具有可追踪性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/dna复合物的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学材料领域，涉及用于癌症治疗的ー种具有可追踪性DNA信号 的二维响应型纳米载药体系及其制备方法，具体涉及ー种以响应型层片状羟基磷灰石为载 体的具有可追踪性DNA"[目号的响应型载药体系的制备。
【背景技术】
[0002] 在肿瘤治疗领域，纳米载药系统可实现抗癌药物的靶向和缓释治疗。与游离药物 相比，药物缓释体系可以显著提高药物疗效、減少给药剂量以及降低毒性反应。目前，二维 纳米层片状的药物载体由于其优良的药物装载、保护和缓释性能受到了广泛关注。但是具 有可识别的DNA信号标志的二维响应型纳米载药体系还未见报道。
【发明内容】
[0003] 针对现有技术存在的问题，本发明提供具有插层结构的层片状羟基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶复合物及相关的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物和具 有可追踪性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA复合物。
[0004] 本发明中的药物载体一一层片状羟基磷灰石作为ー种非病毒基因载体，它具有成 本低，制备エ艺简单，能对肿瘤组织微环境做出响应等优点。同时与结构类似的天然层状无 机载体（诸如蒙脱土和水滑石等）相比，层片状羟基磷灰石具有优异的生物相容性和较高 的药物装载能力，是极具潜力的药物基因载体材料。同时，环境敏感型层片状羟基磷灰石载 药体系能对肿瘤组织微环境做出响应，这样就能够有效的将药物带到病灶部位，在肿瘤组 织特殊环境的刺激下，迅速的释放药物，以减少药物对正常组织的毒副作用，更好地发挥药 效。本发明利用具有标记作用的质粒DNA可以有效追踪响应型层片状羟基磷灰石（HAp)载 药体系的迀移过程、层片状羟基磷灰石层间距较大并对阴离子药物具有高装载能力以及聚 乙烯亚胺（PEI)具有提高载体转染能力的特点，制备了具有可追踪性的聚乙烯亚胺/层片 状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA复合物，可用于癌症治疗。
[0005] 为了解决上述技术问题，本发明提出的ー种具有插层结构的层片状羟基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶复合物的制备方法，包括以下步骤：
[0006] 步骤一、制备层片状羟基磷灰石：以醇水比为2:1配制浓度为llmg/ml的十二烷 基磺酸钠溶液，然后将其加入一玻璃容器中，用磁力撹拌器在60°C撹拌均匀；配制3. 3mol/ L的硝酸钙水溶液，配置lmol/L的磷酸氢二铵溶液，其中，醇水比为1: 1，按照硝酸钙水溶 液与磷酸氢二铵溶液体积比为1:2撹拌均匀后先后加入到上述玻璃容器中；随后，向上述 玻璃容器中加入2. 5mol/L的氢氧化钠溶液，其中，醇水比为1:1，自室温匀速升温至80~ 85°C，回流反应14h;将玻璃容器封ロ后在室温下沉积12天；用去离子水清洗后静置3天； 离心去除多余水分，在60°C干燥，即得层片状纳米羟基磷灰石粉末；
[0007] 步骤二、将步骤一中制备的层片状羟基磷灰石加入到浓度为2mg/ml、pH为8~13 的氢氧化钠溶液中形成混合溶液A，将所述混合溶液A超声振荡10~15min后，并在撹拌中 升高至60°C;随后向混合溶液A中加入五-氟尿嘧啶，其中，五-氟尿嘧啶与层片状羟基磷 灰石的质量比为1 :1~8 ;反应8h后离心，使上清液与沉淀分离，将沉淀物在60°C下干燥后 研磨，从而形成具有插层结构的层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物。
[0008] 在此基础上，本发明还提出了一种聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧 啶复合物的自卑方法，是将上述制备得到的层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物加入 到2~8mg/ml、分子量为1800~20000的聚乙烯亚胺水溶液中形成混合溶液B，所述混合 溶液B的浓度为2. 5mg/ml，室温下搅拌8~16h，万转离心5~IOmin后，去除上清液，将沉 淀物置于鼓风干燥箱中吹干，研磨后即为聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶 复合物。
