专利名称：基于聚乙烯亚胺的生物分子阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物分子阵列，并且更具体地涉及通过覆盖在基质上的聚乙烯亚胺层排列的具有分开的含生物分子单元的阵列。
背景技术：
在分子生物学和微生物学领域中，长期以来使用含有固定于其上的生物分子的固体支持物是常见的。固定提供各种优点，例如允许大量样品并且容易测定大量信号系统中所用的标记。例如有很多关于将核酸多聚物与珠粒结合的文献。
一种这样的方法是使用链霉抗生物素蛋白包被的磁珠，这种磁珠可从例如Dynal of Oslo，Norway商业购买。这些珠粒与末端标记的生物素化的核苷酸接触。众所周知生物素与链霉抗生物素蛋白以非共价但高度稳定的方式相互作用，这对于许多目的与共价结合功能相同。因此，寡核苷酸可以通过此生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用固定在珠粒上。
另一方法依赖于碳二亚胺化学法。在此基本方法上有一些变化。例如，正如例如Kremsky，J.N.等，核酸研究152891-2909，1987中所述的，酰肼包被的珠粒通过碳二亚胺催化的偶联与羧基修饰的寡核苷酸连接。另一在此方法上的变化使用表面覆盖有羧基的可控制的有孔玻璃或磁性聚苯乙烯珠，羧基与氨基修饰的寡核苷酸反应，如例如Ghosh，S.S.等，核酸研究155353-5372，1987和Lund V.等，核酸研究1610861-10880，1987中所述。
另一方法使用聚乙烯亚胺(PEI)层包裹珠粒。见例如，Wasserman，B.P.等，生物技术和生物工程XXII271-287，1980；Povey，A.C.等，制药科学杂志75831-837，1986；Rounds，M.A.J.Chrom.362187-196，1986；Van Ness，J.等，核酸研究193345-3350，1991和PCT国际公开WO94/00600。而且，PEI已用于在大量各种非珠粒固定支持物和表面上固定各种分子包括核酸多聚物。见例如，Schurer，J.W.等，组织化学和细胞化学杂志25384-387，1977；Alpert，A.J.等，J.Chrom.185375-392，1979；Vanecek，G.等，生物化学年鉴121156-169，1982；El Rassi，Z.等，Chromatographia 199-18，1984；Rounds，M.A.J.Chrom.362187-196，1986；Swann、W.E.等的欧洲专利申请No.0,197,784 A1，1986；D’Souza，S.F.生物技术通讯8643-648，1986；Povey，A.C.等，制药科学杂志76201-207，1987；Ngo，T.T.等的美国专利4,753,983，1988；Crane，L.J.等的欧洲专利申请No.0,403,700 A1，1990；Trinh.C.K.Die Angewandte Makromol.Chemie 212167-179，1993；Bruil，A.等，J.Biomed.Mat.Res.271253-1268，1993；PCT国际公开No.WO95/02184。确实，已报道PEI在无固定支持物的情况下结合寡核苷酸。
最近，大量注意力集中在制备平坦固定支持物上的生物分子，特别是多核苷酸的阵列。只是作为例证的以下公开文献(以及本文引用的参考文献)提供这些生物分子阵列以及制备这些排列的方法的总体和具体综述Eggers，M.D.等，DNA测序技术进展卷SPIE 1891113-126，1993；Chetverin，A.B.等，生物/技术121093-1099，1994；Southern，E.M.核酸研究221368-1373，1994；Lipshutz，R.J.等，生物技术19442-447，1995；Schena，M.BioEssays 18427-431，1996；Blanchard，A.P.等，生物传感器及生物电学11687-690，1996；O’Donnell-Maloney，M.J.等，遗传分析生物分子工程13151-157，1996；Regalado，A.Start-Up24-30，1996年10月和Stipp，D.财富30-41页，1997年3月31日。
已发展的关于将生物分子固定到珠粒和其它固定支持物上的专门技术中，很多报道的制备这些阵列的方法已有描述。有些令人惊讶地，至今还没有使用PEI以阵列模式固定生物分子的报道。最多，作为理论上的可能性，已提出PEI可用于使寡核苷酸与尼龙支持物连接。见例如，PCT国际公开No.WO 95/09248，引用Van Ness，J.等，核酸研究193345-3350，1991。
如此处公开的，本发明人已认识到与制备基于PEI的寡核苷酸阵列相关的问题，并且已解决了这些问题，因此目前基于PEI的阵列已不再是理论上的可能性。而且，与也在此处公开的其它类型阵列相比，本发明的基于PEI的阵列提供各种优点。
发明概述本发明提供一种生物分子阵列，包括包含表面的固体基质；所述表面至少部分覆盖有一层(聚乙烯亚胺)(PEI)；所述涂层包括多个由第二区环绕并与其邻接的分开的第一区；所述第一区有生物分子和PEI；并且所述第二区有PEI并且基本上没有生物分子。
如此处所用的，第一区也称为点样区，因为在某种意义上生物分子上样到第一区内的PEI上。也如此处所用的，第二区也称为间隔区或邻接的间隔区，因为实际上间隔区作用为点样区反应生物分子之间的非反应性间隔。
在另一方面，本发明提供一种制备生物分子阵列的方法。此方法包括提供包含表面的固体基质，其中聚(乙烯亚胺)(PEI)层覆盖所述表面的至少一部分，所述涂层包括多个由连续的第二区环绕并与其邻接的分开的第一区；将生物分子上样到所述的第一区而保持所述的第二区基本上不含生物分子。
参照附图和下面详细的描述，本发明的其它方面将变得显而易见。
附图描述
图1A是根据本发明实施方案所述的阵列的俯视平面示意图。
图1B是图1A的阵列的剖面示意图。
图2A是用于制备本发明阵列的移液装置的等轴视图。
图2B是根据本发明所述的移液头的实施方案的放大正面立视图。
图3是带有锥形设计的另一种移液头的正面立视图。
图4A是根据本发明另一实施方案所述的带有凹槽、锥形设计的移液头的另一实施方案的正面立视图。
图4B是图4A的移液头的仰视平面图。
图5表示根据本发明制备并用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，California)显色且用CCD相机和显微镜拍摄的微点阵列。
图6表示同时存在于单一阵列单元中的两种不同寡核苷酸如何根据本发明得到鉴定和部分定量测定。
图7表示用本发明方法学由机器人制备的阵列的CCD相机图像，其中点区域直径约100-150微米，相邻点与点之间中心到中心的间距为200微米。直径的标准偏差是约15％。
图8是用荧光滤镜在荧光下摄制的显微照片，显示从分析溶液转移的非媒介物成分(在此情况下是荧光微球体)的可重复点样(通过肉眼观察测定)。
