用于急性冠脉综合征早期诊断的循环miRNAs及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于急性冠脉综合征早期诊断的循环 mi RNAs及相关应用。
【背景技术】
[0002] 急性冠脉综合征（AC巧包括急性也肌梗死（AMI)和不稳定性也绞痛扣A)，是最凶 险的也血管疾病，也是导致世界范围内也血管病死亡率和发病率的主要原因。近年，我国急 性冠脉综合征（AC巧发病率呈快速升高趋势。中国多省市队列研究（CMC巧显示，与上世纪 90年代初北京地区也血管病人群监测（MONICA)研究相比，我国ACS发病率升高近1倍，达 114例/10万?人年。全国每年死于也血管病的患者有350万，因急性冠脉综合征（AC巧死 亡的人数为70万，是我国每年车祸死亡总人数的7倍。在美国每年有近200万的患者发作 急性冠脉综合征（ACS)，其中有80万为AMI，在AMI中有近213, 000的患者死亡，近1/2的患 者在症状出现后1小时W内、赶至医院前死亡。指南推荐，在ACS发生后最好在化内进行血 运重建，W挽救缺血也肌，预防也脏衰竭，最终降低死亡率（化mm CW, Bassand JP, Agewall S, et al. Esc guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent st-segment elevation:The task force for the management of acute coronary syndromes(acs)in patients presenting without persistent st-segment elevation of the european society of cardiology(esc). Eur 化art J. 2011 ;32:2999-3054)。因此，ACS患者的早期准确诊断，是及时进行缺血也肌再灌 注治疗的保证，对改善患者预后有重要意义。
[0003] 目前对急性冠脉综合征的诊断，是基于典型症状、也电图和也肌巧蛋白（cTnl和 C化T)做出的，但该些诊断标准都各有其局限和不足。急性冠脉综合征的典型症状包括长 时间胸痛、呼吸急促和恶也，但是在老年患者、非ST段抬高型也肌梗死（NSTEMI)患者及糖 尿病患者中，症状常不典型或缺乏症状。另外，左束支传导阻滞、也脏起搏器、慢性缺血型也 肌病或陈旧性也梗都可能造成急性冠脉综合征也电图的不典型改变。特别是，被认为急性 冠脉综合征诊断金标准的生物学标志物也肌巧蛋白C化I，并不能区别不稳定性也绞痛和稳 定性也绞痛患者，而且由于也肌巧蛋白在肺栓塞和肾衰等多种疾病状态下也会发生改变， 使其诊断价值大打折扣；并且也肌巧蛋白水平升高，仅能提示也肌损伤，而不能说明损伤机 巧;也肌巧蛋白要在冠状动脉阻塞6-12小时后才能检测出，即便是高敏肌巧蛋白也要在也 肌梗死发生3小时后才能检测出。因此，寻找新的、敏感、特异生物标志物，对ACS的早期诊 断，具有重大意义。
[0004] microRNA (简称miRNA)参与动脉粥样硬化发展、斑块破裂、血小板活化和凝集、W 及冠状动脉闭塞后也肌细胞死亡过程。很多miRNAs的表达具有组织特异性，并可进入包括 血浆和尿液在内的体液中，有望成为急性冠脉综合征的潜在生物学标志物。近期研究表明， 有些 miRNAs,如 miR-1、miR-133a、miR-208、miR-208a、miR-208b、miR-499 和 miR-499-5p, 在急性也肌梗死时选择性和/或高表达，被认为是也肌损伤的生物学标志物。然而，该些 miRNAs中，最早的也要在急性也肌梗死症状出现后4小时才能检出，使得该些miRNAs难W 作为急性冠脉综合征的早期诊断生物学标志物。
【发明内容】
[0005] 本发明的主要目的在于寻找能够用于急性冠脉综合征早期诊断的敏感、特异性生 物学标志物，并提供其相关应用。
[0006] 本案发明人通过一系列的研究证明，miR-122、miR-3149特别是二者组合可用于急 性冠脉综合征的早期诊断。在此基础上，还可W进一步结合miR-140-3p、miR-720和/或 miR-2861。研究表明，急性冠脉综合征患者的循环miR-122、miR-140-：3p、miR-720、miR-2861 和miR-3149比非急性冠脉综合征患者显著上调，ROC曲线下面积AUC分别是0. 838、0. 818、 0. 865、0. 852和0. 670,特别是同时用miR-122、miR-2861和miR-3149诊断急性冠脉综合征 时，AUC甚至可达0. 925。猪急性也肌梗死模型动物实验表明，冠状动脉结扎后180-240分 钟，血浆miR-122水平上调，30-240分钟后，循环的miR-3149表达也上调，而血浆cTnl水平 在急性也肌梗死发生240分钟时与假手术组间仍无表达差异。
