一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种基于PCR扩增技术快速筛选产龙胆苦巧 重组酵母菌株的方法。
【背景技术】
[0002] 龙胆苦巧（Gentiopicroside)为裂环环締離祗巧类化合物，大量存在于药用植物 秦巧（Gentianamacrophylla，G. macrophylla)中，是评价龙胆属药材的主要指标，具有抗 氧化、抗炎、保肝、利胆及抗肿瘤等作用。但随着临床用药量的增加、野生资源过渡采挖，造 成了秦巧资源的严重匿乏。因此，迫切需要寻求及扩大龙胆苦巧新型药源途径来满足其日 益增长的需求。
[0003] 近年来，寻找和扩大龙胆苦巧药源是一个十分活跃的研究领域，也取得了一定进 展，主要包括W下两个方面；（1)秦巧的人工栽培；（2)利用生物技术提高秦巧中的龙胆苦 巧，包括秦巧组织培养、悬浮细胞培养和毛状根的培养。但是，人工栽培存在周期长、成活率 低、农药残留超标和有效成份较低等弊端；利用组织培养和悬浮细胞培养秦巧细胞生产龙 胆苦巧均存在龙胆苦巧产量不稳定现象，同时在毛状根培养体系中的有效成分产量提高并 不显著。因此，随着秦巧野生药用植物资源日趋减少，W及利用传统植物培养技术生产龙胆 苦巧存在的各种问题，促使利用现代基因工程技术探索获得新型药源途径W期解决龙胆苦 巧来源问题已成为一个潜力巨大的新型策略。
[0004] 低能离子注入技术是在20世纪80年代由中科院合肥物质科学研究院等离子体 所和安徽省农科院科研人员创立并发展起来的新兴交叉学科离子束生物工程学，近几年， 离子束生物工程技术被广泛应用于植物和微生物的品质改良及种质创新，并取得了丰硕成 果。毛培宏等分别通过Ar+和N +注入介导藍麻黄基因组DNA在汉逊酵母中的随机转化，获 得了遗传稳定酵母工程菌，其培养液中麻黄碱和伪麻黄碱的最高产量分别为18. 85mg/L和 4. llmg/L。而利用离子注入介导甘草基因组DNA转化汉逊酵母，获得了遗传稳定的酵母工 程菌，其甘草酸的最高产量达到114. 49mg/L。低能离子注入技术虽然在重组工程菌的构建 上有一定的方向性和目的性，但其也有较大的随机性，即注入后候选重组菌株数量比较大， 所W建立一种高通量的快速筛选方法尤为重要。目前，基于低能离子注入介导的合成生物 学方法构建重组菌株生产天然产物，其所采用的筛选方法一般是依据产物的化学性质设计 特征性化学反应进行分析筛选，如毛培宏等利用低能离子注入方法介导麻黄基因组转化酵 母，其所运用的筛选方法为根据目的产物麻黄碱的特征性颜色反应进行筛选，结果研究人 员从3000多株重组菌株筛选获得9株产麻黄碱酵母重组菌株，但该筛选方法存在工作量 大，筛选效率低，加上颜色反应需要一定产量的目的产物，该严重制约了低能离子注入介导 的合成生物学的广泛运用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种快速筛选产龙胆苦巧重组酵母菌株的方法。
[0006] 为达到上述目的，本发明采用了 W下技术方案：
[0007] 1)重组菌株初筛：将经过低能离子注入介导秦巧总基因组DNA转化处理后的出发 酵母菌株接种至YTO固体培养基上进行培养得到大量转化子（即生长在YTO固体培养基上 的单菌落），提取转化子基因组DNA，W转化子基因组DNA为模板，针对MECT基因、MECPS基 因W及GGPPS基因的特异性片段分别进行S轮PCR扩增，并分别对扩增产物进行核酸电泳 分析，根据电泳分析结果从转化子中筛选得到同时含有MECT基因片段、MECPS基因片段W 及GGPPS基因片段的重组酵母菌株；
[000引2)重组菌株复筛；将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于YTO液体培养基中进行 发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦巧重组酵母菌株。
[0009] 采用上游引物F1和下游引物R1对所述MECT基因的特异性片段进行PCR扩增，上 游引物F1的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，下游引物R1的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 2 所示。
[0010] 采用上游引物巧和下游引物R2对所述MECPS基因的特异性片段进行PCR扩增， 上游引物巧的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，下游引物R2的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 4 所示。
[0011] 采用上游引物F3和下游引物R3对所述GGPPS基因的特异性片段进行PCR扩增， 上游引物F3的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游引物R3的核巧酸序列如SEQ. ID. NO. 6 所示。
[0012] 本发明的有益效果体现在：
[0013] 与现有筛选方法相比，本发明通过依据目的产物龙胆苦巧生物合成代谢途径多个 酶基因作为分子标记，基于多轮PCR扩增技术，对基于低能离子注入介导秦巧总基因组DNA 转化酵母技术所构建的重组酵母菌株进行高通量筛选，极大地简化了产龙胆苦巧重组酵母 菌株的筛选过程，此方法简单、快速、高效、低廉、通用性强，是一种具有广泛运用前景的高 通量筛选方法。
【附图说明】
[0014] 图1为实施例中秦巧总基因组DNA电泳图。
[00巧]图2为实施例中MECT (2-C-甲基-D-赤薛醇-4-磯酸脱氨酷转移酶， 2-C-Methyl-D-e;ryt虹itol4 -地os地atec5ftid}dtransferase)基因 PCR 扩增电泳图，其 中，M为Maker, 1、3为出发菌株，2为秦巧总DNA，4为重组菌株。
[0016] 图3为实施例中MECPS(2-甲基赤薛糖-2, 4-环二磯酸合成酶 (2-C-methyle;ryt 虹 itol 2,4-cycl〇-Di 地 OS 地 ate synthetase)基因 PCR 扩增电泳图，其 中，M为Maker, 1为秦巧总DNA，2为重组菌株，3为出发菌株。
[0017] 图 4 为实施例中 GGPPS (牛儿基二磯酸合酶 Geran5dgeran}d-diphosphate synthase)基因PCR扩增电泳图，其中，M为Maker, 1为秦巧总DNA，2、3、4为出发菌株，5为 重组菌株。