发明详述本发明提供一种生物分子阵列。阵列包括包含表面(优选地是平的)的固体基质，其中表面至少部分覆盖有一层聚(乙烯亚胺)(PEI)。PEI层包括多个由连续第二区环绕并与其邻接的分开的第一区。第一区有生物分子和PEI，而第二区有PEI并且基本上没有生物分子，即每2000μm2第二区少于约103个生物分子。
图1A是根据本发明实施方案所述的生物分子阵列10的俯视平面示意图，而图1B是其剖面示意图。阵列10具有带平坦表面22的固体基底或支持物基质20，并且阵列10有覆盖支持物基质20的至少一部分的表层30。表层30优选地由PEI构成，并且底层20优选地由坚固材料制成，PEI与底层20共价结合。PEI层30有多个点样区32(例如图1A中所示的12个)位于邻接间隔区34之中。每个点样区32是分开的分离的区域，其特征是生物分子物质40点样在PEI层上，而间隔区的特征是PEI层30的剩余区域。例如，每个点样区30可以具有从表层30的表面向表层30内伸入中等深度“d”的截短的圆锥形状。如下面详细描述的，生物分子40扩散到PEI层30构造中并与PEI层30内的反应性胺位点共价结合。
PEI层30、点样区32和点样区32之间的间隔的规格一般根据特定应用变化。PEI层30的厚度“T”例如可以小到PEI分子的单层。另外，PEI层30表面的点样区一般直径约10-100μm，而点样区32之间的中心到中心距离“D”一般在100μm-1,000um之间。在优选实施方案中，点样区32的表面直径约50μm，并且点样区32由约200μM的中心到中心距离D间隔开。固体基质基质优选地是玻璃或硅。然而，基质选择性地可以是石英、金、合成的有机聚合物如聚乙烯、聚酯薄膜和6，6-尼龙或它们的复合材料。在优选实施方案，基质由分布在平坦表面的加样孔或其它凹槽构成。基质可以具有非渗透材料的表面形态或者它可以是渗透的如尼龙。基质可以是膜或胶片(例如聚酯薄膜或金)。基本上可以使用任何允许被含有PEI但不含生物分子的区域包围的含PEI和生物分子的区域形成和保留的固体基质。
用于此目的的固体支持物实例是一般用于电子工业中构建半导体的硅片。这些硅片在一侧是高度磨光和反光的并且可容易地使用硅烷化学法用聚乙烯亚胺涂敷。这些硅片在商业上可从诸如WaferNet(San Jose，CA)的公司得到。玻片也可以用反光性涂层涂敷。具有反光性涂层的玻片也可容易地使用硅烷化学法用聚乙烯亚胺涂敷。
聚乙烯亚胺多聚物涂层允许使用商业上可得到的交联剂(Pierce，Rockford，IL)将寡核苷酸、PCR片段或扩增子、DNA分子或片段或其它含有胺基的生物分子共价结合到固体支持物上。聚乙烯亚胺(PEI)涂敷的载片也具有长保存期稳定性的额外好处。PEI涂层的制备用于将PEI层附着到基质上的化学方法大部分取决于基质的化学特征。现有技术提供大量可以将PEI附着到固定支持物上的适当化学方法实例。例如当基质是6，6-尼龙时，PEI涂层可以用Van Ness，J等，核酸研究193345-3350，1991和PCT国际公开WO 94/00600中公开的方法涂敷，这两篇参考文献在此引用作为参考。当固体支持物是玻璃或硅时，涂敷PEI的适当方法见例如Wasserman，B.P.生物化学和生物工程XXII271-287，1980和D’Souia，S.F.生物技术通讯8643-648，1986。
优选地，PEI涂层与固定支持物共价结合。当固定支持物是玻璃或硅时，PEI涂层可以使用硅烷化学法与基质共价结合。例如，具有反应性甲硅烷氧基末端基团的PEI可从Gelest，Inc(Tullytown，PA)商业购买。可以将这样的反应性PEI与玻片或硅片接触，轻微搅拌后，PEI将附着在基质上。选择性地，可以使用双功能甲硅烷基化试剂。根据此方法，玻璃或硅基质用双功能甲硅烷基化试剂处理以提供具反应性表面的基质。然后将PEI与反应性表面接触并通过双功能试剂与表面共价结合。
PEI涂层已广泛用于结合生物分子的领域。由于各种原因，PEI在此情况下非常有效。例如，PEI是高度亲水的并且浸润含有生物分子的水溶液。另外，PEI含有许多氨基，这些氨基可以与生物分子中的酸性基团形成盐。然而，从PEI接受生物分子水溶液的容易程度可以确切地看到为什么至今它还未用于制备生物分子阵列。当将生物分子水溶液点样到PEI层上时，溶液迅速吸入PEI涂层而不是留在分开的区域中。因为溶液吸收，以阵列模式上样的溶液完全汇合在一起并形成单一反应性区域，这显然是在生物分子阵列制备中要避免的情况。布列溶液本发明人也公开了如何用PEI涂层制备生物分子阵列。本发明方法使用一种也称为“布列溶液”的组合物，包含基于组合物总体积约35体积％到约80体积％浓度的增稠剂、生物分子(优选地是0.001μg/mL到10μg/mL浓度范围的寡核苷酸)和水。令人吃惊地发现在水性寡核苷酸组合物中含有增稠剂时，增稠剂赋予组合物所需的流变学特性，因此使组合物能与此处公开的改进的弹性探头一起使用，在仅一次从组合物池汲取组合物的情况下将多个均匀的微滴移至有PEI涂层的平坦表面上。
对于液体增稠剂如甘油，浓度为35％V/V到80％V/V。组合物中优选的增稠剂浓度在一定程度上取决于进行排列时的温度。排列温度越低，需要使用的增稠剂浓度越低。温度和粘度控制的组合使得可以在大多数固体支持物(例如玻璃、硅片、尼龙6/6、尼龙膜等)上进行排列。
增稠剂的存在还有其它好处，即允许各种其它低浓度物质与生物分子同时存在。例如，0.001％V/V到1％V/V的去污剂可存在于布列溶液中。这是有用的，因为PCR缓冲液含有少量的Tween-20或NP-40，并且直接从PCR排列核酸样品而无须事先纯化扩增子通常是有利的。使用增稠剂允许在布列溶液中含有盐(例如NaCl，KCl或MgCl2)、缓冲液(例如Tris)和/或螯合剂(例如EDTA)。使用增稠剂还有其它好处，即允许交联剂和/或有机溶剂存在于布列溶液中。正如商业上得到的，交联剂通常溶解于有机溶剂如DMSO、DMF、NMP、甲醇、乙醇等溶剂中。当使用增稠剂时，常用的有机溶剂可以0.05％到20％(V/V)的水平用于本发明的布列溶液中。
一般来说，增稠剂赋予布列溶液增加的粘度。当布列溶液中达到适当粘度时，点样的第一滴基本上与例如第100滴大小相同。当布列溶液中使用不适当粘度时，点样的头几滴显著大于后来点样的液滴。所需的粘度在纯水与纯甘油的粘度之间。
本发明的布列溶液可用于将微滴点样到几乎任何表面上。因为固体支持物的表面特性对微滴的点样几乎没有影响或没有影响，所以生物样品可排列到几乎任何类型的有涂层表面或有聚合物涂层的固体支持物上。例如，一般的水溶液在用亲水性聚合物如聚(赖氨酸)或聚(乙烯亚胺)涂敷的固体支持物上倾向于迅速扩散而这些相同溶液不容易点样在疏水性表面如硅片上。然而，含有根据本发明所述的增稠剂的布列溶液可用于将均匀的微滴点样于任何这些基质上。
在排列过程中包括增稠剂如甘油的另一重要好处是质量控制。例如当将甘油用于本文所述的排列方法时，将一小滴液体点样于固体支持物上。以此处所述的方法中常用的浓度时，此甘油浓度足以防止微滴的蒸发。因此，在化学处理阵列之前可检查每个排列针头的每个印迹。观察微滴的能力实质上增强了对排列过程进行质量控制的能力。这导致排列方法学价值的重要增加。
