一种酵母融合子的制备及快速筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酵母融合子的制备及其高通量快速筛选的方法。
【背景技术】
[0002]辅酶Q1。为呼吸链上的一个重要的电子载氢体，能可逆地进行氧化还原反应，广泛存在于人、动物、植物及多数微生物中。目前利用微生物法发酵生产辅酶Q1。的菌种主要是粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe, S.sprombe)，但粟酒裂殖酵母生长缓慢、生长条件要求严格，严重影响着辅酶Qi。的生产效率。近年来，研究人员通过紫外诱变、离子束诱变等方法对其进行进一步基因改造，使其成为辅酶Qw的生产载体。
[0003]作为食品级的多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha, H.polymorpha)，因其安全性高、优点明显，近年来备受关注。其优点体现在遗传背景清晰，耐高温、易于高密度发酵、繁殖快、遗传操作简单、能对外源产物进行翻译后加工和修饰及无毒性代谢产物等；多形汉逊酵母为一种耐热酵母，最适生长温度为37°C，但最高生长温度可达49°C ;另外，其可在廉价的非选择性培养基中生长，PH适应范围广(2.5?8.0)，易于实现高密度发酵，菌体浓度可高达120g/L，一般可作为代谢产物生产发酵的天然载体。因此，如果将多形汉逊酵母优良特性(如生长速度快、耐高温)高效移植到辅酶Q1。生产菌株粟酒裂殖酵母中，必能提高粟酒裂殖酵母的辅酶Q1。的生产效率。
[0004]目前，尚未见到关于粟酒裂殖酵母及多形汉逊酵母原生质体融合子制备以及快速筛选方法的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种酵母融合子的制备及快速筛选方法。
[0006]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0007]I)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为出发菌株，分别制备原生质体；
[0008]2)以多形汉逊酵母和粟酒裂殖酵母为两亲本，将两亲本原生质体(多形汉逊酵母原生质体和粟酒裂殖酵母原生质体)进行融合，得融合处理细胞；
[0009]3)对融合处理细胞进行初步培养后以48°C高温培养对初步培养得到的菌株进行初筛，再结合维生素K3选择性培养对初筛后保留的菌株进行复筛，得目标融合菌株。
[0010]所述制备原生质体包括以下步骤:
[0011]1.1)收集菌体:取对应出发菌株对数期菌液并通过离心(4000?8000r/min离心5?1min)收集菌体，以PBS缓冲液洗涤菌体2?3次；
[0012]1.2)细胞预处理:以预处理液(用量为对数期菌液体积的0.5?I倍)悬浮经过PBS缓冲液洗涤的菌体，然后于25?35°C水浴处理5?lOmin，处理后通过离心(4000?8000r/min)收集菌体；所述预处理液的制备方法为:将15?25 μ L 0.05mol/L EDTA水溶液以及15?25 μ L β -巯基乙醇溶于20mL PB缓冲液中；
[0013]1.3)破壁:以2.0?2.5%蜗牛酶酶液(用量为对数期菌液体积的0.5?I倍)悬浮步骤1.2)收集的菌体，然后于25?40°C水浴处理30?60min，使菌体细胞转变为原生质体，然后通过离心(3000?6000r/min离心5?1min)收集原生质体，然后以KCl高渗缓冲液洗涤原生质体2?3次，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为:将4?5g KCl溶于10mL PB缓冲液。
[0014]所述融合包括以下步骤:
[0015]2.1)灭活:利用步骤1.1)?1.3)分别制备两亲本原生质体，分别将两亲本原生质体在紫外灯下照射I?5min，然后于黑暗中保存15?20min，分别得到两亲本灭活后的原生质体；
[0016]2.2)分别以KCl高渗缓冲液悬浮两亲本灭活后的原生质体，得两亲本原生质体细胞悬液，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为:将4?5g KCl溶于10mL PB缓冲液；
[0017]2.3)将两亲本原生质体细胞悬液混合后离心(3000?6000r/min离心5?1min)并收集细胞，以PEG-CaCl2缓冲液(用量为对数期菌液体积的I倍)悬浮该细胞，然后于25?35°C水浴处理15?20min，然后通过离心(3000?6000r/min离心5?1min)收集细胞，用KCl高渗缓冲液洗涤该细胞2?3次，得融合处理细胞，所述PEG-CaClgl冲液的制备方法为:将6?8g PEG6000^0.8?1.0g CaCl2以及30?50 μ L β -巯基乙醇溶于20mLPB缓冲液。
[0018]所述紫外灯的照射功率为15?30W，照射距离为30?50cm。
[0019]所述步骤3)具体包括以下步骤:
