一种制备光学纯二氟苯基环氧乙烷的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物催化技术领域，具体设及一种生物催化和化学反应结合的"一锅 两步法"制备手性化合物(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧。该化合物是药物替格瑞洛合成 的一种手性中间体。
【背景技术】
[0002] 替格瑞洛（ticagrelor)，商品名为Brilinta，是由阿斯利康制药公司 (AstraZeneca)研制开发的一种新型治疗急性冠状动脉综合征（acute coronary symlrome，ACS)的药物。该药物与P2Y12ADP受体可逆性结合，能有效改善ACS患者的症状，降 低死亡风险。
[0003] 目前有许多关于替格瑞洛的合成路线的报道，但绝大多数工艺均设及一种关键手 性中间体（lR，2S)-2-(3,4-二氣苯基)-1-环丙胺(化合物A)。专利CN 103508899详细总结了 该化合物合成的几种路线，其中WW02008018822报道的路线较为常用，运一路线的关键步 骤是合成（2S)-2-(3,4-二氣苯基）环氧乙烧（该化合物CAS号：1006376-63-l)。专利CN 103664697，CN 101495442也报道了化合物A及其类似物的合成方法，其路线的关键化合物 也是(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧。
[0004]
[0005] 已报道的（2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧都是W化学合成或者拆分得到。主要 有W下Ξ种路线:W02008018822报道的手性基团的引入是W手性催化剂(S)-二苯基脯氨醇 (S-DPPM)将幾基变成手性径基，再环氧化生成(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧(文献路线 1)。专利CN 103073525报道了 W3,4-二氣苯乙締为起始物的合成路线(文献路线2)。专利CN 103087011W2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬起始物，公开了一种水解动力学拆分路线(文献 路线3)。
[0006] 文献路线1:
[0007]
[000引文献路线2:
[0012] 相对于W上的化学方法，生物催化过程具有高度的化学、区域和立体选择性，反应 条件溫和，后处理容易，能耗较低，对环境友好，是当今化工生产和相关领域发展的一大潮 流。近年来研究者们积极探索各类化合物的生物催化技术，特别是手性中间体。利用生物催 化技术与化学方法结合，开发新的工艺合成(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧，实现简化工 艺、降低成本、减少污染的目标，从而可有效推动替格瑞洛合成工艺的进一步改进。同时作 为手性搁块，也为其他医药中间体合成提供备用资源。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的是提供一种生物催化和化学方法相结合的"一锅两步法"生产 (2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧，具体来说，包括W下步骤:第一步，利用幾基还原酶不对 称还原2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬得到（S)-2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙醇；第二步，在该 反应体系中加入强碱性物质，使（S)-2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙醇脱氯后环氧化，得到 (2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧。
[0014] 本发明的技术方案可用说明书【附图说明】，现详述如下：
[0015] (1)第一步：生物催化反应，是W幾基还原酶畑KR抓20作为生物催化剂，2-氯-1- (3,4-二氣苯基）乙酬为底物，经不对称幾基还原生成(S)-2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙醇。
[0016] 所述幾基还原酶ChKRED20,其序列在NCBI数据库中的登录号为KC342020。
[0017] 所述幾基还原酶ChKRED20的制备方法为该领域常规方法，具体方案见实施例1。
[0018] 本领域技术人员熟知，所述的催化条件可按本领域此类反应的常规条件进行选 择。反应体系为:憐酸钟缓冲液、幾基还原酶化KRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬、 还原型辅酶NADH(还原型辅酶I)或者NADPH(还原型辅酶Π )。