生物分子可以是核酸多聚物或其类似物如PNA、硫代磷酸酯和膦酸甲酯。核酸指核糖核酸和脱氧核糖核酸。生物分子可包括非天然和/或合成的碱基。生物分子可以是单链或双链核酸多聚物。
优选的生物分子是包括寡核苷酸(多达约100个核苷酸碱基)和多核苷酸(超过约100个碱基)的核酸多聚物。优选的核酸多聚物由15到50个核苷酸碱基形成。另一优选的核酸多聚物有50到1,000个核苷酸碱基。核酸多聚物可以是PCR产物、PCR引物或核酸双链，在此列出几个实施例。然而，如下文所述，当核酸含有伯胺时，基本上所有核酸类型可与PEI涂敷的表面共价结合。布列溶液中核酸多聚物的一般浓度为0.001-10μg/mL、优选地0.01-1μg/mL、更优选地0.05-0.5μg/mL。
优选的核酸多聚物为“胺修饰的”，因为它们经修饰在核酸多聚物的5’末端含有伯胺基，优选地在核酸多聚物的伯胺与核酸部分之间有一个或多个亚甲基。6是亚甲基的优选数目。胺修饰的核酸多聚物是优选的，因为它们可通过5’-胺基与固体支持物共价连接。可使用5’-己胺修饰的PCR引物排列PCR产物。可在使用胺烯丙基-dUTP(Sigma，St.Louis，MO)通过切口移位导入胺之后排列核酸双链。用氨基烯丙基-dUTP通过聚合酶如末端转移酶或用连接酶通过将含胺的短核酸多聚物连接到核酸上可将胺导入核酸中。
优选地，在与PEI涂层接触之前活化核酸多聚物。通过使胺功能化的核酸多聚物与多功能胺-反应性化学物如三氯三嗪(Trichlorotriazine)混合可方便地实现这一点。当核酸多聚物含有5’-胺基时，5’-胺可与也称为氰尿酰氯的三氯三嗪反应(Van Ness等，核酸研究.19(2)3345-3350，1991)。优选地，将过量的氰尿酰氯加入核酸多聚物溶液中，其中超过布列溶液中核酸多聚物胺数10-到100-倍摩尔数过量的氰尿酰氯是优选的。在此方法中，大多数以胺终止的核酸多聚物与一分子三氯三嗪反应，因此核酸多聚物变成以二氯三嗪终止。
本发明的有利特征是含有生物分子的布列溶液即使含有大量的三氯三嗪也可点样到PEI涂层上。这提供了优于在进行排列之前需要从布列溶液去除偶联剂的方法的显著优势。
当核酸多聚物是双链时，本发明优选的实施方案提供两条链或其中一条链含有末端氨基。双链核酸多聚物可通过一个末端氨基结合到PEI涂层上，由此固定此双链多聚物。然而，因为两条链中仅有一条链与PEI涂层共价结合，所以另一链可在变性和洗涤条件下去除。此方法提供根据本发明实施单链核酸多聚物的排列的一种方便方法。双链核酸多聚物可例如作为PCR反应产物得到。
优选地，用常用缓冲液如磷酸钠、硼酸钠、碳酸钠或Tris HCl缓冲布列溶液。布列溶液的优选pH范围是7到9，其中优选的缓冲液是新鲜制备的pH8.3到pH8.5的硼酸钠溶液。
为了制备一般的布列溶液，将己胺修饰的核酸多聚物以0.1μg/ml置于0.2M硼酸钠pH8.3中至50μl总体积。然后加入10μl 15mg/mL的氰尿酰氯溶液，并且让反应于25℃持续搅拌下进行1小时。加入甘油(GibcoBrl，Grand Island，NY)至56％终浓度。印迹技术生物分子溶液可以通过大量目前用于微细加工的技术的任意一种上样到PEI涂层上。例如，溶液可以装入喷黑印迹头中并从这样的头部喷到涂层上。
图2A是表示用于选择性地将分离的、可控量生物分子溶液转移到阵列10的PEI层30上的优选装置和方法的等轴视图。在一种实施方案中，装置带有与致动器60可操作连接的弹性探头50和与弹性探头50相反端连接的移液头70。弹性探头50一般包括包住偏置部件54的套壳52和活塞56，活塞有与偏置部件54相邻接的第一端57和从套壳52中伸出的第二端58。套壳52可以是管状筒而偏置部件54可以是将活塞56的第二端58从套壳52推出的压缩弹簧。活塞56的第一端57因此带有与从套壳52向内放射状伸出的止动物59咬合的凸肩57a从而限制活塞56相对于套壳52的最大延伸量。适当的弹性探头50可从Evertt Charles(Pomona，California)，Interconnect Devices Inc.(Kansas City，Kansas)、TestConnections，Inc.，(Upland，California)以及其它制造商得到。
致动器60优选地沿着与阵列10垂直的轴线(箭头V所示)并在与PEI层30表面平行的平面(箭头P所示)移动弹性探头50。因此，致动器60控制弹性探头50从而将移液头70浸入含有生物分子流体90的容器80中，将弹性探头50定位到PEI层30的所需位点上，并且将移液头70压至PEI层30的所需位点上。在另一实施方案中，致动器60可能仅仅与至阵列10垂直地移动弹性探头50，而另一致动器(未显示)移动阵列10和容器80以将移液头70定位至容器80或PEI层30的所需位点。致动器60优选地是自动将生物分子溶液移至PEI层30上的机器人或其它计算机控制的操作装置。此外，可将多个弹性探头50与一个致动器连接以同时将多个生物分子物质移至PEI层30上。
移液头70优选地吸取足够量的生物分子流体90至其表面上以将多个的生物分子物质移至PEI层30上并形成相应的多个点样区32(图1A中所示)。图2B是根据本发明一个实施方案所述的移液头70的放大正面立视图。移液头70优选地具有截短的圆锥形状，带有端面72和多个凹槽或沟道74。端面72可以是从假想的交点73凹进的平面，凹进的距离“R”约在0.00001英寸和0.010英寸之间。并且更优选地约在0.001英寸和0.005英寸之间。此外，凹槽74具有以约15°到120°、并且更优选地以约60°到90°的角α向端面72聚集的翼或脊76。
弹性探头50、致动器60和移液头70一起运行从而在每次致动器60将移液头70压至PEI层30上时，将可控量的生物分子流体移至PEI层30上。致动器60开始将移液头70浸入生物分子流体90的容器80中以通过毛细作用汲取和容纳较大体积的生物分子流体92(图2B)到移液头70上。然后致动器60将弹性探头50定位至PEI层30上。在容器80中取出移液头70后，一部分移液头70上的生物分子流体92在移液头的端面72形成悬挂物94。然后致动器将移液头70压至PEI层上以从移液头70上的生物分子流体部分形成阵列10的单个分开离的点样区32(图1A和1B中所示)。致动器60优选地将移液头70压至PEI层30上以使移液头70以指定量的压力接触PEI层30。然而，用相同压力将移液头70连续压至PEI层30上是困难的，因为致动器60不能总是以相同高度定位移液头70并且PEI层70表面可能不一样平。偏置部件54因此储存把移液头70压到PEI层30上产生的能量，从而允许弹性探头50在每次移液时以基本上恒定的压力接触PEI层30而不论致动器60的行程或PEI层30表面状态的微小不规则性。
