平的试剂。
[0016] 另一方面，本发明还提供了一种用于急性冠脉综合征的早期诊断的试剂盒，该 试剂盒包括检测miR-3149和/或miR-122的表达水平的试剂，进一步优选还包括检测 miR-2861的表达水平的试剂，更进一步优选还包括检测miR-140-化和/或miR-720的表达 水平的试剂。
[0017] 根据本发明，当临床症状和也电图改变不典型患者血浆循环miRNAs ;miR-122、 miR-140-3p、miR-720、miR-2861、miR-3149的水平显著升高时，应高度怀疑急性冠脉综合 征并采取进一步诊疗措施。特别是当miR-122、miR-2861和miR-3149同时升高和/或 miR-122、miR-3149同时升高时，对于ACS症状临床不典型患者的鉴别诊断意义更大（R0C 曲线下面积AUC分别为0. 925和0. 843)。本发明的实施例4中，ACS患者较non-ACS患者 miR-122、miR-140-：3p、miR-720、miR-2861 和 miR-3149 变化的倍数分别为 20. 7、14. 7、49. 4、 27. 6 和 12. 5 倍。
[0018] 从而，在本发明的技术方案中，当临床症状和也电图改变不典型的待测个体样品 中血浆循环miRNAs的表达水平相较于非急性冠脉综合征患者（non-AC巧显著升高时，贝U 可评估个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。例如，当待测个体样品中miR-122的水平 升高时，当待测个体样品中miR-140-化的水平升高时，当待测个体样品中miR-720的水平 升高时，当待测个体样品中miR-2861的水平升高时，和/或当待测个体样品中miR-3149 的水平升高时，则可评估个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。特别是，当miR-122和 miR-3149的水平同时升高，更优选是当miR-122、miR-2861和miR-3149的水平同时升高， 则个体罹患急性冠脉综合征的危险性增大。
[0019] 本发明的标志物具有高敏感度和特异性，对于急性冠脉综合征的早期诊断具有重 要意义。
【附图说明】
[0020] 图1A-1至图1G-2 ;应用qRT-PCR检测各miRNA在非冠也病、稳定性也绞痛、不稳 定性也绞痛和急性也肌梗死四组患者血浆样本中的表达分析结果。图中缩写；c皿=冠也 病、SA =稳定性也绞痛、UA =不稳定性也绞痛、AMI =急性也肌梗死。
[0021] 图2A-1至图2E-2 ;应用qRT-PCR检测另一人群样本中miR-122、miR-140-化、 miR-720、miR-2861和miR-3149的表达分析结果。图中缩写；CHD =冠也病、SA =稳定性也 绞痛、UA =不稳定性也绞痛、AMI =急性也肌梗死。
[0022] 图3A-1至图3F ;训练数据集中急性冠脉综合征和非急性冠脉综合征患者血浆 miR-122、miR-140-：3p、miR-720、miR-2861 和 miR-3149 表达差异分析结果。
[0023] 图4A至图4G;猪急性也肌梗死模型中循环miR-122、miR-140-：3p、miR-720、 miR-2861和miR-3149表达差异分析结果。缩写；AMI-NVF =急性也肌梗死无室颤、AMI-VF =急性也肌梗死合并室颤，ISCH =缺血，Sham =假手术。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合具体实施例及附图进一步阐明本发明。应理解，该些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照 所属领域的常规操作、或按照制造厂商所建议的操作条件进行。
[00巧]各实施例中研究受试者入选标准：
