羊驼毛成分的实时荧光pcr检测用的引物和探针的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种利用核酸扩增技术进行动物源性成分快速检测的方法，具体讲是 设及一种羊驼毛成分的实时巧光PCR检测用的引物和探针。
【背景技术】
[0002] 羊驼的英文名是Alpaca,是骆驼科动物的一种，其祖先是弓大马。羊驼浑身是宝，其 产生的羊驼毛纤维是世界上著名的高级动物纤维之一，W其奢华的手感和光泽著称。由于 羊驼毛纤维含有髓腔，其保温性优于其他纤维，具有抗皱性、耐磨性、保湿性等优良特性。用 它制成的时装轻柔暖和，穿着舒适，悬垂性好，色彩鲜艳，阳光照射下还发出五彩光，颇受消 费者的喜爱，成为继羊绒之后又一种高档特种动物纤维产品。鉴别羊驼毛一般采用显微镜 法，微观结构法和扫描电镜法等。但该些方法都存在一定的不足，甚至某些情况下无法准确 鉴别。自1975年化a壯ied等成功地从头发中提取DNAW来，发毛已成为法医学、遗传学常 用的检测材料之一。近年来，DNA法鉴别动物纤维的报道常见于各类报纸杂志，该方法的关 键是DNA的提取，提取成功与否决定了能否鉴别纤维。有关毛干DNA提取及检测的报道已 屡见不鲜，但关于羊驼毛DNA提取及检测方面的报道较少。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对羊驼毛线粒体COX I基因序列，设计一组特异性引物和探针， 进而建立一种快速检测羊驼毛DNA方法，W克服传统的显微镜法难W准确判定的局限性， 为羊驼毛成分检测提供有效工具，W期与传统鉴别方法相结合，提高羊驼毛鉴别的客观性 和准确度。
[0004] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[000引羊驼毛成分的实时巧光PCR检测用的引物和探针：
[0006] 上游引物；5 ' -GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3 '
[0007] 下游引物；5 ' -ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3，
[0008] 探针；5 ' -CAACATTAAATGATCCCCCG-3 '。
[0009] 所述探针为化qMan探针，其5'端标记有报告巧光集团，3'端有泽灭巧光集团。
[0010] 所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物；下游引 物；探针=1 ;1 ;1 ;其检测过程如下：
[0011] (1)待检样品DNA的提取
[0012] 采用普通酪-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒提取羊驼毛的DNA。
[001引 （2)羊驼毛成分的实时巧光PCR扩增
[0014] A.在反应管中加入 Premix Ex Taq(2X)12. 5uL，Primer F(10yM)
[00巧]1 y L，Primer R(10 y M) 1 y L，Probe 巧 y M) 1 y L，DNA*2 y L，地207. 5 y L，Total 25 y L。
[0016] B.将PCR反应管放入巧光定量PCR仪，按下述反应条件完成PCR扩增；
[0017] 95 °C 30sec，1 个循环，95 °C 5sec，60 °C 30sec，40 个循环，PCR 扩增。Negative control反应时，加入RNase free地20;Positive反应时，做2个平行样。
[001引 做应用巧光定量PCR仪随机软件，分析扩增结果
[0019] 反应结束后，设置无效基线范围；基线范围选择在3~15个循环，如果有强阳性样 本，根据实际情况调整基线范围。阔值设置原则W基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的 最高点，且Ct值=40为准，设置阔值后，分析样品的检测结果。
[0020] 待测样品羊驼毛成分检测ct值大于或等于40,阴性对照、阳性对照和空白对照结 果正常者，则可判定该样品未检出羊驼毛成分。
[0021] 待测样品羊驼成毛分检测ct值小于或等于36,阴性对照、阳性对照和空白对照结 果正常者，则可判定该样品检出羊驼毛成分。
[0022] 待测样品羊驼毛成分检测Ct值在36~40之间，应重做实时巧光PCR扩增。再次 扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该 样品检出羊驼毛成分；再次扩增后结果Ct值大于40,且阴性对照、阳性对照和空白对照结 果正常，可判定该样品未检出羊驼毛成分。
[0023] 本发明采用实时巧光PCR技术，该技术特异性强、灵敏度高、操作简便，特别适用 于一些成分复杂的纤维制品中鶴绒成分的检测。
【附图说明】
[0024] 图1PCR特异性检测结果；
[002引 图2羊驼毛DNA巧光PCR结果；
[0026] 图3巧光PCR灵敏度检测结果；
[0027] 图4重复性PCR结果；
[002引图5重复性巧光PCR结果；
[0029] 图6重复性巧光PCR结果；
[0030] 图7重复性巧光PCR结果。
【具体实施方式】
[0031] 具体结合实施例对本发明做进一步说明。
[003引羊驼毛成分的实时巧光PCR检测用的引物和探针：