因此上述移液系统提供在每次移液头70与PEI层30接触时可移送恒定点样体积的生物分子流体的装置。应当理解应将精确、恒定体积的生物分子流体移至每个点样区的PEI层30上以在PEI层30中维持间隔区34。点样至点样区32上的PEI层30中的生物分子流体的量一般凭经验确定，并且它是移液头70与PEI层30接触的时间、生物分子流体90的粘度、移液头70的构造以及移液头70与PEI层30之间的压力的函数。因为偏置部件54在移液头70与PEI层30之间提供了基本上恒定的压力，所以影响移至PEI层30的生物分子流体量的首要因素是移液头70与PEI层30之间接触的时间。
图3是根据本发明所述的移液头170的另一个实施方案的正面立视图。在此实施方案中，移液头170具有无凹槽或翼片的截短的锥形状。因此，移液头170在其锥形部分的表面容纳生物分子流体。虽然移液头170可用于将生物分子流体移到PEI层30上，但是一般地使用带凹槽的移液头是更理想的，因为这样的移液头容纳更多的生物分子流体。
图4A是带有多个凹槽274和翼片276的移液头270的另一实施方案的正面立视图，图4B是其仰视平面图。移液头270基本上以与上述移液头70相同的方式操作，并且因此也提供基本上相同的优点。
上述的移液头70、170和270代表一些可用于将生物分子流体点样到PEI层30上的移液头实例。应当理解可对这些移液头进行多种改进，包括使用不同形状的端面设计。例如，根据具体应用，这些移液头可以具有角锥形、圆柱形、立方形或其它适当形状。此外，这些凹槽可以具有除了本发明附图中所示的构造之外的其它构造。因此，移液头不一定局限于图2B-4B中说明的那些种类。排列条件和排列后的处理如上所述的布列溶液可直接用于排列过程。也就是说，在排列核酸多聚物的优选实施方案中，在印迹步骤前没有从未反应的氰尿酰氯中纯化活化的核酸多聚物。令人惊奇地发现在排列方法的印迹步骤前不必去除过量的交联剂。也就是说，在反应混合物中过量的氰尿酰氯不影响或竞争核酸多聚物与有PEI涂层的固体支持物的共价结合。这是因为固体支持物上的胺多于将以任何给定体积(纳升到皮升)排列的氰尿酰氯分子的数目。
一般让活化核酸结合到固体支持物上的反应在20到50℃进行1到20小时。优选地，反应时间是于25℃1小时。
本发明的阵列在进行杂交分析中特别有用。然而，为了进行这种分析，在进行杂交步骤前必须对固体支持物上的胺加帽。这可通过使固体支持物与0.1-2.0M琥珀酸酐反应来实现。优选的反应条件是70％m-pyrol和0.1M硼酸钠中的1.0M琥珀酸酐。一般使反应进行15分钟到4小时，其中优选的反应时间是于25℃30分钟。残余的琥珀酸酐用3X水洗加以去除。
然后将固体支持物与在pH 7-9的0.1-10.0M硼酸钠中含有0.1-5M甘油的溶液一起温育。该步骤通过转化为单氯二嗪对任何可以共价结合到PEI表面上的二氯三嗪“加帽”。优选的条件是在pH8.3的0.1M硼酸钠中的0.2M甘油。然后可以用含有去污剂的溶液洗固体支持物以去除未结合的物质，例如微量NMP。优选地，将固体支持物在0.01MNaCl、0.05M EDTA和0.1M Tris(pH8.0)中加热至95℃5分钟。此加热步骤去除未共价结合的核酸多聚物如PCR产物。在排列双链核酸的情况中，此步骤也具有将双链变成单链形式(变性)的效应。
排列可通过生物素化的探针(例如寡核苷酸、核酸片段、PCR产物等)加以检测。使核酸生物素化的方法在本领域众所周知并且由Pierce进行了充分描述(抗生物素蛋白-生物素化学手册，Pierce化学公司，1992，Rockford Illinois)。探针一般以0.1ng/mL到10μg/ML在包括GuSCN、GuHCl、甲醛等的标准杂交液中使用(参见Van Ness和Chen，核酸研究195143-5151，1991)。
为检测杂交事件(即生物素的存在)，将固体支持物与链霉抗生物素蛋白/辣根过氧化物酶偶联物一起温育。这样的酶偶联物在商业上可获自例如Vector Laboratories(Burlingham，CA)。链霉抗生物素蛋白以高亲和性结合生物素分子从而使辣根过氧化物酶与杂交探针靠近。未结合的链霉抗生物素蛋白/辣根过氧化物酶偶联物用简单洗涤步骤洗去。然后在过氧化物和适当缓冲液存在的情况下利用沉淀底物检测过氧化物酶的存在。
对于比色分析基质，点样于反光性表面如硅片上的蓝色酶产物具有与预期相比低许多倍水平的检测(LLD)。此外，LLD对于不同的有色酶产物有很大不同。如实施例5中所示，每50μM直径点4-甲氧基-napthol(产生沉淀的蓝色产物)的LLD是约1000个分子，而红色沉淀的物质每50μM直径点给出约1000倍更高1,000,000个分子的LLD。通过用装有可见光源和CCD相机(Princeton Instruments，Princeton，NJ)的显微镜(如可从Zeiss商业上得到的Axiotech显微镜)检测表面来测定LLD。一次可扫描约10,000μM×10,000μM的图象。
为了用蓝色比色测定方案，表面在酶反应后必须很干净并且硅片或载片必须在干燥状态下扫描。此外，酸反应必须在对照点饱和之前终止。对于辣根过氧化物酶，这大约是2-5分钟。
也可以使用碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物或HPP或碱性磷酸酶的荧光底物。实例包括可获自Perkin Elmer的碱性磷酸酶diox底物或可获自JBL Scientific(Scan Luis Obispo，CA)的AttophosHRP底物。生物分子溶液的自动转移本发明提供一种将生物分子点样到固体支持物上的方法，此方法包括以下步骤将弹性探头端部浸入生物分子溶液中；将所述端部从所述溶液中移出以使生物分子溶液附着在所述端部上；并且使所述生物分子溶液与固体支持物接触从而将生物分子溶液从所述端部转移到所述固体支持物上。在优选实施方案中，接触步骤自动进行，换句话说，是可在x，y和z轴上加以控制的精密自动系统。精密Cartesian自动系统将由与适当马达、放大器、移动控制器、个人计算机和软件连接以驱动工作台的精密线性定位工作台组成。精密线性定位工作台可获自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本东京)。马达、放大器和移动控制器可获自Parker Hannifin公司(DaedelDivision，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。软件将最可能是自定义的并且可用语言如BorlandC++4.5(Borland International Inc.，Scotts Valley，CA)或VisualBasic 4.0(微软公司，Redmond，WA)编写。个人计算机可获自众多生产商如Dell计算机公司(Austin，TX)。
如上所述的弹性探头制备成装在任何类型的接受器中，本发明中有用的机器人含有适当大小的接受器以容纳弹性探头。优选的接受器由镍-银或青铜制成，然后在坚硬的镍上镀金。优选的接受器设计是直径0.5mm到2.0mm、更优选地1.68毫米的金属管。将0.5mm到1mm厚、更优选地0.64mm厚的方线弯入金属管的一端并封闭。每个套壳制备有凹痕和压环以安全地容纳弹性探头。将探头插入接受器中，因此探头管与接受器末端平齐。