[0009] 本发明最主要的是提出了ー种具有可追踪性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/ 五-氟尿嘧啶/DNA复合物的制备方法，其步骤包括：将50mg上述制备得到的粉末状的聚こ 烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物加入到19ml灭菌高纯水的锥形瓶中，超 声分散5min，制备得到悬浊液；然后，将Iml质量浓度为lmg/ml的DNA溶液逐滴加入到的 悬浊液中，边加边震荡；最终，将混合液放入25°C恒温摇床中摇动，转速为150rpm，每摇动 0. 3h，平衡吸附lh，重复6次上述的摇动-平衡吸附过程；静置吸附24h，即获得具有可追踪 性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA复合物。
[0010] 本发明中制备得到的层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物和聚乙烯亚胺/层 片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物均可用于药物缓释。本发明中制备得到的具有可追 踪性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA复合物可以用于癌症治疗中。
[0011] 本发明具有可追踪性的聚乙烯亚胺/层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶/DNA复 合物是以响应型层片状羟基磷灰石作为药物载体，携带荧光蛋白基因的质粒DNA作为药物 载体的追踪信号，利用基因转染及影像学原理，最终实现利用载药体系发出的荧光信号了 解药物载体的移动过程。与其他载药体系相比本发明具有以下优点：
[0012] 1.本发明提供的荧光蛋白标记的DNA作为层片状羟基磷灰石载药体系的标记信 号，能够使二维药物载体具有可追踪性，通过对荧光位置的定位和分析，可以有效表征药物 载体的作用部位并评价其有效性。
[0013] 2.本发明提供的层片状羟基磷灰石作为药物载体，生物相容性良好，相比于天然 层状无机载体具有较大的层间距，对于阴离子药物具有较高的装载能力，同时形成的载药 复合物具有插层结构，实现了对阴离子药物的有效保护与可控释放。
[0014] 3.本发明提供的层片状羟基磷灰石载药复合物具有对肿瘤组织微环境具有响应 能力，可以实现对药物的可控释放。
[0015] 4.本发明提供的聚乙烯亚胺改性后的载药复合物负载质粒DNA，可以有效跟踪药 物载体进入细胞并及时做出响应，这对于载药体系在癌症治疗中的应用具有重要意义。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明实施例2制备得到的具有插层结构的层片状羟基磷灰石/五-氟尿 嘧啶复合物的体外药物释放曲线图；
[0017] 图2为本发明实施例1-3制备得到的具有插层结构的层片状羟基磷灰石/五-氟 尿嘧啶复合物的热失重曲线；
[0018] 图3为为本发明实施例3在制备具有插层结构的层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧 啶复合物过程中载药前、后层片状羟基磷灰石的X射线衍射图。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和具体实施例对本发明技术方案作进ー步详细描述，所描述的具体 实施例仅仅对本发明进行解释说明，并不用以限制本发明。
[0020] 本发明是以具有荧光标记的质粒DNA作为层片状羟基磷灰石载药体系的追踪信 号。以五-氟尿嘧啶作为模型药物，载药复合物经聚乙烯亚胺改性后可成功负载DNA信号， 从而定位药物载体的作用位置。
[0021] 实施例1、制备具有插层结构的层片状羟基磷灰石/五-氟尿嘧啶复合物，包括以 下步骤：
[0022] 步骤一、制备层片状羟基磷灰石：
[0023] 称取0.5g十二烷基磺酸钠，加入烧瓶中，然后加入15ml去离子水和30ml无水こ 醇，配制出浓度为llmg/ml的十二烷基磺酸钠溶液，用磁力搅拌器在60°C搅拌均勾；
[0024] 配制15ml浓度为3. 3mol/L的硝酸钙水溶液，搅拌均匀后加入上述烧瓶中；加入 30ml浓度为lmol/L的磷酸氢二按水溶液和30ml无水こ醇；随后，加入20ml浓度为2. 5mol/ L的氢氧化钠水溶液和20ml无水こ醇，自室温匀速升温至80~85°C，回流反应14h。将反 应物倒入另外ー烧杯中，封ロ后在室温下沉积12天；用去离子水清洗后静置3天；离心去 除多余水分，在60°C干燥，即得层片状纳米羟基磷灰石粉末；
[0025] 步骤二、取0.Ig由步骤ー制备得到的层片状羟基磷灰石溶于50mlpH= 13的氢 氧化钠溶液中，超声振荡IOmin后，在搅拌中将温度升高至60°C;随后向该混合溶液中加入 0.2g的五-氟尿嘧啶（5-FU)，反应8h后离心，使上清液与沉淀分