其中三乙胺与 PEI的摩尔比为2800-3500:1;乙酸酐与PEI的摩尔比为2500-3000:1; (5) 将盐酸阿霉素 D0X · HC1溶于甲醇溶液中，加入三乙胺，然后逐滴加入到FA-mPEI水 溶液，避光敞口搅拌12-24小时，离心，冷冻干燥，得到叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺 负载阿霉素的药物缓释体系FA-mPEI/DOX;其中FA-mPEI与盐酸阿霉素 D0X · HC1的摩尔比为 1:8-20;其中三乙胺与甲醇的体积比为1:30-80。2. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:步骤(1)-(3)中溶液中的溶剂均为二甲基亚砜DMS0。3. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:所述步骤（1)中超支化聚乙烯亚胺PEI的分子量为25000g/mol;mPEG-C00H 的分子量为2000g/mol。4. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:步骤（1)中PEI溶液的浓度为3-7mg/mL，EDC/NHS活化后的mPEG-COOH溶液的 浓度为2_6mg/mL，EDC的溶液浓度为5-8mg/mL，NHS溶液的浓度为3-6mg/mL。5. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:步骤(2)中NH2-PEG-C00H的溶液浓度为3-6mg/mL，EDC溶液的浓度为l-5mg/ mL，NHS溶液的浓度为1 -5mg/mL，EDC/NHS活化后的叶酸FA溶液的浓度为1 -3mg/mL。6. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于：所述步骤（2)中透析为：透析膜为纤维素透析膜，其截留分子量MCW0为 2000,先在磷酸缓冲溶液PBS中透析ld，再在去离子水中透析2d。7. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于：所述步骤（3)中PEI-mPEG溶液的浓度为2-5mg/mL，EDC/NHS活化后的FA-PEG-⑶0H溶液的浓度为0.5-lmg/mL，FI溶液的浓度为0.1-0.3mg/mL，EDC溶液的浓度为2-5mg/mL，NHS 溶液的浓度为 2-5mg/mL。8. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:所述步骤（1)、（3)、（4)中透析为:透析膜为纤维素透析膜，其MCW0 = 8000-14000,先在PBS透析ld，再在去离子水中透析2d。9. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于：步骤(5)中DOX · HC1溶液的浓度为8-12mg/mL，FA-mPEI溶液的浓度为30-40mg/mL〇10. 根据权利要求1所述的一种叶酸靶向的多功能超支化聚乙烯亚胺负载阿霉素的方 法，其特征在于:所述步骤(5)中搅拌为磁力搅拌，搅拌速度为100-150转/分钟;离心的速率 为8000-10000转/分钟，时间为8-10分钟。
【文档编号】A61K47/22GK106075459SQ201610420925
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610420925.0, CN 106075459 A, CN 106075459A, CN 201610420925, CN-A-106075459, CN106075459 A, CN106075459A, CN201610420925, CN201610420925.0
【发明人】史向阳, 周本青, 赵晋华, 赵凌舟
【申请人】东华大学, 上海市第一人民医院