为了排列液体的目的，将安装头部安装到机器人上。该头部具有可在不同印迹应用时拆卸的扣栓。例如，通过取下2个螺丝并用一个设计以容纳从384孔板点样的弹性探头的扣栓代替一个设计以容纳从96孔板点样的弹性探头的扣栓可容易地改变扣栓。用精密钻出的、双水平的孔与接受器的绕线和弯曲区域适当匹配借助摩擦力将接受器固定在扣栓上。这种设计使得可以容易地更换损伤或操作不灵的接受器和/或弹性探头。一旦插入，接受器/弹性探头组件从扣栓向下伸出25mm，从而允许探针到达装有待排列样品液的微量滴定板底部。阵列本发明的生物分子阵列包括包含表面的固体基质，其中表面至少部分覆盖有一层聚(乙烯亚胺)(PEI)。PEI涂层包括多个由连续第二区环绕并与其邻接的分开的第一区。第一区有生物分子和PEI，而第二区有PEI并且基本上没有生物分子。优选地，基质是玻璃板或硅板。然而，如上所述，基质可以是例如石英、金、尼龙-6，6、尼龙或聚苯乙烯以及它们的复合材料。
PEI涂层优选地含有具100-100,000分子量的PEI。双功能偶联剂的反应产物可以置于基质表面和PEI涂层之间，其中反应产物与表面和PEI涂层共价结合并将PEI涂层固定在表面上。双功能偶联剂包含第一和第二反应性功能基团，其中第一反应性功能集团是例如三(O-C1-C5烷基)硅烷，而第二反应性功能集团是例如环氧化合物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和酐基团。优选的双功能偶联剂是2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧硅烷；3，4-环氧丁基三甲氧硅烷；3-异氰酸根丙基三乙氧硅烷；3-(三乙氧甲硅烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧硅烷。
本发明的阵列首先含有含生物分子的区域，其中每个区域具有约1,000平方微米-约100,000平方微米的面积。在优选的实施方案中，第一区具有约5,000平方微米-约25,000平方微米的面积。
第一区优选地基本上是圆形，圆圈具有约10μm-200μm的平均直径。不论是否是圆形的，第一区的边界优选地互相分开(由第二区分开)至少约25μm，然而不大于约1cm(并且优选地不大于约1,000μm)的平均距离。在优选的阵列中，相邻第一区的边界由平均约25μm-100μm的间隔分开，其中间隔优选地在整个阵列中一致，并且优选地第一区以如附图中所示的重复几何模式定位。在优选的重复几何模式中，所有相邻的第一区由大约相等的间隔(约25μm-约100μm)分开。
在优选的阵列中，基质上有10-50个第一区。在另一实施方案中，基质有50-400个第一区。在另一优选实施方案中，基质上有400-800个第一区。
位于第一区的生物分子优选地是核酸多聚物。优选的核酸多聚物是有约15-约50个核苷酸的寡核苷酸。生物分子可以是有约50-约1000个核苷酸的扩增反应产物。
在每个第一区中，生物分子优选地以每2,000μm2第一区105-109个生物分子的平均浓度存在。更优选地，生物分子的平均浓度是每2,000μm2107-109个生物分子。在第二区，生物分子优选地以每2000μm2所述第二区少于103个生物分子的平均浓度存在，更优选地以每2000μm2少于102个生物分子的平均浓度存在。最优选地，第二区不含任何生物分子。
对于许多生物技术应用，本发明有很大的用途，特别是那些涉及利用聚合酶链式反应(PCR)，核酸杂交，通过杂交的核酸测序，病毒、细菌或细胞文库的复制开发大规模诊断筛选方法的方法以及任何其它涉及反复将溶液排列到固体表面上的方法。
本发明的生物分子阵列可以通过标记的生物分子，例如与可切割的标记共价结合的寡核苷酸来探测。这些标记的生物分子可用于分析方法如寡核苷酸测序和基因表达分析等。标记的生物分子的实例和使用其的分析法描述于美国专利申请Nos.08/786,835；08/786,834和08/787,521(各于1997年1月22日提交)，以及具有申请Nos.08/898,180；08/898,564和08/898,501的三个美国部分继续专利申请(各于1997年7月22日提交)，以及PCT国际公开Nos.97/27331；97/27325和97/27327中。在此完全引用这6个美国专利申请和3个PCT国际公开的全文作为参考。
此外，本发明的生物分子阵列可以在单元中含有一个以上寡核苷酸序列。在成分中含有一个以上寡核苷酸序列的生物分子阵列及其使用描述于1997年7月22日提交的题为“排列单元内的多功能性及其用途”的美国临时专利申请No.60/053,436和与其同时提交的类似题目的美国非临时专利申请No.＿＿＿＿中，在此完全引用二者的全文作为参考。
本发明的生物分子阵列也可用于进行扩增和其它酶反应，如在我们1997年7月22日提交的题为“对核酸阵列进行的扩增和其它酶反应”的美国临时专利申请No.60/053,428和与其同时提交的类似题目的美国非临时专利申请No.＿＿＿＿中所述，在此完全引用二者的全文作为参考。
本发明的生物分子阵列可以按照1997年7月22日提交的题为“将溶液排列到固体支持物上的装置和方法”的美国临时专利申请No.60/053,435和与其同时提交的类似题目的美国非临时专利申请No.＿＿＿＿中所述的方法制备，在此完全引用二者的全文作为参考。
如1997年7月22日提交的题为“使数据相关的计算机方法和系统”的美国临时专利申请No.60/053,429和与其同时提交的类似题目的美国非临时专利申请No.＿＿＿＿(在此充分引用二者的全文作为参考)中所述的使数据相关的计算机系统和方法可与本文公开的方法和装置结合使用。
提供以下实施例作为举例说明而不是限制。实施例实施例1一步法制备有PEI涂层的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水冲洗直到从玻片上洗出的水的pH与用于冲洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目录号SSP060)中的50％ w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亚胺(600MW)以达到2％ w/w终浓度。搅拌此2％溶液5分钟后，将玻片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取出。为了洗去过多的甲硅烷基化试剂，将玻片浸入乙醇中。然后使玻片空气干燥。实施例2一步法制备有PEI涂层的硅片用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后用水冲洗直到从硅片上洗出的水的pH与用于冲洗硅片的水的pH相同。然后使硅片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的溶于2-丙醇(Gelest，Inc.，Tullytown，PA，目录号SSP060)中的50％ w/w三甲氧基甲硅烷基丙基-聚乙烯亚胺(600MW)以达到2％ w/w终浓度。搅拌此2％溶液5分钟后，将硅片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取出。为了洗去过多的甲硅烷基化试剂，将硅片浸入乙醇中。然后使硅片空气干燥。实施例3一步法制备有PEI涂层的玻片用0.1N乙酸洗玻片，然后用水冲洗直到从玻片上洗出的水的pH与用于冲洗玻片的水的pH相同。然后使玻片干燥。