[0007] 据此，一方面，本发明提供了循环miRNAs作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志 物的应用，其中，所述循环miRNAs包括miR-3149和/或miR-122。
[0008] 根据本发明的具体实施方案，本发明的可作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志 物中，所述循环miRNAs还包括miR-2861。
[0009] 更进一步的，本发明的可作为急性冠脉综合征的早期诊断的标志物中，所述循环 miRNAs 还包括 miR-140-化和 / 或 miR-720。
[0010] 另一方面，本发明还提供了检测循环miRNAs的表达水平的试剂在制备用于急性 冠脉综合征的早期诊断的组合物中的应用，其中，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂 包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂。
[0011] 根据本发明的具体实施方案，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括检 测miR-2861的表达水平的试剂。
[0012] 更进一步的，所述检测循环miRNAs的表达水平的试剂还包括检测miR-140-化和 /或miR-720的表达水平的试剂。
[0013] 可W应用所属领域中任何可行的方法检测所述miRNAs的表达水平。例如，可采用 W下任意一种方法检测所述miRNAs的表达水平；Nothern blot方法；即首先通过电泳将不 同的RNA分子依据其分子量大小加W区分，然后与特定miRNA补配对的探针杂交来检测目 的miRNA。具体步骤为；首先提取总RNA，然后RNA样本经过电泳依据分子量的大小被分离， 再将胶上的RNA分子被转移到膜上并W烘烤或者紫外交联的方法加W固定，应用生物素、 放射性同位素标记的探针与膜上的RNA、杂交，经信号显示后表明待测miRNA表达。实时英 光定量PCR (实时定量RT-PCR或qPCR) W及qPCR Array (即将检测不同基因表达的反应体 系排列于同一反应板上进行同时检测）：即将RNA逆转录成cDNA后，再应用实时英光定量 PCR方法（qPCR)对miRNAs表达进行检测的方法。具体步骤为；提取总RNA后，应用茎环法 或末端加尾法等方法逆转录成cDNA，再通过qPCR (如化qman探针法、SybrGreen染料法等） 进行实时英光定量PCR。应用比较Ct法，计算miRNAs与内参基因的相对表达量。miRNA芯片 技术；分离纯化的miRNAs经过逆转录及第二链cDNA合成（有些需要预扩增）进行标记后， 与芯片上的miRNA探针杂交，通过对信号的采集及数据分析，确定miRNA表达谱及表达量的 方法。高通量测序法；提取总RNA后，从中分离纯化小RNA，然后连接5'和3'接头，合成第 一链及第二链cDNA，PCR扩增测序文库，应用二代测序技术（如罗氏454、illumina Solexa 或Life Tech. S化id平台），进行高通量测序。结果经数据分析，并与miRBase、rRNA、tRNA、 RefSeq等数据库比对，对已知miRNAs进行注释，并测序得到的序列与该物种全基因组序列 进行比对分析通过数学模型（如折叠模型）预测新的miRNAs。
[0014] 从而，本发明的检测循环 miRNAs (miR-3149、miR-122、miR-2861、miR-14〇-化和 / 或miR-720)的表达水平的试剂可W包括；采用Nothern blot方法检测循环miRNAs的表达 水平的试剂，采用qPCR或qPCR Array技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，采用miRNA 芯片技术检测循环miRNAs的表达水平的试剂，或者采用高通量测序法检测循环miRNAs的 表达水平的试剂。
[0015] 另一方面，本发明还提供了一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的组合物，该 组合物包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测 miR-2861的表达水平的试剂，更进一步优选还包括检测miR-140-化和/或miR-720的表达 水