检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、评估高血糖人群并发肠癌易感性的试剂 ...的制作方法
【专利说明】检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、评估高血 糖人群并发肠癌易感性的试剂盒及评估方法
[0001] 检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、用于评估高血糖人群并发结直 肠癌易感性的RT-PCR试剂盒及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种引物、试剂盒W及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法； 尤其涉及一种检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物、用于评估高血糖人群并发 结直肠癌易感性的RT-PCR试剂盒及评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法。属于实 时英光定量逆转录聚合酶链反应试剂盒开发与人体病理学相结合的技术领域。
【背景技术】
[0003] 据世界卫生组织（WHO)统计，全世界逾2. 2亿人患有糖尿病，2004年有340万人 死于高血糖引发的严重并发症，至2030年因患糖尿病而死亡的人数将再增加一倍。在年龄 ^ 20岁的中国人群中，糖尿病和糖尿病前期患病率分别为9. 7%和15. 5%，W此推算目前中 国有近一亿成年人患有糖尿病，约1. 5亿成年人处于糖尿病前期，中国已成为世界上糖尿 病患者最多的国家。
[0004] 结直肠癌（colorectal cancer, CRC)是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，全球 每年约100万新发病例，在恶性肿瘤发病率居第3~5位，并呈逐年上升趋势；其死亡率约 为20. 51%，居第4~5位；我国结直肠癌每年新发病例高达13万~16万人，目前患病率已 经高达69. 9/10万，已经成为中国H大癌症之一，全国肿瘤登记中也发布的《2012中国肿瘤 登记年报》统计结直肠癌已达肿瘤发病率、死亡率的第五位，并逐年升高。
[0005] 国内外多项流行病学证实糖尿病与结直肠癌发病率及预后密切相关，高血糖状态 被认为是结直肠癌发病及进展的重要危险因素之一。糖尿病尤其是2型糖尿病与结直肠癌 具有诸多共同的发病风险因素，如服胖、高热量饮食、缺乏运动等。对于某些高血糖人群(尤 其是T2DM患者)可能已成为易患结直肠癌的高危人群。长期的高血糖状态可能通过激活某 些基因表达，进而参与了结直肠癌的发生发展。因此，筛选出可用于高血糖人群并发结直肠 癌易感性预警、病程及预后评估的糖尿病并发结直肠癌分子标志物，进而进行有针对性地 早诊早治，对肿瘤患者的病程及预后判断、治疗方案制定、生存率提高及生活质量的改善均 具有重要意义。
[0006] 1983 年My llis 发明了聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)技术。 PCR技术是一种体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、快速、简便等突出优点。应用 PCR技术可W使特定的基因或DNA片段在很短的时间内体外扩增数十万至百万倍。由于该 项技术具有简便快速、特异性和灵敏度高、重复性好等突出优点，因此被广泛应用于基础研 究和临床诊断。但是传统的PCR技术在应用中存在着不能对特定mRNA进行准确定量，W 及操作过程中易污染而使得假阳性率高等缺点，因此不能够满足实际工作需要，使其应用 受到限制。
[0007] 随着实时英光定量PCR (real time quantitative PCR, qPCR)的出现，人们可W 真正做到对PCR样本中微量mRNA的精确定量。qPCR是在PCR反应体系中加入英光基团，利 用英光信号累积实现实时监测整个PCR进程，并能对起始模板进行定量分析。RT-PCR需要 英光探针参与，在PCR的反应体系中加入一对含有待测基因特定碱基的引物序列，该引物 序列能与模板核酸发生特异性杂交。PCR每复制一个核巧酸片段，就有一个英光信号被释 放出来，产物与英光信号产生一对一的对应关系。随着产物的增加，英光信号亦随之增强， 当信号增强到某一阔值时(根据英光信号基线的平均值和平均标准差，计算出99. 7 %的置 信度大于平均值的英光值，即为阔值)，此时的循环次数即循环阔值Ct (cycle t虹eshold， Ct)被记录下来。该循环参数Ct和PCR体系中起始模板数的对数之间有严格的线性关 系。利用不同梯度的阳性定量标准模板扩增的Ct值和该阳性定量标准的模板数经过对数 拟合制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值就可W准确的确定起始模板的数量，因此根据 PCR产物的英光强度即可计算出初始模板的数量。实时英光定量PCR具有特异性强、灵敏 度高、定量准确、操作安全等优点，使用该方法扩增特异性mRNA,是一种高灵敏度、高特异 性、操作简便的方法。