向95∶5的乙醇∶水溶液中加入足够量的亲电子甲硅烷基化试剂，同时搅拌以达到2％ w/w终浓度。亲电子甲硅烷基化试剂是2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4670.0)，3，4-环氧丁基三甲氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SIE4665.0)或3-异氰酸根丙基三乙氧硅烷(Gelest，Inc.，Catalog No.SII6454.0)之一。搅拌此2％溶液5分钟后，将玻片浸入溶液中，轻轻搅拌2分钟，然后取出。为了洗去过多的甲硅烷基化试剂，将玻片浸入乙醇中。
通过用1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)稀释30％聚乙烯亚胺(Polysciences，Warrington，PA)水溶液来制备70,000分子量聚乙烯亚胺的3％(w/v)溶液。将处理的玻片浸入3％溶液中并轻轻搅拌24小时。为了去除玻片上过多的PEI，将玻片浸入NMP中(2X)，然后浸入同时含有0.09MNaCl、50mM TrispH7.6和25mM DETA的0.1％十二烷基磺酸钠水溶液中(2X)，然后浸入水中(2X)，并且最后浸入乙醇中(1X)。然后使玻片空气干燥。实施例4一步法制备有PEI涂层的硅片按照实施例3中所述用0.1N乙酸洗硅片(WaferNet，San Jose，CA)，然后也按照实施例3中所述用甲硅烷基化试剂和PEI处理。实施例5从商业弹性探头制备点样头XP54P弹性探头购自Osby-Barton〔Everett Charles(Pomona，CA)的分公司〕。将探头“端部向下”对着超细的金刚磨石(DMT Inc.，Miami Lattes，FL)并以轻轻的压力在磨石上横移约0.5cm距离。通过显微镜观察到由此从点样头的末端去掉约0.005英寸(0.001到0.01英寸)的金属。然后通过在皮带上摩擦端部将点样头末端磨光。然后用水洗端部。在开始使用前或使用之间，将点样头干燥保存或于-20℃保存在50％甘油中。实施例6用改进的弹性探头装配排列装置将实施例5中制备的端部安装到布列头部中，布列头部装在可在x，y和z轴上控制的精密自动系统上。精密Cartesian自动系统将由与适当马达、放大器、移动控制器、个人计算机和软件连接以驱动工作台的线性定位工作台组成。精密线性定位工作台可获自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或THK有限公司(日本东京)。马达、放大器和移动控制器可获自Parker Hannifin公司(Daedel Division，Harrison City，PA)或Galil Motion Control有限公司(Mountain View，CA)。实施例7用亲水性表面促进液体汲取、液体转移和微滴点样按照实施例5将弹性探头端部浸于100mM 1，4-二硫苏糖醇和0.1M的硼酸钠溶液中60分钟。二硫苏糖醇将通过硫醇-金配位与金表面反应以制备金亲水性表面(表面基本上羟化)。实施例8反应性寡核苷酸的制备将75μl 5’-己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’(0.5μg/μl)溶液与5μl 20mg/ml的氰尿酰氯和20μl 1M的硼酸钠在室温反应30分钟。实施例9寡核苷酸的布列溶液制备由12.5μL pH8.3的1M硼酸钠(新鲜制备或从-20℃储液冻融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯组成的布列溶液。将此混合物在室温下温育30到60分钟。然后向溶液加入155μL 80％甘油并将所得溶液充分混合。在某些情况下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100(Rohm和Hass，费城)。当排列基质由尼龙或硝酸纤维素膜组成时，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。实施例10PCR扩增子的布列溶液当排列PCR扩增子时，在完成热循环步骤后将2.5μL pH8.3的1M硼酸钠(新鲜制备或从-20℃储液冻融)、50μl 0.1μg/μL的5’己胺寡核苷酸(5’己胺-GTCATACTCCTGCTTGCTGATCCACATCTG-3’)、7.5μL乙腈中的15mg/mL氰尿酰氯加入含有PCR内容物的PCR管中。将此混合物在室温下温育30到60分钟。然后向溶液加入155μL 80％甘油并将得到的溶液充分混合。在某些情况下，向溶液加入15μL 10％的NP-40或10％的Tween 20或10％的Triton X-100。当排列基质由尼龙或硝酸纤维素膜组成时，向布列溶液加入25μL 5M的NaCl。实施例11排列寡核苷酸的制备按照实施例6将实施例5的改进的弹性探头安装在自动移液装置中，并且按照实施例7处理弹性探头端部。将端部浸入实施例9的布列溶液中5毫米2秒种。然后机器人用带有溶液的端部以12×6网格在有聚乙烯亚胺(PEI)涂层的硅片上印迹72个微点，硅片根据实施例2、4中的任一项制备或由将会根据合同制备有PEI涂层的基质的Cell Associates(Houston，Texas)等提供。产生的点直径约100-150微米，相邻点之间中心到中心的间距是200微米。实施例12活性PEI位点的封闭为了封闭排列上未反应的PEI位点，用100mg/mL 100％ NMP中的琥珀酸酐处理实施例11的阵列15分钟。实施例13未反应的氰尿酰氯位点的封闭为了封闭排列上未反应的氰尿酰氯位点，用0.1M 0.01M Tris中的甘油处理实施例12的阵列15分钟，然后用Tens(0.1MNaCl，0.1％ SDS，0.01MTris，5 mM EDTA)洗4次。实施例14杂交方法使实施例13的阵列中的固定寡核苷酸与其生物素化的互补产物(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)在37℃杂交20分钟，用6X Tens、2 X OHS
洗。
