后 离也，置于-2(TC保存； H、Realtime PCR 扩增 采用上述RT-PCR试剂盒进行扩增，反应程序如下；95°C，10min;95°C，15Sec; 60。 lmin;95〇C，15 Sec;60〇C，15 Sec; 四、验证目的基因表达 分析统计HDAC1 mRNA的相对表达量，采用SDS 2. 3软件分析结果，Ct为每个反应管内 的英光信号到达设定的阔值时所经历的循环数，采用比较Ct值法计算样本中HDAC1 mRNA 相对表达量；计算2'（- A Ct)值表示样品中目的基因初始mRNA相对表达量，A Ct是同一 个样本中目的基因Ct值减去内参Ct值；按2' (- A Ct)换算成基因表达量；W样本2的 2'（- A Ct)值校正为1作为参照，计算出目的基因的相对表达量；使用SPSS19. 0统计软件， 计数数据W均数+标准差。二巧表示；W户< 0. 05为差异有统计学意义，W户< 0. 01为 差异有显著统计学意义。
[0018] 本发明上述方法不属于专利法25条第3款规定的疾病的诊断与治疗方法。原因 如下；其一，该方法在体外实施；其二，根据该方法得出的结果，无论好坏都不能直接作为 判断疾病与否的指标，该结果只能用于评估特定人群(糖尿病患者，尤其是2型糖尿病患者） 将来患结直肠癌的可能性，W及对其当前健康状况的评估，有助于糖尿病并发结直肠癌的 早期预警、早诊早治、预后评估。
[0019] 目前国内外尚未见关于高血糖状态并发结直肠癌的特异性分子标志物的报道。
[0020] 本研究组收集了 391名结直肠癌患者的初入院空腹血糖值，统计不同血糖水平结 直肠癌患者所占百分比，并析不同血糖水平与临床病理参数的相关性。我们发现，高血糖并 发的结直肠癌患者高达29. 67%，高血糖并发结直肠癌的患者肿瘤直径更大、分化程度更差， 提示血糖水平可明显影响结直肠癌患者的肿瘤恶性程度及进展程度。
[0021] 本研究组采用Illumina Hiseq第二代测序平台对并发及不并发高血糖的结直肠 癌肿瘤组织及正常肠组织样本分别进行了高通量转录组测序，通过信息学分析后，初步筛 选了一批在糖尿病并发结直肠癌组织中表达量具有显著差异的分子标志物。为进一步验 证上述筛选的分子标志物对于高血糖并发结直肠癌病程及预后评估的可靠性，我们收集了 120例结直肠癌患者肿瘤、正常组织及血清样本，收集了 120例糖尿病患者血清样本，检测 上述两类患者初入院时清晨空腹血糖水平，根据血糖水平及良恶性分类后，进一步采用实 时定量PCR法验证了上述两类患者相关样本中特异性分子标志物的mRNA水平。
[0022] 我们的验证结果发现，组蛋白去己醜化酶化istone deacet^ase 1, HDAC1)在并 发高血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于并发高血糖结直肠癌患者的正 常肠组织，在正常血糖的结直肠癌患者肿瘤组织中的表达水平显著高于正常血糖的结直肠 癌患者正常肠组织。而在正常肠粘膜细胞及健康人群外周血中不表达或低表达。我们认为 HDAC1在高血糖状态下并发结直肠癌的发生发展中具有较高的特异性及灵敏性，可W作为 糖尿病并发结直肠癌的标志物之一。
[0023] HDACl是一类蛋白酶，对染色体的结构修饰和基因表达调控发挥着重要的作用。一 般情况下，组蛋白的己醜化有利于DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各 种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性结合，激活基因的转录。在细胞核内， 组蛋白己醜化与组蛋白去己醜化过程处于动态平衡，并由组蛋白己醜化转移酶（histone acet}dtransferase, HAT)和组蛋白去己醜化酶化istone deacet}dase, HDAC)共同调控。 HAT将己醜辅酶A的己醜基转移到组蛋白氨基末端特定的赖氨酸残基上，HDAC使组蛋白去 己醜化，与带负电荷的DNA紧密结合，染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制。在癌细胞中， HDAC的过度表达导致去己醜化作用的增强，通过恢复组蛋白正电荷，从而增加DNA与组 蛋白之间的引力，使松弛的核小体变得十分紧密，不利于特定基因的表达，包括一些肿 瘤抑制基因。组蛋白去己醜化酶抑制剂化istone deacet^ase inhibitors, HDACi)则可 通过提高染色质特定区域组蛋白己醜化，从而调控细胞调亡及分化相关蛋白的表达和稳定 性，诱导细胞调亡及分化，成为一类新的抗肿瘤药物。皿ACi不仅对多种血液系统肿瘤和实 体瘤具有良好的治疗作用，而且具有肿瘤细胞相对较高选择性和低毒的优点。而2011年 化化re杂志报道的研究发现HDAC1在2型糖尿病中发挥重要的调控血糖作用。