[0008] 因此，本领域迫切希望利用RT-qPCR技术将高血糖人群的状态予W监控，届时将 容易地评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患者的 早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率具有 重大的应用价值。
【发明内容】
[0009] 为了解决上述技术问题，本发明提供了检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的 RT-PCR 引物。
[0010] 本发明解决上述问题的技术方案如下： 检测血清中HDAC1 mRNA转录水平的RT-PCR引物： 引物 F ;5, -GCTCCACATCAGTCCTTCC -3,；引物 R ;5, - GGTCGTCTTCGTCCTCATC-3,。
[0011] 本发明的还提供了另一种技术方案，如下： 检测血清中HDAC1 mRNA转录水平用于评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的RT-PCR 试剂盒，包含上述RT-PCR引物。
[0012] 作为上述技术方案的优选，还包含内参引物，所述内参引物如下： 引物 F ;5' -CACCCACTCCTCCACCTTTG-3' ； 引物 R ;5' -CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
[0013] 作为上述技术方案的优选，还包含RNA提取试剂、逆转录试剂和PCR反应液； 所述RNA提取试剂的组分及浓度如下；Trizol试剂355~800ml、氯仿200~400 y L、 异丙醇600~1000 y L、无水己醇1. 75~5. 00血、DEPC水290~1000 y L ; 所述逆转录试剂组分及浓度如下；150~250U/ y L逆转录酶2 y L、4~6 X逆转录缓 冲液 4uL、12 ~50 mmol/L dNTPs 4uL、0. 1 ~1.2mol/L DTT 2y L、35 ~45U/UL RNA 酶 抑制剂0. 5 y L ; 所述PCR反应液组分及浓度如下；Syber Green I英光核酸染料25 y L、DM聚合酶 100U/ml、dNTPs 0. 2 mmol/L、氯化镇 6 mmol/L、H轻甲基氨基甲焼盐酸盐 16. 5 mmol/L、氯 化钟 89. 3 mmol/L、DEPC 水 50 y L ~60 y L。
[0014] 作为上述技术方案的优选，所述Trizol试剂具体为；重蒸苯酷200mL、8-羟基唾晰 0. 2g、目-琉基己醇1. 2g /二硫苏糖醇0. 5g、异硫氨酸脈lOOg、蒸觸水118血、0. 75M 巧樣酸轴7. 04血、10%十二烷基肌氨酸轴10. 56血和2M醋酸轴20血。
[0015] 作为上述技术方案的优选，逆转录反应体系如下： 引物F luL、 引物R luL、 RNA 模板 2 y L、 逆转录酶 2uL、 5 X逆转录缓冲液 4uL、 25mM dNTPs 4 y L、 0. 1 M DTT 2y L、 RNA酶抑制剂 0. 5 y L DEPC水 余量 总体积 20 uL。
[0016] 作为上述技术方案的优选，扩增体系如下： 引物F luL、 引物R luL、 cDNA 模板 2 y L、 SYBR Green I英光核酸染料 2 y L DEPC水 余量 总体积 50 uL。
[0017] 本发明的再一个目的是提供通过检测血清中HDACl mRNA转录水平来评估高血糖 人群并发结直肠癌易感性的方法，其技术方案如下： 通过检测血清中HDAC1 mRNA转录水平来评估高血糖人群并发结直肠癌易感性的方法， 包括W下步骤： 一、血清总RNA的提取 (1) 收集评估对象的清晨空腹外周静脉血5ml，置于冷冻离也机中，4C下调整转速 2500-3000 r/min,离也8-lOmin后用无菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; (2) 将上述血清加入含有1血Trizol试剂的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于 冰上； (3) 置于超净台中，温育5min，12000r/min，离也lOmin ; (4) 吸上清于新的1. 5血离也管中，加入200y L的氯仿，摇匀，室温静置2min，4°C， 12000;r/min，离也 lOmin ; (5) 吸取上清于新的1.5血离也管中，加入600 uL的异丙醇，混合均匀，室温静置 15min，4°C，12000r/min，离也 15min,弃上清； (6) 加入1血75%的无水己醇漂洗沉淀，4°C，12000r/min，离也5min,弃上清；所述75% 的无水己醇的组成为750 y L无水己醇+250 y L DEPC水； (7) 加入1血无水己醇，漂洗沉淀，4°C，12000r/min，离也5min，弃上清，室温干燥 lOmin ； (8)加入40 y L的DEPC水溶解RNA，置于-8(TC冰箱保存备用； 二、逆转录合成cDNA 采用上述RT-PCR试剂盒进行逆转录，反应程序；42°C，50min ;85°C，5min ;反应结束