杂交后，将硅片浸入0.5μg/ml碱性磷酸酶链霉抗生物素蛋白中15分钟，用2X Tens、4X TWS(0.1M NaCl，0.1％Tween20，0.05M Tris)洗。然后用Vector Blue(Vector Laboratories，Burlingame，Califor-nia)(按照试剂盒方法)使微点显色并用CCD相机和显微镜照相。图5显示产生的图象。实施例15单一阵列单元内的多个寡核苷酸浓度均为0.5μl/μl的2种模板寡核苷酸(寡核苷酸#1＝5’己胺-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’，寡核苷酸#2＝5’己胺-ACTACTGATCAGGCGCGCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’)分别与20μl 1M硼酸钠中的5μl 20mg/ml氰尿酰氯于室温反应30分钟(总反应体积＝100μl)。从这两个反应制备由56％甘油和这两种寡核苷酸的稀释组合组成的布列溶液(见表1)。将8个点样头各浸入8种布列溶液中5毫米2秒钟。然后机器人在聚乙烯亚胺(PEI)涂敷的硅片上用带有溶液的端部印迹2套8个各含有72个微点的12×6网格。每个网格代表单一的布列溶液。产生的点直径约100-150微米，相邻点之间中心到中心的间距是200微米。
排列后，硅片上未反应的PEI位点用100mg/mL 100％N-甲基吡咯烷酮中的琥珀酸酐封闭15分钟，水洗3X。未反应的氰尿酰氯位点用0.01M Tris中的0.1M甘油封闭15分钟，Tens(0.1M NaCl，0.i％SDS，0.01M Tris，5 mM EDTA)洗4X。然后进行两种杂交。
在第一种杂交中，将一套8种排列的寡核苷酸组合与互补于寡核苷酸#`1的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-TGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATG-3’)杂交。在第二种杂交中，将另一套8种排列的寡核苷酸组合与互补于寡核苷酸#`2的生物素化寡核苷酸(5’-生物素-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGGCGCGCCTGATCAGTAGT-3’)杂交。杂交于37℃在Hybriwell SealingCovers(Research Products International Corporation，Mount Prospect，Illinois)下同时进行20分钟，用6X Tens、2 X OHS(0.06M Tris，2mMEDTA)、5 X Denhardt’s溶液、6X SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH7.0)、3.68mM N-月桂酰肌氨酸、0.005％NP-40洗。
杂交后，将硅片浸入0.5μg/ml辣根过氧化物酶链霉抗生物素蛋白中15分钟，用2X Tens、4X TWS(0.1M NaCl，0.1％Tween 20，0.05M Tris)洗。然后用0.4mg/ml的4-甲氧基-1-napthol(0.02％过氧化氢，12％甲醇，PBS)使微点显色，最后水洗3X。
与寡核苷酸#1的互补产物杂交的混合寡核苷酸系列对于含有最高浓度寡核苷酸#1的网格表现最强的颜色强度而对于含有最低浓度寡核苷酸#1的网格表现最低的颜色强度。而且，与寡核苷酸#2的互补产物杂交的混合寡核苷酸系列对于含有最高浓度寡核苷酸#2的网格表现最强的颜色强度而对于含有最低浓度寡核苷酸#2的网格表现最低的颜色强度(见图6)。
表1<
>实施例16测定单元大小的一致性制备由56％甘油和44％用蓝色食物染料染色的水组成的布列溶液。将点样头浸入布列溶液中5毫米2秒钟。然后机器人用带有甘油的端部以12×6网格在硅片上印迹72个微点。产生的点直径约100-150微米，相邻点之间中心到中心的间距是200微米。图7显示机器人产生的网格的CCD相机相片。点直径的标准偏差约为15％。实施例17测定排列方法内的可重复性制备由56％甘油、0.01M Tris pH7.2、5mm EDTA、0.01％肌氨酰和1％V/V Fluoresbrite Plain 0.5μM微球体(2.5％Solids-latex)(Polysciences，Warrington，PA)组成的布列溶液。将点样针头浸入溶液中5毫米5秒钟并且然后用于在玻片上印迹多个微点。然后用荧光滤镜在荧光下进行显微摄影。图8显示每个微点(阵列单元)荧光微球体的高度重复性点样(通过肉眼观察测定)。实施例18测定每单元核酸多聚物的浓度将与点样的寡核苷酸互补的寡核苷酸(5’-德克萨斯红-CAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGAC)与3M硫氰酸胍(GcSCN)、0.01M TrispH7.5、5mM EDTA和0.1％肌氨酰中的阵列杂交。体积足以覆盖固体支持物〔对于玻片(1×3英寸)为1mL〕。德克萨斯红寡核苷酸的浓度为5μg/ml，并且反应在室温进行。使杂交进行30分钟。然后用Tens洗玻片(5X)。然后用1mL洗脱缓冲液(0.005M Tris pH7.6，0.0005M EDTA，0.01％肌氨酰)覆盖玻片并加热到95℃ 2分钟。从玻片上汲取溶液并将其置于黑色微量滴定板中。在黑色微量滴定板中测定荧光。从温育管汲取溶液(200μL)并将其置于黑色微量滴定板中(Dynatek Laboratories，Chantilly，VA)。然后用Fluoroskan II荧光计(Flow Laboratories，McLean，VA)直接对平板读数，对于荧光素用495nm的激发波长并且在520nm处监测发射光，对于德克萨斯红用591nm的激发波长并且在612nm处监测发射光，并且丽丝胺或TAMRA用570nm的激发波长并且在590nm处监测发射光。洗脱的寡核苷酸的量通过用测得的荧光量〔3.84个相对荧光单位(rfu)〕除以德克萨斯红寡核苷酸的比活(每μg寡核苷酸6.9rfu)加以测定。因此测得阵列中的每单元中存在108个寡核苷酸。
从前述应当理解，虽然在此为了举例说明的目的描述了本发明的具体实施例，但在不偏离本发明精神和范围的情况下可进行各种修饰。因此，除了所附的权利要求外，本发明不受其它限制。
权利要求
1.一种生物分子阵列，包括包含表面的固体基质；所述表面至少部分覆盖有一层聚(乙烯亚胺)(PEI)；所述涂层包括多个由第二区环绕并与其邻接的分开的第一区；所述第一区有生物分子和PEI；并且所述第二区有PEI并且基本上没有生物分子。
2.权利要求1的阵列，其中所述基质是玻璃板。
3.权利要求1的阵列，其中所述基质是硅片。
4.权利要求1的阵列，其中所述基质包含选自玻璃、石英、硅、金、尼龙-6，6、尼龙和聚苯乙烯的物质。
5.权利要求1的阵列，其中所述PEI具有100-100,000的分子量。
6.权利要求1的阵列，其中双功能偶联剂的反应产物位于所述表面和所述PEI涂层之间，所述反应产物与所述表面和所述PEI涂层共价结合。