[0018] 图5为实施例中产龙胆苦巧重组菌株HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合附图和实施例对本发明作详细说明。
[0020] 为了对基于低能离子注入介导的合成生物学构建重组菌株提供一种快速、高效、 通用性强的高通量筛选方法。本发明W通过低能离子注入技术将龙胆苦巧合成途径部分基 因或全部相关基因导入到酵母基因组DNA中的重组菌株为筛选对象，通过多次PCR扩增初 步筛选出产龙胆苦巧重组酵母菌株，进而利用HPLC对其进一步分析确定。
[002U 本发明W多形汉逊酵母Dkl (H. polymo巧ha Dkl，来源为ATCC No. 26012)为出发 菌株，利用低能离子注入介导秦巧总基因组DNA随机转化出发菌株。
[00巧 （1)秦巧总基因组DNA的提取：
[0023] 秦巧新鲜嫩叶于陕西太白县秦巧种植基地采集，洗净后置于-20°C下冷冻保存。秦 巧总基因组DNA的提取采用的是经典的CTAB法；秦巧嫩叶剪碎，液氮研磨至细粉状，加入 预热的 2% CTAB 缓冲液（2% CTAB、100mmol/L Tris-肥l、20mmol/L 邸TA、1.4mol/L 化C1、 0. 5% 0-琉基己醇），充分混匀后，65°C温育比（每隔lOmin摇匀一次），4000巧m离屯、 lOmin，取上清液，等体积加入氯仿-异戊醇（24 ; 1)，摇至乳状液，静置lOmin，4000巧m离屯、 20min，取上层水相液体，加入等体积-20°C预冷的异丙醇，有白色絮状物出现，-20°C静置 30min，1200化pm离屯、lOmin，弃去上清液，70%己醇洗漆两遍，于65°C水浴烘干，TE溶解保 存，取20 y L体积进行凝胶电泳检测。结果，秦巧总基因组DNA电泳条带非常清晰整齐（见 图1)，表明所用CTAB法提取的秦巧总基因组DNA纯度高、质量好，非常适合于下个步骤的 PCR扩增。
[0024] (2)筛选体系的建立
[0025] 经龙胆苦巧合成代谢中关键酶的确定及其基因序列的查找，并对其进行引物设 计，W秦巧总基因组DNA为模板进行S轮PCR扩增，优化并确定扩增条件，建立重组菌株的 初步筛选方法；
[0026] 引物设计；根据龙胆苦巧生物合成特点，确定龙胆苦巧合成中的关键酶分别为 MECT、MECPS、GGPPS，然后在NCBI基因数据库中分别捜索其同源基因的蛋白序列，根据 blast蛋白序列比对分别找到其同源性较高的五个蛋白序列，根据codehop网站化饰:// blocks, fhcrc. org/codeh op. html)分别进行特异性引物设计。各个基因的具体特异性引 物序列见表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。
[0027] 表1 MECT、MECPS、GGPPS特异性引物序列 [002引
【主权项】
1. 一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤： 1) 重组菌株初筛：将经过低能离子注入介导秦艽总基因组DNA转化处理后的出发酵母 菌株接种至Yro固体培养基上进行培养得到转化子，提取转化子基因组DNA，以转化子基因 组DNA为模板，针对MECT基因、MECPS基因以及GGPPS基因的特异性片段分别进行三轮PCR 扩增，并分别对扩增产物进行核酸电泳分析，根据电泳分析结果从转化子中筛选得到同时 含有MECT基因片段、MECPS基因片段以及GGPPS基因片段的重组酵母菌株； 2) 重组菌株复筛：将步骤1)筛选得到的重组酵母菌株于YH)液体培养基中进行发酵 培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦苷重组酵母菌株。
2. 根据权利要求1所述一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物Fl和下游引物Rl对所述MECT基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物Fl 的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，下游引物Rl的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示。
3. 根据权利要求1所述一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物F2和下游引物R2对所述MECPS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物 F2的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，下游引物R2的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
4. 根据权利要求1所述一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法，其特征在于： 采用上游引物F3和下游引物R3对所述GGPPS基因的特异性片段进行PCR扩增，上游引物 F3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 5所示，下游引物R3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 6所示。
【专利摘要】本发明提供一种快速筛选产龙胆苦苷重组酵母菌株的方法：1)提取候选菌株基因组DNA，以该基因组DNA为模板，分别进行三轮PCR扩增，根据电泳分析结果筛选得到同时含有MECT基因、MECPS基因以及GGPPS基因的片段的重组酵母菌株；2)于YPD液体培养基中进行发酵培养，通过对发酵培养所得发酵液进行HPLC分析筛选得到产龙胆苦苷重组酵母菌株。本发明极大地简化了产龙胆苦苷重组酵母菌株的筛选过程，方法简单、快速、高效、低廉、通用性强，是一种具有广泛运用前景的高通量筛选方法。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68
【公开号】CN104630355
【申请号】CN201510036732
【发明人】钱卫东, 周颖欣, 王婷, 毛培宏
【申请人】陕西科技大学
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2015年1月23日