[0033] 上游引物；5，-GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3 '
[0034] 下游引物；5 ' -ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3，
[0035] 探针；5, -(FAM) CAACATTAAATGATCCCCCG(Eclipse) -3,。
[0036] 所述探针为化qMan探针，其5'端标记有报告巧光集团，3'端有泽灭巧光集团。
[0037] 所述引物和探针应用于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物；下游引 物；探针=1 ;1 ;1。
[00測 实施例1
[0039] 1、从纤维制品的不用部位取样，共取约Ig试样；用剪刀将样品剪碎，经分析研磨 机打散混匀，再用剪刀尽量剪碎至2mm W下，再次用分析研磨机混匀；
[0040] 2、从混匀的样品中称取约5mg试样，放入2mL离屯、管中，每个试样平行提取2管， 加入180 y L的缓冲液化炬uffer GL)、20 y L的蛋白酶K(Proteinase K)和10 y L的核糖 核酸酶A(RNase A, lOmg/mL)，于56°C水浴温浴至组织完全裂解3小时；如残存纤维状组 织无法完全裂解，裂解之后先12, OOOrpm离屯、2分钟，去除杂质之后再进行后续操作。向 裂解液中加入 200 yL缓冲液GB炬ufferGB)和 200 yL100%己醇，充分吸打混匀。温浴 时可时常将样品取出进行振荡或吸打W加速裂解。将离屯、管（Spin Column)安置于收集 管（Collection Tube)上，溶液移至Spin Column中，12, 000巧m离屯、2分钟，弃滤液。将 500 y L的缓冲液WA炬uffer WA)加入至Spin Column中，12, 000巧m离屯、1分钟，弃滤液。 将700 y L的缓冲液WB炬uffer WB)加入至Spin Colu皿中，12, 000巧m离屯、1分钟，弃滤 液。确认Buffer WB中已经加入了指定体积的100%己醇。沿Spin Column管壁四周加入 Buffer WB，该样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。然后重复上述加缓冲液WB操作步骤 一次。将 Spin Column 安置于 Collection I\ibe 上，12, 000巧m离屯、2 分钟。将 Spin Column 安置于新的1. 5血的离屯、管上，在Spin Column膜的中央处加入50 y L的灭菌水或洗脱液 巧lution Buffer),室温静置5分钟。将灭菌蒸馈水或Elution Buffer加热至65°C使用时 有利于提高洗脱效率。12, OOOrpm离屯、2分钟洗脱DM。如需获得更大收量，可将离下液重 新加入到Spin Column膜的中央或再加入50 yL的灭菌水或Elution Buffer,室温静置5分 钟后，12,000巧m离屯、2分钟洗脱DNA。W上操作中的BufferGL、BufferWA、BufferWBW 及Spin columruCollection I\ibe均来自宝生物工程（大连）有限公司TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver. 5. 0 试剂盒。
[0041] 3、PCR反应体系
[0042]
【主权项】
1. 羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针，其特征在于： 上游引物：5' -GCTTATTTTACATCCGCCACAA-3' 下游引物：5 ' -ACCTCCTACGGTGAACAGGAA-3 ' 探针：5' -CAACATTAAATGATCCCCCG-3'。
2. 根据权利要求1所述的羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针，其特征在 于：所述探针为TaqMan探针，其5'端标记有报告荧光集团，3'端有淬灭荧光集团。
3. 如权利要求1所述的所述羊驼毛成分的实时荧光PCR检测用的引物和探针，其应用 于羊驼毛成分的PCR检测，其体积比为：上游引物：下游引物：探针=1 :1 :1。
【专利摘要】本发明属于羽绒制品中动物源性成分的定性检测技术，具体地说是检测纤维制品中羊驼成分的引物/探针组。本发明选取羊驼毛的线粒COXⅠ基因序列，设计一组特异性引物和探针。使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可快速、灵敏、特异地检测纤维制品中的羊驼成分。该引物和探针也可以试剂盒的形式和其他试剂一起提供，用于核酸扩增反应。该法操作简便、重复性好。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104630344
【申请号】CN201410835802
【发明人】王玫, 任亮, 孔平, 杨春光, 颜怀玉, 肇慧君, 李晶泉, 张 浩
【申请人】中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局, 宝生物工程（大连）有限公司
【公开日】2015年5月20日
【申请日】2014年12月29日