[0026] 本发明研究收入了 2012年2月到8月间到中国医学科学院阜外也血管病医院也 内科就诊的具有胸闷、胸痛症状的患者，共包括115例急性也肌梗死患者和456例非急性也 肌梗死患者。急性也肌梗死患者[包括ST段抬高也肌梗死（STEMI)和非T段抬高也肌梗 死（NSTEM)]，临床诊断标准为：急性缺血性胸痛、也电图巧CG)改变，生化标记物（C化I〉0. 1 ng/ml)和冠状动脉造影结果（2011，欧洲也脏病学会）（化臟CW, Bassand JP, Agewall S, et al.Esc guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent st-segment elevation:The task force for the management of acute coronary syndromes(acs)in patients presenting without persistent st-segment elevation of the european society of cardiology(esc). Eur Heart J. 2011 ;32:2999-3054)。
[0027] 根据冠状动脉造影结果，将有胸闷、胸痛症状的非急性也肌梗死患者分为；冠也病 368例和非冠也病88例。386例冠也病患者根据其胸痛典型性分为；稳定性也绞痛（SA)81 例，不稳定性也绞痛扣SA) 287例。其中稳定性也绞痛（SA)的定义为；仅有与体力活动相关 的缺血症状，无也电图动态改变，且cTnK0.0 化g/ml。不稳定性也绞痛定义为；无或较少体 力活动相关的缺血症状频繁发作，也电图动态改变有或无，且cTnKO.O化g/mL。根据携带冠 也病危险因素（老年、服胖、吸烟、过量饮酒、运动少、高血脂、高血压、糖尿病和家族史）的 数量，将88例非冠也病病人又分为16例健康个体（危险因素数量n< = 2)，和72例为高危 组（危险因素数量n〉3)。排除具有自身免疫病、急性或慢性感染、严重的肝、肾功能障碍、W 及其它恶性肿瘤病史的患者。对ACS病人和非ACS病人的检测数据，进行受试者操作特性 (R0C)曲线分析，研究miRNA是否可作为ACS的潜在诊断标志物。
[0028] 研究方案经中国医学科学院阜外也血管病医院伦理委员会通过，病患入选前均书 面签署知情同意书。
[0029] 各实施例中所用实验方法：
[0030] 血浆收集和储存
[0031] 用邸TA抗凝管在也脏导管室收集5ml病人外周血样本，用于检测miRNAs表达水 平。血样采集后4C保存，并在2小时内1500g离也15分钟，分离血浆和细胞层。血浆转移 到一个新的无RNA酶和DNA酶化pendod管中，4°C下2500g离也10分钟，去除细胞碎片。 上清血浆转移到新的无RNA酶和DNA酶化pendo计管中，-8(TC冻存。剔除发生溶血的样 本。
[0032] RNA 制备
[0033] 采用厂家推荐的方案用 TRIzol LS ReagentQnvitrogen，USA),从 500y L 血浆 中提取血浆总RNA。用20 y L无RNA酶水溶解纯化的总RNA,用NanoDrop2000 (NanoDrop Products, Wilmington, Del.，USA)进行 RNA 定量。
[0034] miRNA芯片和验证
[00；35]应用人 miRNA 表达谱芯片（Agilent miRNAs microarray Version 16. 0)检测 血浆miRNA表达谱。该芯片基于Sanger miRBase, release 16. 0设计，包含1205条人源 miRNAs和142条病毒来源miRNAs。每张芯片包含8个相同的微阵列，按照Agilent miRNA microarray system操作指南，WlOOng切3-标记的RNA进行杂交。芯片用Agilent Microarray 扫描仪（Cat#G2565BA, Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)扫描， Extraction software 10. 7 软件（Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA)提取数 据。原始数据应用 Gene Spring 软件 11. 0(Agilent technologies，Santa Clara，CA, USA), 分位数算法进行归一化。CY3单色杂交获得的原始信号，经稳定表达的内源对照miR-1228 矫正后，W 2为底进行对数转换。同一样本在同一微阵列中重复点的内变异系数在15% W 上，或阳性信号低于5%，结果就认为是不可靠的，排除后进一步分析。如果某一miRNA在任 一组（急性也肌梗死、健康对照、高危或稳定性也绞痛组）中超过50%的血浆样本中能阳性 检出，则认为该个miRNA是能够检出的。
[0036] 实时定量RT-PCR
[0037] 应用miRNA茎环法实时定量RT-PCR技术检测特定miRNA表达（ABI PRISM7900 s