[0024] 综上所述，本发明的有益效果是： 1、 本发明产品将通过检测高血糖状态人群外周静脉血清样本中HDAC1 mRNA表达水 平，可用于评估高血糖人群并发结直肠癌的易感性及预后，有助于糖尿病并发结直肠癌患 者的早期预警、早诊早治、预后评估，对于降低我国糖尿病、结直肠癌的高发病率、高致死率 具有重大的应用价值； 2、 本发明建立了利用特异性引物检测外周静脉血清HDAC1 mRNA的方法；由于本方法 采用了定量PCR扩增技术，使得检测HDAC1 mRNA的敏感性大大提高，能保证在极少的标本 中获得足够的信息； 3、 本发明还提供了作为阳性对照術准品)的含有高表达HDAC1基因的cDNA模板(体积 2y L);标准品碱基序列为；GGCATCTGGCTTCTGTTACGTCAATGATATCGTCTTGGCCATCCTGGAACTGCT AAAGTATCACCAGAGGGTGCTGTACATTGACATTGATATTCACCATGGTGACGGCGTGGAAGAGGCCTTCTACACCA CGGACCGGGTCATGACTGTGTCCTTTCATAAGTATGGAGAGTACTTCCCAGGA ； 4、 本发明还提供了作为阴性对照的不表达或低表达HDAC1基因的cDNA模板(体积 2y LX
【附图说明】
[0025] 图1显示的是本发明血清样本提取总RNA琼脂糖凝胶电泳； 图2显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本1的RNA样品完整性； 图3显示的是本发明Agilent 2100芯片检测样本2的RNA样品完整性； 图4显示的是本发明HDAC1 mRNA扩增动力学曲线； 图5显示的是本发明GAPDH mRNA扩增动力学曲线； 图6显示的是本发明HDAC1 mRNA的相对表达量。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明进一步说明。但应明确，本文上述说明W及下述实施例 仅是用作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。
[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[002引 1.引物设计和合成 1. 1 HDAC1基因引物设计与合成 拟扩增的HDAC1基因标准品序列为HDAC1基因第10、11外显子区1089-1264碱 基，WHDAC1全长mRNA序列为模板设计引物。标准品PCR上游引物F序列为；5'-GCTCCACATCAGTCCTTCC -3,；下游引物 R 序列为；5, - GGTCGTCTTCGTCCTCATC -3，。
[0030] 1.2 GAPDH基因引物设计与合成 拟扩增的内参照基因人类甘油酵-3-磯酸脱氨酶（GAPDH)序列为GAPDH基因第6、7外 显子区1065-1174碱基，W GAPDH长mRNA序列为模板设计引物，GAPDH基因上游引物F序列 为；5' -CACCCAC TCCTCCACCTTTG-3' ；下游引物 R 序列为；5' - CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。
[0031] 2.含有高表达HDAC1基因的cDNA模板、不表达或低表达HDAC1基因的cDNA模板 制备方法 2. 1有关试剂的配制： (1) DEPC水配制方法： 在1000血的双重蒸觸水（dd&O)中加入ImLDEPC原液，磁力揽拌器揽拌过夜。
[0032] (2) 1 mol/L Tris.CKpH =8. 0)配制方法；800 血蒸觸水中溶解 121. 1 g Tris， 加浓肥1调抑至8. 0,定容至1 L，高压灭菌备用。
[0033] (3) 50XTAE缓冲液配制方法；500血双蒸水中溶解242 g Tris，加入100血0. 5 mol/L邸TA (pH =8. 0)、57. 1血冰己酸，定容至1 L，室温保存备用。
[0034] 2. 2血清总RNA的提取 (1) W邸TA-K2抗凝真空负压采血管收集特定人群1、特定人群2的清晨空腹外周静脉 血各5ml (分别为样本1、样本2)，置于冷冻离也机中，4°C下调整转速2500-3000 r/min，离 也8-lOmin后用无菌吸管吸取血清2 ml~3ml ; (注：特定人群1 :高血糖并发结直肠患者：该类患者在未使用降糖药的情况下年平 均空腹血糖水平八.77mmol/L、肿瘤组织在手术切除后经病理科确诊为结直肠癌；特定人 群2 ;糖尿病(未并发肿瘤病）患者；该患者在未使用降糖药的情况下月平均空腹血糖水平 〉7. 77mmol/L、经超声影像学/肠镜活检病理检查无结直肠肿瘤者） (2) 将上述血清加入含有ImL Trizol的匀浆管中，于匀浆机匀浆20sec，立即放于冰 上； (3) 置于超净台中，温育5min，12000r/min，离也lOmin ; (4) 吸上清于新的1.5血离也管中，加入200UL的氯仿，摇匀，室温静置2min，4°C， 12000;r/min，离也 l