7.权利要求6的阵列，其中所述双功能偶联剂包含第一和第二反应性功能基团，所述第一反应性功能集团是三(O-C1-C5烷基)硅烷而所述第二反应性功能集团选自环氧化合物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和酐。
8.权利要求7的阵列，其中所述双功能偶联剂选自2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧硅烷；3，4-环氧丁基三甲氧硅烷；3-异氰酸根丙基三乙氧硅烷；3-(三乙氧甲硅烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧硅烷。
9.权利要求1的阵列，其中每个所述第一区具有约1,000μm2-100,000μm2的面积。
10.权利要求1的阵列，其中所述面积是约5,000μm2-约25,000μm2。
11.权利要求1的阵列，其中每个所述第一区是基本上圆形的。
12.权利要求11的阵列，其中所述第一区有10μm-200μm的平均直径。
13.权利要求1的阵列，其中所述第一区互相之间由至少约25μm的平均间隔分开。
14.权利要求1的阵列，其中相邻的所述第一区由不大于约1cm的平均间隔分开。
15.权利要求1的阵列，其中相郐的所述第一区由不大于1,000μm的平均间隔分开。
16.权利要求1的阵列，其中相邻的所述第一区由约25μm-100μm的平均间隔分开。
17.权利要求1的阵列，其中所述第一区以重复几何模式定位。
18.权利要求17的阵列，其中所述第一区互相间隔大约相等的距离。
19.权利要求18的阵列，其中所述距离是约25μm-约100μm。
20.权利要求17的阵列，其中所述模式包括圆形的第一区，所述圆形的第一区有约100-约1,000μm的平均直径。
21.权利要求1的阵列，有10-50个第一区。
22.权利要求1的阵列，有50-400个第一区。
23.权利要求1的阵列，有400-800个第一区。
24.权利要求1的阵列，其中所述生物分子选自包括核酸多聚物的群体。
25.权利要求24的阵列，其中所述生物分子是有约15-约50个核苷酸的寡核苷酸。
26.权利要求24的阵列，其中所述扩增反应产物是有约50-约1,000个核苷酸的核酸多聚物。
27.权利要求1的阵列，其中所述生物分子以每2,000μm2第一区105-109个生物分子的平均浓度存在于第一区中。
28.权利要求27的阵列，其中所述平均浓度是每2,000μm2107-109个生物分子。
29.权利要求1的阵列，其中所述生物分子以每2000μm2所述第二区少于103个生物分子的平均浓度存在于第二区中。
30.一种制备生物分子阵列的方法。此方法包括提供包含表面的固体基质，其中聚(乙烯亚胺)(PEI)层覆盖所述表面的至少一部分，所述涂层包括多个由连续的第二区环绕并与其邻接的分开的第一区；将生物分子上样到所述的第一区而保持所述的第二区基本上不含生物分子。
31.权利要求30的方法，其中所述基质是玻璃板。
32.权利要求30的方法，其中所述基质是硅片。
33.权利要求30的方法，其中所述基质包含选自玻璃、石英、硅、金、尼龙-6，6、尼龙和聚苯乙烯的物质。
34.权利要求30的方法，其中所述PEI具有100-100,000的分子量。
35.权利要求30的方法，其中双功能偶联剂的反应产物位于所述表面和所述PEI涂层之间，所述反应产物与所述表面和所述PEI涂层共价结合。
36.权利要求35的方法，其中所述双功能偶联剂包含第一和第二反应性功能基团，所述第一反应性功能集团是三(O-C1-C5烷基)硅烷而所述第二反应性功能集团选自环氧化合物、异氰酸酯、异硫氰酸酯和酐。
37.权利要求36的方法，其中所述双功能偶联剂选自2-(3，4-环氧环己基)乙基三甲氧硅烷；3，4-环氧丁基三甲氧硅烷；3-异氰酸根丙基三乙氧硅烷；3-(三乙氧甲硅烷基)-2-甲基丙基琥珀酸酐和3-(2，3-环氧丙氧基)丙基三甲氧硅烷。
38.权利要求30的方法，其中每个所述第一区具有约1,000μm2-100,000μm2的面积。
39.权利要求30的方法，其中所述面积是约5,000μm2-约25,000μm2。
40.权利要求30的方法，其中每个所述第一区是基本上圆形的。
41.权利要求40的方法，其中所述第一区有10μm-200μm的平均直径。
42.权利要求30的方法，其中所述第一区互相之间由至少约25μm的平均间隔分开。
43.权利要求30的方法，其中相邻的所述第一区由不大于约1cm的平均间隔分开。
44.权利要求30的方法，其中相邻的所述第一区由不大于1,000μm的平均间隔分开。
45.权利要求30的方法，其中相邻的所述第一区由约25μm-100μm的平均间隔分开。
46.权利要求30的方法，其中所述第一区以重复几何模式定位。
47.权利要求46的方法，其中所述第一区互相间隔大约相等的距离。
48.权利要求47的方法，其中所述距离是约25μm-约100μm。
49.权利要求46的方法，其中所述模式包括圆形的第一区，所述圆形的第一区有约100-约1,000μm的平均直径。
50.权利要求30的方法，有10-50个第一区。
51.权利要求30的方法，有50-400个第一区。
52.权利要求30的方法，有400-800个第一区。
53.权利要求30的方法，其中所述生物分子是核酸多聚物。
54.权利要求53的方法，其中所述生物分子是有约15-约50个核苷酸的寡核苷酸。
55.权利要求53的方法，其中所述扩增反应产物是有约50-约1,000个核苷酸的核酸多聚物。
56.权利要求30的方法，其中所述生物分子以每2,000μm2第一区105-109个生物分子的平均浓度存在于第一区中。
57.权利要求56的方法，其中所述平均浓度是每2,000μm2107-109个生物分子。
58.权利要求30的方法，其中所述生物分子以每2000μm2所述第二区少于103个生物分子的平均浓度存在于第二区中。
59.权利要求30的方法，其中所述上样生物分子包括将核酸多聚物转移到弹性探头端部上。
60.权利要求30的方法，其中所述样生物分子包括将核酸多聚物从喷黑印迹头中喷出。
全文摘要
本发明提供一种生物分子阵列,由包含表面的固体基质构成,其中表面至少部分覆盖有一层聚(乙烯亚胺)(PEI),并且PEI层分为多个由连续第二区环绕并与其邻接的分开的第一区。第一区有生物分子和PEI,而第二区有PEI并且基本上没有生物分子。阵列可以通过包括以下步骤的方法制备:提供包含表面的固体基质,其中聚(乙烯亚胺)(PEI)层覆盖所述表面的至少一部分,所述涂层包括多个由连续的第二区环绕并与其邻接的分开的第一区;将生物分子上样到第一区而保持第二区基本上不含生物分子。
文档编号G01N37/00GK1265049SQ98807480
公开日2000年8月30日 申请日期1998年7月21日 优先权日1997年7月22日
发明者J·范尼斯, J·C·塔伯恩, K·莫伊尼汉 申请人:拉普吉恩公司