[0020]3.1)固体培养基培养(初步培养，长细胞壁):将融合处理细胞用KCl高渗缓冲液(用量为对数期菌液体积的0.3?0.5倍)悬浮后均匀涂布于KCl高渗培养基上，然后于28?37°C恒温培养36?60h，然后挑取80?120株生长状况较好的菌株作为融合酵母候选菌株，所述KCl高渗缓冲液的制备方法为:将4?5g KCl溶于10mL PB缓冲液；
[0021]3.2)高温筛选:将融合酵母候选菌株分别接种于固体YPD培养基上，然后于48°C十旦温培养36?60h，筛选耐高温融合菌株；
[0022]3.3)维生素1(3抗性复筛:将耐高温融合菌株分别涂布于固体维生素K 3选择培养基上，然后于28?37°C恒温培养36?60h，筛选出的维生素K3抗性菌株即目标融合菌株。
[0023]所述PB缓冲液由87.7mL 0.2mol/L NaH2PO4水溶液以及 12.3mL 0.2mol/L Na2HPO4水溶液配制而成。
[0024]所述KCl高渗培养基的组成为:酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉 20g/L，以及 KCl 40g/Lo
[0025]所述固体维生素K3选择培养基为添加有浓度为0.16mg/mL维生素K 3的固体YPD
培养基。
[0026]本发明的有益效果体现在:
[0027]为了实现辅酶Q1。的大量生产，本发明利用原生质体融合的方法，通过对粟酒裂殖酵母和多形汉逊酵母进行融合处理，再结合一种高效筛选目标酵母融合子的方法，快速高效地获得同时兼备两种酵母菌株的优良特性的目标融合子，所述目标融合子同时具有生长速度快、耐高温，以及能够高效生产辅酶Qw等优点。本发明的筛选酵母融合子的方法，是以菌体的耐高温(即48°C高温，过高或过低均无法实现筛选)及目标代谢产物(辅酶Q1id)作为筛选标记，具体以耐高温特性和添加辅酶Qw结构类似物维生素K 3的培养基作为筛选手段，可以直接筛选出目标融合子。本发明方法为一种简单、快捷、高效、经济、实用、安全的酵母融合子构建方法。
【附图说明】
[0028]图1为辅酶Q1。高效液相色谱检测图谱，其中:A为辅酶Q1。标准品，B为目标融合菌株发酵液提取物。
[0029]图2为5号目标融合菌株连续八代培养辅酶Q1。产量图。
【具体实施方式】
[0030]下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
[0031]本发明涉及的菌种:多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha) DL-1，源于中国工业微生物保藏中心，保藏号为ATCC N0.26012 ;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyce spombe)(S.promb 2.1794)，购自中国科学院微生物研究所。
[0032]本发明涉及的培养基:
[0033]DYPD培养基:酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，PH自然，(制备固体培养基需另加入琼脂粉20g/L)。
[0034]2) KCl高渗培养基:酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，KCl 40g/L，PH 自然。
[0035]3)维生素K3选择培养基:于YPD培养基中加入一定量的维生素K 3。
[0036]4)麦芽汁培养基:酵母浸粉3g/L，蛋白胨4g/L，葡萄糖10g/L，麦芽粉10g/L，PH自然(制备固体培养基需另加入琼脂粉13g/L)。
[0037]本发明涉及的试剂:
[0038]I)PB 缓冲液:0.2mol/L NaH2PO4水溶液 87.7mL，以及 0.2mol/L Na 2ΗΡ04水溶液12.3mL配制而成；
[0039]2) PBS缓冲液:14.6g甘露醇溶解于PB缓冲液，定容至lOOmL，备用；
[0040]3)预处理液:以0.05mol/L EDTA水溶液20 μ L，以及β -巯基乙醇20 μ L，溶于20mL PB缓冲液中，备用；
[0041]4) 2.5%蜗牛酶酶液:2.5mg蜗牛酶(sigma)溶解于10mL PBS缓冲液，备用；
[0042]5) KCl高渗缓冲液:5g KCl溶于10mL PB缓冲液，备用；
[0043]6) PEG-CaCl2缓冲液:PEG 6_8g，CaCl20.9g，以及 β -巯基乙醇 40 μ L，溶于 20mL PB
缓冲液，备用。
[0044]本发明所述酵母融合子的制备及快速筛选方法，包括以下步骤:
[0045]一、维生素K3最小抑制浓度的确定
[0046]取粟酒裂殖酵母保藏菌种，以5% (v/v)接种量接种于麦芽汁培养基中，28°C恒温培养，进行菌种活化，至OD5。。为I ;取菌液再次接种于麦芽汁培养基中，接种量为10% (v/v)，28°C恒温培养16h，得粟酒裂殖酵母对数期菌液。取对数期菌液，稀释至浓度为I X 16个/mL，分别涂布于固体维生素K3选择培养基，维生素K3浓度从小到大，分别为0.00,0.04、0.08,0.12,0.16,0.20,0.24mg/mL。28°C恒温培养48h后观察菌落生长情况，以确定维生素1^3的最小抑菌浓度，最终确定最小抑菌浓度为0.16mg/mL。
[0047]二、融合子的制