[0019] 或者，反应体系为:憐酸钟缓冲液、幾基还原酶化KRED20、底物2-氯-1-(3,4-二氣 苯基)乙酬、氧化型辅酶ΝΑ护(氧化型辅酶I)、异丙醇。
[0020]所述憐酸钟缓冲液，较佳的抑范围为pH 6.0~8.0;所述憐酸钟缓冲液浓度为0.05 ~0.5Md
[0021 ] 反应体系中幾基还原酶ChKRED20的较佳浓度为0.1~20g/l。
[0022] 反应体系中较佳的底物浓度为0.1~300g^。
[0023] 为达到本发明的最佳效果，还原型辅酶NADH或者NADPH的摩尔浓度大于等于反应 体系中底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基)乙酬的摩尔浓度。
[0024] 较佳的氧化型辅酶NA护的浓度为0.1~0.5g^。
[0025] 较佳的异丙醇浓度为5%~75% (异丙醇体积占总反应体系体积的百分比）。
[00%] 较佳的反应溫度为25~45°C。转速为50~20化pm。
[0027] 根据本领域的公共知识，本发明中还可W用幾基还原酶化KRED20重组菌休止细胞 或者粗酶液或者冻干粗酶粉或者固定化酶等形式作为生物催化剂，同样能达到本发明的 效果。W重组菌休止细胞作催化剂时，可用葡萄糖和/或异丙醇代替还原型辅酶(NADH或者 NADPH)用于辅酶循环。
[0028] 根据现有的公共知识，任何基因通过DNA突变技术可W改变其序列，获得突变体， 运些突变体所表达的蛋白质往往具有相同的功能。因此，幾基还原酶化KR抓20经等位基因 突变或者经添加、插入、缺失或/和取代一个或多个氨基酸且编码具有同等活性蛋白的氨基 酸序列，同样能作为生物催化剂转化2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬，生成(S)-2-氯-1-(3,4- 二氣苯基）乙醇。
[0029] (2)第二步:环氧化，在第一步反应结束后，在反应体系中直接加入强碱，使生物催 化获得的产物(S)-2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙醇进一步脱氯环氧化，生成(2S)-2-(3,4-二 氣苯基)环氧乙烧。
[0030] 所述的强碱为NaOH或者K0H。先将NaOH或者K0H配制成浓度为5%~20%(w/v)的水 溶液，缓慢地加入到反应体系中，并均匀揽拌，之后放置于摇床反应。反应溫度为30~50°C， 50~200巧m，时间1~化。
[0031] 为达到本发明的最佳效果，加入的化0H或者K0H的总摩尔数为反应体系中底物2- 氯-1-(3,4-二氣苯基)乙酬摩尔数的1~4倍。
[0032] 产物的萃取和检测：
[0033] 反应结束后，在反应体系中加入2~5倍体积的甲基叔下基酸萃取，将上层有机相 取出，W无水硫酸钢干燥，减压旋蒸，得到淡黄色液体，即为产物粗品。经硅胶柱进一步纯 化，得到(2S) -2- (3，4-二氣苯基)环氧乙烧产品。
[0034] 本发明的有益效果：
[0035] (1)本发明设计的"一锅两步法"路线，反应条件简单、溫和、高效、专一性强，无副 产物，获得的产物浓度高且易于提取分离。本发明投料浓度为150g/l，酶浓度为5g/l时，反 应2地，底物的转化率大于99%，获得的中间产物(S)-2-氯-1-(3，4-二氣苯基）乙醇的对映 体过量值(e. e值)大于99 %。随后进行第二步环氧化反应时，无需任何纯化，直接在反应体 系中加入强碱溶液便可W得到终产物。因此，该工艺简单，底物利用率高，最终反应体系中 产物为(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧(e.e值>99%)，无其他副产物生成，后续分离纯化 过程简便。
[0036] (2)可有效降低成本。该工艺的催化剂(幾基还原酶化KRED20)易于制备，用量少， 且W异丙醇为辅酶循环底物，只需加入廉价、少量的氧化型辅酶(NAD+，浓度〉O.lg/1即可） 便能实现高效辅酶循环。该工艺主要的成本是底物2-氯-1-(3,4-二氣苯基）乙酬的价格，目 前的市场价仅为每千克5000余元。由于化学合成工艺复杂，副产物较多，纯化困难等因素影 响，（2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧的价格高达每千克14万元。采用本发明工艺，将大大 降低(2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧的生产成本。
[0037] 除此之外，（2S)-2-(3,4-二氣苯基)环氧乙烧还可W作为手性搁块，用于多种下游 化合物合成，该化合物的成本的大幅度降低将推动相关下游产品的发展，具有良好的工业 应用前景。
【附图说明】
[0038] 图1为本发明的技术方案。
【具体实施方式】
[0039] W下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施例仅用于解释 本发明，而非对本发明范围的限制。
[0040] 实施例1生物催化剂幾基还原酶ChKRED20的制备
[0041 ] 幾基还原酶化KRED20(NCBI登录号:KC342020)重组菌的构建方法、异源表达、酶纯 化等为本领域常规方法。^金黄杆菌〔449(〇1